• 中国中文核心期刊
  • 中国科学引文数据库(CSCD)核心库来源期刊
  • 中国科技论文统计源期刊(CJCR)
  • 第二届国家期刊奖提名奖

留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

镉胁迫下构树qRT-PCR内参基因筛选及验证

李红英 陈萌笛 王政博 郝自远 刘龙昌 赵西平 倪建伟

引用本文:
Citation:

镉胁迫下构树qRT-PCR内参基因筛选及验证

    作者简介: 李红英,博士,讲师。主要研究方向:农林植物发育相关基因鉴定和调控机理研究。Email:lihy@haust.edu.cn.
    通讯作者: 倪建伟, njwcaf@163.com
  • 中图分类号: S718.46

Selection and Validation of Reference Genes of Broussonetia papyrifera for qRT- PCR under Cadmium Stress

    Corresponding author: NI Jian-wei, njwcaf@163.com
  • CLC number: S718.46

  • 摘要: 目的 筛选出镉(Cd)胁迫下构树中稳定表达的内参基因,为后续开展构树耐Cd的分子机理研究奠定基础。 方法 以Cd胁迫下构树的根和叶组织为材料,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测10个候选基因(BpUBE2、BpRPL8、BpActin、BpGAPDH、BpHSP、BpTUA、BpDOUB、Bpβ-TUB、BpHIS、BpNADH)的表达情况,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder分析软件对候选内参基因的表达稳定性进行综合评估,并通过逆境胁迫响应基因BpDREB验证筛选出的内参基因的稳定性。 结果 BpDOUBBpNADH在Cd胁迫下构树中基因表达相对稳定,BpGAPDH表达稳定性最差。以BpDREB验证内参稳定性时发现,单独或组合使用BpDOUBBpNADH为内参基因时,BpDREB基因表达水平显示出相似的趋势,而稳定性较差的BpGAPDH基因未能对BpDREB的表达量进行准确校正。 结论 BpDOUB、BpNADH基因以及BpDOUB + BpNADH基因组合均可作为合适的内参基因,提高Cd胁迫下构树相关基因表达分析的可靠性。
  • 图 1  构树Cd胁迫下叶片与根部总RNA电泳图

    Figure 1.  Electrophoresis of total RNA from leaves and roots under cadmium stress in B.papyrifera

    图 2  构树候选内参基因常规PCR产物琼脂糖凝胶电泳

    Figure 2.  Agarose gel electrophoresis of conventional PCR products of candidate reference genes of B.papyrifera

    图 3  构树10个候选内参基因溶解曲线图

    Figure 3.  Melting curves of the 10 candidate reference genes of B. papyrifera

    图 4  构树10个候选内参基因CT值箱线图

    Figure 4.  Box plot of the CT values of 10 candidate reference genes of B. papyrifera

    图 5  通过geNorm软件分析构树10个候选内参基因的平均表达稳定性(A)和最适数目(B)

    Figure 5.  Average expression stability (A) and optimum number (B) of 10 candidate reference genes of B. papyrifera analyzed by geNorm software

    图 6  NormFinder软件分析构树内参基因表达稳定性

    Figure 6.  Expression stability of the candidate reference genes of B. papyrifera calculated by NormFinder software

    图 7  BpDREB验证构树Cd胁迫下筛选的内参基因的稳定性

    Figure 7.  Validation of the stability of reference genes screened for cadmium stress in B.papyrifera with BpDREB

    表 1  构树10个候选内参基因的引物序列及扩增效率

    Table 1.  Primer sequences and amplification efficiency of 10 candidate reference genes in B.papyrifera

    基因名称
    Gene symbol
    引物序列(5'-3')
    Primer sequences (5’-3’)
    退火温度
    Tm/℃
    扩增产物长度
    Amplification
    Length/bp
    扩增效率
    Amplification
    Efficiency/%
    相关系数
    R2
    BpUBE2 BpUBE2-F: AGGTTCGCTTCCTCACCAAAA 52.4 154 102.81 0.995
    BpUBE2-R: TCATCAGGGTTTGGAGCACTC 54.4
    BpRPL8 BpRPL8-F: TGATCACCGACATCATCCACG 54.4 185 90.55 0.992
    BpRPL8-R: TCTGATCGGAAGGACATTGCC 54.4
    BpActin BpActin-F: TCCTCCTCAACTCTCCTCCTG  56.3 193 93.43 0.990
    BpActin-R: TTGCCCAGCTCTCCAAATGAT  52.4
    BpGAPDH BpGAPDH-F: CCATGGAAGGACTTGGGGATC 56.3 156 90.43 0.995
    BpGAPDH-R: GTTCACTCCCACCACGTATGT 54.4
    BpHSP BpHSP-F: CCAGCGCTGATGTTAGATTGC 54.4 174 92.66 0.993
    BpHSP-R: TTGCCATCAGAGCCTTTTCCT 52.4
    BpTUA BpTUA-F: TCGAAAGGCCAACATACACCA 52.4 175 96.59 0.997
    BpTUA-R: GAGATGACAGGGGCATACGAG 56.3
    BpDOUB BpDOUB-F: CCTGATCTTCGCCGGAAAACA 54.4 194 97.48 0.999
    BpDOUB-R:TGGAGAGGGTTGAAGAGAGCT 54.4
    Bpβ-TUB Bpβ-TUB-F: CGGAACTGACGCAACAAATGT 52.4 118 93.57 0.994
    Bpβ-TUB-R: ACCTCCTTCGTGCTCATCTTG 54.4
    BpHIS BpHIS-F: GTCTTGGAGCTGGCTGGTAAT 54.4 129 102.21 0.993
    BpHIS-R: ACCACCGGCTATTGTTCCTTT 52.4
    BpNADH BpNADH-F: TCCTTTGAATTCTCCGCCCAA 52.4 191 97.18 0.987
    BpNADH-R: GAAGCCCGTGAACTTGAAACC 54.4
    BpDREB BpDREB-F: TAAACCAGCTCACCCAATCCC 54.4 274 90.99 0.989
    BpDREB-R: CGGTTCTTGGGGAGTCTGATC 56.3
    下载: 导出CSV

    表 2  Bestkeeper软件分析构树内参基因的表达稳定性和排名

    Table 2.  Analysis of expression stability and ranking of candidate reference genes of B. papyrifera by BestKeeper software

    基因名
    Gene name
    变异系数
    CV
    标准偏差
    SD
    排名
    Rank
    BpNADH 1.19 0.32 1
    BpHIS 1.98 0.47 2
    BpUBE2 2.10 0.48 3
    BpDOUB 2.32 0.55 4
    BpActin 2.27 0.61 5
    BpHSP 2.59 0.67 6
    BpTUA 3.09 0.71 7
    Bpβ-TUB 3.54 0.93 8
    BpRPL8 4.00 0.95 9
    BpGAPDH 12.85 3.40 10
    下载: 导出CSV

    表 3  构树候选内参基因在RefFinder中的稳定性排名

    Table 3.  Rank of stability of candidate reference genes of B. papyrifera in RefFinder

    方法
    Method
    Cd胁迫下构树内参基因稳定性排序
    Ranking order under cdcl2 treatment in B. papyrifera (Better-Good-Average)
    12345678910
    BestKeeper BpNADH BpHIS BpUBE2 BpDOUB BpActin BpHSP BpTUA BpB-TUB BpRPL8 BpGAPDH
    Normfinder BpDOUB BpNADH BpActin BpHIS BpUBE2 BpTUA BpHSP BpB-TUB BpRPL8 BpGAPDH
    geNorm BpUBE2/BpDOUB BpNADH BpHIS BpActin BpTUA BpHSP BpRPL8 Bpβ-TUB BpGAPDH
    推荐综合排名
    Recommended
    comprehensive ranking
    BpDOUB BpNADH BpUBE2 BpHIS BpActin BpTUA BpHSP Bpβ-TUB BpRPL8 BpGAPDH
    下载: 导出CSV
  • [1]

    YALLEY M K, ADUSU D, BUNYAMIN A R, et al. Natural regeneration of indigenous tree species in Broussonetia papyrifera invaded sites in pra-anum forest reserve[J]. International Journal of Forestry Research, 2020, 2020: 6347962.
    [2]

    JIAO P, CHAO Y L, WEN H Z, et al. Integrative metabolome and transcriptome analysis of flavonoid biosynthesis genes in Broussonetia papyrifera leaves from the perspective of sex differentiation[J]. Frontiers in Plant Science, 2022, 13: 900030. doi: 10.3389/fpls.2022.900030
    [3]

    FENG J, DONG P, LI R M, et al. Effects of wood fiber properties on mold resistance of wood polypropylene composites[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2019, 140: 152-159.
    [4]

    GUO F J, FENG L, HUANG C, et al. Prenylflavone derivatives from Broussonetia papyrifera, inhibit the growth of breast cancer cells in vitro and in vivo[J]. Phytochemistry Letters, 2013, 6(3): 331-336. doi: 10.1016/j.phytol.2013.03.017
    [5]

    PARK J Y, YUK H J, RYU H W, et al. Evaluation of polyphenols from Broussonetia papyrifera as coronavirus protease inhibitors[J]. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 2017, 32(1): 504-515. doi: 10.1080/14756366.2016.1265519
    [6] 刘 洋. 组织培养条件下构树对重金属镉和锰的耐受性研究[D]. 长沙: 中南林业科技大学, 2021: 42-46.

    [7]

    ZENG P, GUO Z H, XIAO X Y, et al. Tolerance capacities of Broussonetia papyrifera to heavy metal(loid)s and its phytoremediation potential of the contaminated soil[J]. International Journal of Phytoremediation, 2022, 24(6): 580-589.
    [8]

    XU Z G, DONG M, PENG X Y, et al. New insight into the molecular basis of cadmium stress responses of wild paper mulberry plant by transcriptome analysis[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2019, 171(APR.): 301-312.
    [9]

    LI C,XU J, DENG Y, et al. Selection of reference genes for normalization of cranberry (Vaccinium macrocarpon Ait. ) gene expression under different experimental conditions[J]. PLoS ONE, 2019, 14(11): e0224798. doi: 10.1371/journal.pone.0224798
    [10]

    XIAO F, ZHENG Y F, CHEN J L, et al. Selection and validation of reference genes in all-red Amaranth ( Amaranthus tricolor L.) seedlings under different culture conditions[J]. Journal of Horticultural Science and Biotechnology, 2021, 96(5): 1-10.
    [11] 胡宁宁, 郭慧琴, 李西良, 等. 羊草不同组织实时定量PCR 内参基因的筛选[J]. 草业科学, 2017, 34(7):1434-1441.

    [12] 齐香玉, 陈双双, 冯 景, 等. 茉莉花实时荧光定量PCR内参基因的筛选与验证[J]. 华北农学报, 2020, 35(6):22-30.

    [13] 华雅洁, 岳远征, 杨秀莲, 等. 海州常山叶片实时荧光定量PCR的内参基因选择[J]. 林业科学研究, 2022, 35(2):194-202.

    [14]

    SHAKEEL M, RODRIGUEZ A, TAHIR U B, et al. Gene expression studies of reference genes for quantitative real-time PCR: an overview in insects[J]. Biotechnology Letters, 2018, 40(2): 227-236. doi: 10.1007/s10529-017-2465-4
    [15]

    VANDESOMPELE J, PRETER K D, PATTYN F, et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J]. Genome Biology, 2002, 3(7): RESEARCH0034.
    [16]

    ANDERSEN C L, JENSEN J L, RNTOFT T F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets[J]. American Association for Cancer Research, 2004, 64(15): 5245-5250.
    [17]

    PFAFFL M W, TICHOPAD A, PRGOMET C, et al. Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper-Excel-based tool using pair-wise correlations[J]. Biotechnology Letters, 2004, 26(6): 509-515. doi: 10.1023/B:BILE.0000019559.84305.47
    [18]

    CHEN W R, FENG Y, CHAO Y E. Genomic analysis and expression pattern of OsZIP1, OsZIP3, and OsZIP4 in two rice (Oryza sativa L. ) genotypes with different zinc efficiency[J]. Russian Journal of Plant Physiology, 2008, 55(3): 400-409. doi: 10.1134/S1021443708030175
    [19]

    LI X S, LIANG Y Q, GAO B, et al. ScDREB10, an A-5c type of DREB gene of the desert moss Syntrichia caninervis, confers ssmotic and salt tolerances to Arabidopsis[J]. Genes, 2019, 10(2): 146.
    [20] 朱灵英, 王一博, 王宝婕, 等. 越南参变种实时荧光定量PCR内参基因的筛选和验证[J]. 植物生理学报, 2020, 56(2):327-335.

    [21] 李铁铮, 王金玲, 刘 晓, 等. 管花肉苁蓉实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择和验证[J]. 植物生理学报, 2021, 57(4):969-981.

    [22] 杨 坤, 黄 超, 卢 山, 等. 铜胁迫下紫鸭跖草根组织实时定量PCR内参基因的选择[J]. 植物生理学报, 2021, 57(1):195-204.

    [23]

    ZHU L F, YANG C Q, YOU Y H, et al. Validation of reference genes for qRT-PCR analysis in peel and flesh of six apple cultivars (Malus domestica) at diverse stages of fruit development[J]. Scientia Horticulturae, 2019, 244: 165-171. doi: 10.1016/j.scienta.2018.09.033
    [24] 何 毅, 张 欣, 谢牧洪, 等. 构树BpbHLH149转录因子转录酵母的Cd胁迫响应功能[J]. 东北林业大学学报, 2022, 50(6):21-26. doi: 10.13759/j.cnki.dlxb.2022.06.007

    [25] 陈思思, 谢牧洪, 崔茂凯, 等. 构树转录因子BpbZIP1的鉴定及镉胁迫响应分析[J]. 植物研究, 2022, 42(3):394-402.

    [26]

    PENG X J, LIU H, CHEN P L, et al. A Chromosome-Scale genome assembly of paper mulberry (Broussonetia papyrifera) provides new insights into its forage and papermaking usage[J]. Molecular Plant, 2019, 12(5): 661-677. doi: 10.1016/j.molp.2019.01.021
    [27] 张 颖, 陈婉婷, 陈冉红, 等. 杉木实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择[J]. 林业科学研究, 2019, 32(2):65-72.

    [28] 杨英英, 赵林姣, 杨桂娟, 等. ‘麦缘锦楸’叶色表型qRT-PCR内参基因筛选及验证[J]. 林业科学研究, 2022, 35(1):123-131.

    [29] 周成城, 荣俊冬, 谢德金, 等. 福建柏实时荧光定量PCR内参基因的选择[J]. 林业科学研究, 2021, 34(1):137-145.

    [30] 丁 戈, 黄 杨, 陈伦林, 等. 基于转录组测序的铝胁迫下甘蓝型油菜新内参基因的发掘与引物开发[J]. 华北农学报, 2021, 36(1):1-9. doi: 10.7668/hbnxb.20191565

    [31] 储文渊, 王玉娇, 朱东悦, 等. 盐和干旱胁迫下杨树新内参基因的筛选[J]. 林业科学, 2017, 53(10):70-79. doi: 10.11707/j.1001-7488.20171008

    [32] 段国敏, 李田园, 田 敏, 等. 扇脉杓兰实时荧光定量PCR内参基因的筛选[J]. 核农学报, 2021, 35(3):576-585. doi: 10.11869/j.issn.100-8551.2021.03.0576

    [33]

    KIM Y H, YANG K S, RYU S H, et al. Molecular characterization of a cDNA encoding DRE-binding transcription factor from dehydration-treated fibrous roots of sweetpotato[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2008, 46(2): 196-204. doi: 10.1016/j.plaphy.2007.09.012
    [34] 冯德明, 温佩颖, 赵 畅, 等. 刚毛柽柳ThDREB基因在酵母中的表达及抗逆能力分析[J]. 植物研究, 2017, 37(1):63-68. doi: 10.7525/j.issn.1673-5102.2017.01.009

  • [1] 周成城荣俊冬谢德金杨德明何天友郑郁善 . 福建柏实时荧光定量PCR内参基因的选择. 林业科学研究, 2021, 34(1): 137-145. doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2021.01.017
    [2] 华雅洁岳远征杨秀莲何卿 . 海州常山叶片实时荧光定量PCR的内参基因选择. 林业科学研究, 2022, 35(2): 194-202. doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2022.02.023
    [3] 郭晓娟陈凌娜杨汉奇 . 巨龙竹秆形发育过程实时荧光定量PCR内参基因的筛选. 林业科学研究, 2018, 31(2): 120-125. doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2018.02.017
    [4] 张颖陈婉婷陈冉红帅鹏李明 . 杉木实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择. 林业科学研究, 2019, 32(2): 65-72. doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2019.02.010
    [5] . NaCl胁迫对构树幼苗叶片水势、光合作用及Na^+、K^+吸收和分配的影响. 林业科学研究, 2009, 22(3): -.
    [6] 杨英英赵林姣杨桂娟张玉付鹏跃胡继文刘莹王楠 . ‘麦缘锦楸’叶色表型qRT-PCR内参基因筛选及验证. 林业科学研究, 2022, 35(1): 123-131. doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2022.01.014
    [7] 金顺玉卢孟柱高 健 . 毛竹木质素合成相关基因C4H的克隆及组织表达分析. 林业科学研究, 2010, 23(3): 319-325.
    [8] 廖声熙崔凯张鹏王海英崔永忠袁首乾 . 构树ISSR反应体系的优化与建立. 林业科学研究, 2013, 26(1): 76-80.
    [9] 廖声熙崔凯周敏何承忠杨文云李昆 . 云南河谷构树的遗传多样性研究. 林业科学研究, 2013, 26(5): 588-592.
    [10] 李麟坤梁重钧宁楚龙张薇姜国维张鑫王利兵 . 文冠果种子发育基因表达分析内参基因的选择. 林业科学研究, 2024, 37(2): 1-7. doi: 10.12403/j.1001-1498.20230291
    [11] 梁成杰李国宏李广武高瑞桐赵忠懿孙金钟 . 诱饵树施内吸和菊酯类农药防治两种天牛成虫的研究. 林业科学研究, 1997, 10(2): 189-193.
    [12] 宋会兴钟章成 . 接种幼套球囊霉对干旱生境中构树幼苗根系形态的影响. 林业科学研究, 2007, 20(1): 79-83.
    [13] 王楠胡宝全王春国宋文芹陈成彬 . 黑杨三倍体与二倍体叶片中miRNA表达差异研究. 林业科学研究, 2013, 26(S1): 33-38.
    [14] 孙涛王雪庆赵遵岭于淑慧陈晓鸣刘魏魏亓倩杨璞 . 白蜡虫热激蛋白序列分析. 林业科学研究, 2016, 29(5): 778-783.
    [15] 吴涛李万峰张俊红韩素英杨文华齐力旺 . 落叶松实时定量PCR内参基因的筛选. 林业科学研究, 2013, 26(S1): 1-8.
    [16] 张恺恺吕星杨立莹陈段芬邱德有杨艳芳 . 红豆杉TbAP2基因荧光定量PCR体系的建立及优化. 林业科学研究, 2019, 32(1): 39-46. doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2019.01.006
    [17] 黄星瑞杨洁邹洁文玺胡传豪张佑祥黄兴龙 . 杜仲梦尼夜蛾CD36家族同源基因克隆与组织分布研究. 林业科学研究, 2023, 36(5): 72-82. doi: 10.12403/j.1001-1498.20220608
    [18] 彭松郑勇奇马淼张川红杜小娟李涛倪延生 . 高温胁迫下花楸树幼苗的生理响应. 林业科学研究, 2011, 24(5): 602-608.
    [19] 施征史胜青肖文发齐力旺 . 脱水胁迫对梭梭和胡杨苗叶绿素荧光特性的影响. 林业科学研究, 2008, 21(4): 566-570.
    [20] . 盐胁迫对桑树幼苗光合生理及叶绿素荧光特性的影响. 林业科学研究, 2009, 22(2): -.
  • 加载中
图(7) / 表(3)
计量
  • 文章访问数:  3359
  • HTML全文浏览量:  1389
  • PDF下载量:  48
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2022-10-25
  • 录用日期:  2023-03-17
  • 网络出版日期:  2023-03-30
  • 刊出日期:  2023-08-20

镉胁迫下构树qRT-PCR内参基因筛选及验证

    通讯作者: 倪建伟, njwcaf@163.com
    作者简介: 李红英,博士,讲师。主要研究方向:农林植物发育相关基因鉴定和调控机理研究。Email:lihy@haust.edu.cn
  • 1. 河南科技大学园艺与植物保护学院,河南 洛阳 471000
  • 2. 国家林业和草原局国家公园(自然保护地)发展中心,北京 100714

摘要:  目的 筛选出镉(Cd)胁迫下构树中稳定表达的内参基因,为后续开展构树耐Cd的分子机理研究奠定基础。 方法 以Cd胁迫下构树的根和叶组织为材料,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测10个候选基因(BpUBE2、BpRPL8、BpActin、BpGAPDH、BpHSP、BpTUA、BpDOUB、Bpβ-TUB、BpHIS、BpNADH)的表达情况,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder分析软件对候选内参基因的表达稳定性进行综合评估,并通过逆境胁迫响应基因BpDREB验证筛选出的内参基因的稳定性。 结果 BpDOUBBpNADH在Cd胁迫下构树中基因表达相对稳定,BpGAPDH表达稳定性最差。以BpDREB验证内参稳定性时发现,单独或组合使用BpDOUBBpNADH为内参基因时,BpDREB基因表达水平显示出相似的趋势,而稳定性较差的BpGAPDH基因未能对BpDREB的表达量进行准确校正。 结论 BpDOUB、BpNADH基因以及BpDOUB + BpNADH基因组合均可作为合适的内参基因,提高Cd胁迫下构树相关基因表达分析的可靠性。

English Abstract

  • 构树(Broussonetia papyrifera(L.)Vent.)为桑科(Moraceae)构属(Broussonetia)落叶乔木,自然分布于我国大部分地区和东南亚,是一种典型的乡土树种和先锋植物。其表型性状和遗传多样性丰富,基因组紧凑,常作为木本植物研究的模式材料。因其易繁殖、抗逆性强、生长速度快等优点[1],被广泛应用于饲料、造纸和植被恢复等领域。此外,构树还具有药用价值,其类黄酮、多酚、果糖等含量远高于其它植物[2-3],构树中的黄酮衍生物对癌细胞有抑制作用[4],多酚类物质可以抑制冠状病毒蛋白酶[5]。近年来,有研究证明,构树对重金属Cd有一定的富集和转运能力[6],因此,被认为是重金属污染区群落恢复的先锋树种[7],其主要通过诱导或增强相关Cd抗性基因表达,合成功能性基因来应对Cd胁迫[8]。因此,了解关键基因的表达方式将有助于阐明构树Cd胁迫中所涉及的分子机制。

    实时荧光定量PCR(qRT- PCR)因其方便快捷、强特异性和高灵敏度等优势,已成为研究基因转录水平表达量的有效手段。然而,RNA质量、cDNA质量、样品稀释倍数以及实验操作准确度等因素都会影响qRT-PCR的准确性[9],因此,引入适宜的内参基因,对目的基因表达量标准化分析至关重要[10]。理想的内参基因是能够在细胞中稳定表达、表达量几乎不受外界环境干扰的基因,一般为维持细胞基本生命活动的管家基因(Housekeeper gene),如肌动蛋白基因(Actin)、18S核糖体RNA(18S Ribosome RNA)、微管蛋白基因(Tublin)和泛素蛋白基因(Ubiquitin)等;但近年来大量研究证明,随着物种以及组织器官的差异,管家基因的转录水平有可能会发生变化,如在羊草(Leymus chinensis(Trin.)Tzvel.)叶片、茎部以及穗中表达稳定性较高的内参基因分别是Actin、EF-1α18S rRNA,而根部表达较为稳定的是APRT18S rRNA [11]。茉莉花(Jasminum sambac(L.)Aiton.)在不同的发育时期以及不同组织中筛选出的最适内参基因也不同[12]。此外,同一植物在不同的环境下内参基因稳定性之间也存在差异,如海州常山(Clerodendrum trichotomum Thunb.)内参基因RPL、AP-2基因在盐胁迫下表达最稳定,干旱胁迫下MDH、AP-2基因表达最稳定,而热胁迫下UBCE2ACT表达最稳定[13]。这说明管家基因只能在特定的组织或处理方式中保持相对稳定,因此,应根据特定的试验条件来选择适合的内参基因,减少试验误差[14]

    本研究以Cd胁迫下构树的根和叶为试验材料,根据构树转录组数据选取了10个候选内参基因,并通过qRT-PCR技术, 结合基因稳定性分析软件geNorm[15]、NormFinder[16]、BestKeeper[17]和RefFinder[18]在线分析工具,对10个候选内参基因在构树Cd胁迫下根和叶片中的表达稳定性进行评估,筛选出表达相对稳定的内参基因,并利用构树逆境胁迫关键基因BpDREB[19]进一步验证上述结果的可靠性,为后续开展构树Cd胁迫响应基因的功能研究奠定基础。

    • 构树种子购自江苏宿迁天桥区映阳苗木经营部,将种子用1 600 mg·L−1的GA3溶液浸泡24 h,蒸馏水冲洗2~3次后播种于草炭土和蛭石混合基质中,置于光照培养箱中(温度30 ℃,湿度60%,光照12 h/黑暗12 h)培养。培养6个月后,选取长势良好、大小一致的构树幼苗,参照Xu等[7]实验设计并稍作调整,将幼苗小心剥离营养基质后置于1/2霍格兰营养液中缓苗1周,每3 d更换1次,之后加入400 μmol·L−1 CdCl2进行模拟Cd胁迫处理,分别在处理后0(CK)、3、6、12、24、48、72、96、120 h取其根部与叶片,液氮速冻后放置于−80 ℃保存,每个取样时间点均取3个重复。

    • 利用Trizol法(北京聚合美,MF034)提取RNA,用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,使用超微量紫外分光光度计(NanoDrop2000)检测RNA浓度和纯度。利用M5 Super qPCR RT Kit(北京聚合美,MF012)完成cDNA第一链合成,置于−20 ℃保存备用。

    • 根据构树转录组序列,对选定的10个候选内参基因BpUBE2、BpRPL8、BpActin、BpGAPDH、BpHSP、BpTUA、BpDOUB、Bpβ-TUB、BpHIS、BpNADH使用Primer3web(V4.1.0, http://primer3.ut.ee/)设计引物,并利用Blast工具检测引物特异性。引物序列、扩增产物长度和Tm值等详见表1,引物由通用生物(安徽)股份有限公司合成。

      表 1  构树10个候选内参基因的引物序列及扩增效率

      Table 1.  Primer sequences and amplification efficiency of 10 candidate reference genes in B.papyrifera

      基因名称
      Gene symbol
      引物序列(5'-3')
      Primer sequences (5’-3’)
      退火温度
      Tm/℃
      扩增产物长度
      Amplification
      Length/bp
      扩增效率
      Amplification
      Efficiency/%
      相关系数
      R2
      BpUBE2 BpUBE2-F: AGGTTCGCTTCCTCACCAAAA 52.4 154 102.81 0.995
      BpUBE2-R: TCATCAGGGTTTGGAGCACTC 54.4
      BpRPL8 BpRPL8-F: TGATCACCGACATCATCCACG 54.4 185 90.55 0.992
      BpRPL8-R: TCTGATCGGAAGGACATTGCC 54.4
      BpActin BpActin-F: TCCTCCTCAACTCTCCTCCTG  56.3 193 93.43 0.990
      BpActin-R: TTGCCCAGCTCTCCAAATGAT  52.4
      BpGAPDH BpGAPDH-F: CCATGGAAGGACTTGGGGATC 56.3 156 90.43 0.995
      BpGAPDH-R: GTTCACTCCCACCACGTATGT 54.4
      BpHSP BpHSP-F: CCAGCGCTGATGTTAGATTGC 54.4 174 92.66 0.993
      BpHSP-R: TTGCCATCAGAGCCTTTTCCT 52.4
      BpTUA BpTUA-F: TCGAAAGGCCAACATACACCA 52.4 175 96.59 0.997
      BpTUA-R: GAGATGACAGGGGCATACGAG 56.3
      BpDOUB BpDOUB-F: CCTGATCTTCGCCGGAAAACA 54.4 194 97.48 0.999
      BpDOUB-R:TGGAGAGGGTTGAAGAGAGCT 54.4
      Bpβ-TUB Bpβ-TUB-F: CGGAACTGACGCAACAAATGT 52.4 118 93.57 0.994
      Bpβ-TUB-R: ACCTCCTTCGTGCTCATCTTG 54.4
      BpHIS BpHIS-F: GTCTTGGAGCTGGCTGGTAAT 54.4 129 102.21 0.993
      BpHIS-R: ACCACCGGCTATTGTTCCTTT 52.4
      BpNADH BpNADH-F: TCCTTTGAATTCTCCGCCCAA 52.4 191 97.18 0.987
      BpNADH-R: GAAGCCCGTGAACTTGAAACC 54.4
      BpDREB BpDREB-F: TAAACCAGCTCACCCAATCCC 54.4 274 90.99 0.989
      BpDREB-R: CGGTTCTTGGGGAGTCTGATC 56.3
    • qRT-PCR采用SYBR Green染料法,按照2 × M5 HiPer SYBR Premix EsTaq试剂盒(北京聚合美,MF787)说明书配制PCR反应体系为:cDNA模板1 μL,正反向引物(10 μmol·L−1)各0.2 μL,2 × M5 HiPer SYBR Premix EsTaq 5 μL,用ddH2O补至10 μL。每个样品均设置3个重复,利用伯乐公司的CFX96实时荧光定量 PCR仪对样品进行扩增。PCR反应程序:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s,60 ℃ 退火30 s,39个循环,熔解曲线:以65 ℃到95 ℃,每个循环增加0.5 ℃,持续0.05 s获得解链温度,采集荧光信号。

    • 将cDNA样本等量混合后用ddH2O稀释1倍作为模板进行普通PCR扩增,用于检测引物的特异性。反应体系为:14.3 μL ddH2O,2 μL 10 × PCR Buffer,1.6 μL dNTP(2.5 mmol·L−1),0.1 μL rTaq(5 U·μL−1),cDNA 1.5 μL,上下游引物(10 μmol·L−1)各0.25 μL。反应程序为95 ℃ 2 min;98 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30个循环,72 ℃ 5 min,反应结束后用2%的琼脂糖凝胶进行引物特异性检测。

      将Cd胁迫下所有样本的cDNA取适量等量混合后稀释成 6个梯度(1/3、1/9、1/27、1/81、1/243、1/729),并以此为模板进行qPCR扩增,用于标准曲线的绘制,并利用公式 E=(3−1/slope−1)×100%计算引物扩增效率。反应体系和程序如1.2.3所述。

    • 通过荧光定量PCR得出10个候选基因在Cd胁迫下构树不同组织中的CT值,使用Microsoft Excel 2016软件整理原始CT值,并分别采用基于Microsoft Excel 2010的3个基因稳定性评价软件(geNorm、NormFinder、BestKeeper)和在线分析工具 RefFinder(https://blooge.cn/RefFinder/)对10个候选内参基因的稳定性进行综合评价,筛选出构树在Cd胁迫下的最佳内参基因。

    • 选择构树逆境胁迫响应基因BpDREB用于验证筛选出的内参基因的稳定性。以Cd胁迫下构树的cDNA为模板,使用荧光定量PCR技术,以最佳候选基因及其组合作为标准化因子,以不稳定的内参基因作为比较,使用2−△△CT 法分析BpDREB基因在构树根部和叶片中的相对表达量,实验设置3个重复,反应体系和程序如1.2.3所述。

    • RNA样品浓度为160~287 ng·μL−1A260/280的值为2.0~2.2,这表明RNA无蛋白或酚类污染,纯度较高。琼脂糖凝胶电泳结果(图1)显示:各样本的RNA主带清晰,无弥散拖尾现象,且28S rRNA条带的亮度约为18S rRNA条带的2倍,这表明RNA无明显降解,完整性良好,可用于后续实验。

      图  1  构树Cd胁迫下叶片与根部总RNA电泳图

      Figure 1.  Electrophoresis of total RNA from leaves and roots under cadmium stress in B.papyrifera

    • 以Cd胁迫下构树根和叶等量混合的cDNA为模板进行常规PCR扩增,结果(图2)表明:所有引物目标片段单一明亮,无引物二聚体及非特异性扩增现象,且条带大小与预期相符。进一步利用qRT-PCR技术验证引物特异性,结果(图3)表明:各候选内参基因的溶解曲线均呈单一溶解峰,说明所用引物都能进行特异性扩增。经计算,各候选内参基因扩增效率(E)为90.43%~102.81%,相关系数(R2)为0.987~0.999(表1)。以上结果表明,各候选基因特异性和扩增效率良好,可用于后续实验。

      图  2  构树候选内参基因常规PCR产物琼脂糖凝胶电泳

      Figure 2.  Agarose gel electrophoresis of conventional PCR products of candidate reference genes of B.papyrifera

      图  3  构树10个候选内参基因溶解曲线图

      Figure 3.  Melting curves of the 10 candidate reference genes of B. papyrifera

    • CT值与基因表达量呈反比,CT值越低基因表达水平越高。通过对箱线图(图4)进行分析可知:大部分基因CT值分布在21~28之间,表达丰度适中。此外,由箱线图跨度可初步判定BpGAPDH(21.59~32.58)的CT值跨度广,基因表达稳定性较弱,而BpNADH(25.86~27.36))、BpDOUB(23.09~25.12)、BpUBE2(21.78~23.67)的CT值跨度小,基因表达较稳定。以上结果表明,构树中不同内参基因在Cd胁迫下具有不同的表达水平,从CT值变化跨度推测BpNADH、BpDOUBBpUBE2表达量较稳定,是潜在的最佳候选内参基因。

      图  4  构树10个候选内参基因CT值箱线图

      Figure 4.  Box plot of the CT values of 10 candidate reference genes of B. papyrifera

    • 通过geNorm软件计算各候选内参基因在构树Cd胁迫下不同组织中表达稳定性的M值,该软件是以 M=1.5为临界值,M值越小,则内参基因的稳定性越高[20]。geNorm分析结果(图5A)表明:在Cd胁迫下构树各候选内参基因M值均低于1.5,即各候选内参基因表达都相对稳定,稳定性排序从高到低依次为BpDOUB(0.35)=BpUBE2(0.35)>BpNADH(0.399)>BpHIS(0.443)>BpActin(0.501)>BpTUA(0.535)>BpHSP(0.567)>BpRPL8(0.666)>Bpβ-TUB(0.776)>BpGAPDH(1.416)。

      图  5  通过geNorm软件分析构树10个候选内参基因的平均表达稳定性(A)和最适数目(B)

      Figure 5.  Average expression stability (A) and optimum number (B) of 10 candidate reference genes of B. papyrifera analyzed by geNorm software

      为确定内参基因的最佳数量,使用配对变异系数 Vn /(n + 1)对10个候选内参基因进行分析,Vn /(n + 1)的临界值为0.15,当Vn /(n + 1) <0.15时,说明选择n个基因作为内参基因即可保证结果稳定可靠。由图5B可知:本实验所有样品的V2/3<0.15,说明在Cd胁迫下选择2个基因作为内参基因,结果稳定可靠,无需选择更多基因。

    • NormFinder软件是根据表达稳定值(S值)对基因的稳定性进行排序,S值越小基因表达越稳定[21]。NormFinder分析结果(图6)表明:在Cd胁迫下,构树的根,叶组织中,10个候选内参基因表达稳定性排名从高到低依次为:BpDOUB(0.175)>BpNADH(0.208)>BpActin(0.214)>BpHIS(0.287)>BpUBE2(0.324)>BpTUA(0.328)>BpHSP(0.740)>Bpβ-TUB(0.815)>BpRPL8(1.246)>BpGAPDH(3.947),即在Cd胁迫下构树中BpDOUB(0.175)和BpNADH(0.208)表达稳定性较高,而BpGAPDH(3.947)的稳定性最低,不适合作为内参基因使用。

      图  6  NormFinder软件分析构树内参基因表达稳定性

      Figure 6.  Expression stability of the candidate reference genes of B. papyrifera calculated by NormFinder software

    • Bestkeeper 主要是通过比较各候选内参基因CT值之间的标准偏差(SD)和变异系数(CV)来评价基因的稳定性[22]。当SD值<1.0时,即认为该基因表达相对稳定。Bestkeeper的分析结果(表2)表明:BpGAPDH(3.40)>1.0,不适合作为内参基因,其余9个候选基因的SD值均<1.0,说明大多数候选内参基因表达较稳定,候选内参基因表达稳定性排序从高到低依次为:BpNADH(0.32)>BpHIS(0.47)>BpUBE2(0.48)>BpDOUB(0.55)>BpActin(0.61)>BpHSP(0.67)>BpTUA(0.71)>Bpβ-TUB(0.93)>BpRPL8(0.95)>BpGAPDH(3.40),其中,BpNADH的SD和CV值最小(SD=0.32,CV=1.19),稳定性最好。

      表 2  Bestkeeper软件分析构树内参基因的表达稳定性和排名

      Table 2.  Analysis of expression stability and ranking of candidate reference genes of B. papyrifera by BestKeeper software

      基因名
      Gene name
      变异系数
      CV
      标准偏差
      SD
      排名
      Rank
      BpNADH 1.19 0.32 1
      BpHIS 1.98 0.47 2
      BpUBE2 2.10 0.48 3
      BpDOUB 2.32 0.55 4
      BpActin 2.27 0.61 5
      BpHSP 2.59 0.67 6
      BpTUA 3.09 0.71 7
      Bpβ-TUB 3.54 0.93 8
      BpRPL8 4.00 0.95 9
      BpGAPDH 12.85 3.40 10
    • 为避免单一内参基因评价程序引起结果误差,通过在线分析工具RefFinder对3个软件的基因表达稳定性排序进行几何平均值计算,几何平均值越小,基因的表达稳定性越高。结果(表3)所示,各基因综合稳定性排序从高到低依次为BpDOUB(1.41)>BpNADH(2.34)>BpUBE2(2.59)>BpHIS(2.83)>BpActin(4.16)>BpTUA(6.24)>BpHSP(6.74)>Bpβ-TUB(8.24)> BpRPL8(8.74)>BpGAPDH(10.00)。说明BpDOUB(1.41)和BpNADH(2.34)表达稳定性优于其它基因,可作为Cd胁迫下构树qRT-PCR分析首选内参基因,而BpGAPDH(10.00)基因表达最不稳定,不宜作为Cd胁迫下构树的内参基因。

      表 3  构树候选内参基因在RefFinder中的稳定性排名

      Table 3.  Rank of stability of candidate reference genes of B. papyrifera in RefFinder

      方法
      Method
      Cd胁迫下构树内参基因稳定性排序
      Ranking order under cdcl2 treatment in B. papyrifera (Better-Good-Average)
      12345678910
      BestKeeper BpNADH BpHIS BpUBE2 BpDOUB BpActin BpHSP BpTUA BpB-TUB BpRPL8 BpGAPDH
      Normfinder BpDOUB BpNADH BpActin BpHIS BpUBE2 BpTUA BpHSP BpB-TUB BpRPL8 BpGAPDH
      geNorm BpUBE2/BpDOUB BpNADH BpHIS BpActin BpTUA BpHSP BpRPL8 Bpβ-TUB BpGAPDH
      推荐综合排名
      Recommended
      comprehensive ranking
      BpDOUB BpNADH BpUBE2 BpHIS BpActin BpTUA BpHSP Bpβ-TUB BpRPL8 BpGAPDH
    • 为验证筛选出的内参基因可靠性,采用qRT-PCR技术对Cd胁迫下BpDREB基因在构树叶片以及根部的表达模式进行研究,使用筛选出的最佳内参基因BpDOUB、BpNADH及其组合BpDOUB + BpNADH作为标准化因子,以最不稳定的内参基因BpGAPDH为参照,对BpDREB基因表达水平进行验证。结果(图7)表明:使用不同的内参基因得到的BpDREB表达量之间存在较大差异。分别以稳定性好的BpDOUB、BpNADH以及BpDOUB + BpNADH作为内参基因时,BpDREB基因的表达模式一致。总体来看,在Cd处理下,构树叶片及根部的BpDREB 表达量均呈上调趋势,叶片中BpDREB的表达量在96 h达到最高点,根部72 h达到最高点;而用最不稳定的内参基因BpGAPDH为参照时,会导致完全不同的结果。因此,不合适的内参基因会导致目的基因表达水平偏差,影响实验的准确性,进一步验证了以BpDOUBBpNADH作为内参基因的可靠性。

      图  7  用BpDREB验证构树Cd胁迫下筛选的内参基因的稳定性

      Figure 7.  Validation of the stability of reference genes screened for cadmium stress in B.papyrifera with BpDREB

    • 土壤重金属污染已成为目前亟待解决的环境问题之一,Cd是最具威胁的重金属元素,对植物生长和人体健康都造成严重威胁。作为重金属区群落恢复的先锋树种,构树对重金属Cd具有极高的富集能力[6],研究构树抗逆机制,解析其响应Cd的基因表达调控网络,挖掘构树相关抗逆基因,有助于阐明构树Cd胁迫适应机制。实时荧光定量PCR是分析基因表达水平和调控模式的主要手段之一,选择表达稳定的内参基因是准确分析目的基因表达量的前提,以往研究结果表明,内参基因不具有绝对通用性,若不经筛选而以常见管家基因为内参基因,得到的结果精确度大幅度降低,甚至得到错误结果[23]。以往构树基因表达研究常直接以Actin[24-25]为内参,可能存在一定误差。近年来,随着构树基因组测序的完成[26]和构树转录调控水平研究的深入,开展构树内参基因筛选能够为后续功能基因的表达分析提供重要的基础。

      在非模式植物中,结合植物转录组数据库进行内参基因筛选是有效的方法之一,目前已在杉木(Cunninghamia lanceolata(Lamb.)Hook.)[27]、麦缘锦楸(Catalpa fargesii Bur.)[28]、福建柏(Fokienia hodginsii(Dunn)Henry et Thomas.)[29]等多种植物中应用。有研究发现,在甘蓝型油菜(Brassica napus L.)转录组数据库挖掘到的内参基因UXS3、SAP5、ARFA1E的表达稳定性优于传统内参基因Actin7[30]。本研究结合构树转录组数据库,初步选择10个常见管家基因作为候选内参基因,通过qRT-PCR技术,并结合geNorm、NormFinder 和 BestKeeper 软件对构树Cd胁迫下不同组织器官表达稳定性进行评估。由于各软件的运算逻辑及使用的统计学方法不同,各分析软件中内参基因表达稳定性排名略有差异,如geNorm与NormFinder软件分析结果均显示 BpDOUB基因表达稳定性最好,而Bestkeeper 软件分析结果则显示BpNADH基因表达较稳定。这种现象在杨树(Populus deltoides[31]、扇脉杓兰(Cypripedium japonicum Thunb.)[32]以及其它植物内参基因研究中也有出现。RefFinder是一种候选内参基因稳定性综合分析的程序,已被广泛用于内参基因筛选研究中[13,27]。为对内参基因稳定性进行综合评价,本研究利用RefFinder对10个候选内参基因稳定性进行综合评估,基因表达稳定性从高到低依次为:BpDOUB、BpNADH、BpUBE2、BpHIS、BpActin、BpTUA、BpHSP、Bpβ-TUB、BpRPL8、BpGAPDH。为避免单个内参基因造成实验误差,通常选择2个或多个基因作为内参基因调整系统偏差,得到更准确的基因表达定量结果,本研究中用geNorm软件确定了内参基因最佳数量,各候选内参基因的变异系数(V2/3)均<0.15,说明在Cd胁迫下构树仅需要2个内参基因即可得到可靠结果。最终确定BpDOUBBpNADH为Cd胁迫条件下构树荧光定量结果标准化分析的最佳内参基因组合。

      DREB是植物中特有的转录因子,植物遭受逆境胁迫后,DREB通过与逆境抗性基因启动子区的DRE/CRT(脱水反应元件)顺式元件发生特异性相互作用,调节一系列下游基因(包含DRE/CRT元件)的表达,增强植物逆境的抗性[19],已经在构树[8]、甘薯(Dioscorea esculenta (Lour.) Burkill)[33]、刚毛柽柳(Tamarix hispida Willd.)[34]等多种植物研究中发现DREB基因可以被重金属Cd诱导上调表达,可用于验证筛选出的内参基因的可靠性。本研究分别使用筛选出的最佳内参基因BpDOUB、BpNADH及其组合为内参基因,同时以稳定性最差的基因BpGAPDH为参照,分析Cd胁迫下BpDREB基因在构树根部以及叶片中的表达模式,结果显示:使用表达稳定的基因(BpDOUB、BpNADH)进行基因表达水平归一化时,逆境胁迫响应基因BpDREB在Cd处理下构树的根部和叶部表达模式基本一致,均为上调表达,而用不稳定的BpGAPDH基因为参照时,基因表达水平明显不同,进一步验证了筛选出的内参基因的准确性。综上表明,选择适合的内参基因对于分析目的基因表达变化至关重要。

    • 本研究通过qRT-PCR技术并结合内参基因稳定性分析软件geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder 对候选内参基因的表达稳定性进行评价,确定BpDOUBBpNADH为构树Cd胁迫条件下最适内参基因组合,并通过逆境胁迫响应基因BpDREB进一步验证筛选的内参基因的准确性。本研究结果为构树Cd胁迫下目的基因表达分析提供了可靠的内参基因,为开展构树耐Cd机理研究和重要功能基因发掘奠定基础。

参考文献 (34)

目录

    /

    返回文章
    返回