试剂及仪器：供试药剂均是国产分析纯（苏州格锐思生物科技有限公司），人工气候培养箱RXZ-260A、水浴锅HH-M6、紫外分光光度计Each 840-37（上海俊升科学器材有限公司），高效液相色谱仪LC- 100（上海伍丰科学仪器有限公司），移液枪Eppendorf 100～1 mL、50～200 µL（德国艾本德公司），离心机TLG-16、酶标仪Multiskan FC（美国ThermoFisher Scientific公司），研钵（天翼沣生物科技有限公司）。

虫源：苹果蠹蛾虫源采自于新疆维吾尔自治区和田地区和田县拉依喀乡核桃园中，将采集的老熟幼虫带回室内置于人工气候培养箱中连续饲喂2代，饲养条件为温度（25 ± 1） ℃，湿度（60 ± 5）%，光周期16∶8（L∶D），幼虫以核桃果实饲喂，成虫以10%的蜂蜜水补充能量，将幼虫饲喂至4龄备用。

供试核桃品种为‘扎343’，种植于和田县拉依喀乡，选取长势一致、无病虫害的核桃树果实作为试验材料。

接虫：将供试苹果蠹蛾4龄幼虫接虫前进行6 h的饥饿处理备用，在野外选择进入硬核期（花后80 d）的大小一致、无病虫害核桃果实供试。以小毛笔轻轻的将备用的苹果蠹蛾4龄幼虫接于核桃果实表面，每颗核桃果实接种1头幼虫，并以网兜将果实包裹防止幼虫逃逸，以未接虫的核桃果实作对照（为害0 h）。

收样：从幼虫蛀食果实外果皮开始计时，分别接虫12、24、36、48和72 h后取样，每个时间段生物学重复3次，共计接虫核桃果实90颗。为了避免果实不同发育时期造成的影响，以不同时间接虫，同一时间收集核桃果实外果皮。将所取的样品以纯净水将果实表面清洗干净，以手术刀切取蛀孔周围1 cm²的核桃果实外果皮，将切取的样品在冰块上切成小块，迅速置于液氮罐中，备用于各项指标的测定。

可溶性糖含量的测定：采用蒽酮比色法^[14]。

可溶性蛋白含量的测定：采用考马斯亮蓝G-250法^[15]。

胡桃醌含量的测定：采用高效液相色谱法（图1）^[16]。

图  1  胡桃醌标准品（a）与核桃果实外果皮（b）的HPLC

Figure 1.  HPLC of Juglone standard (a) and walnut husk (b).

单宁含量的测定：采用试剂盒测定，试剂盒购自苏州格锐思生物科技有限公司。称取约0.1 g核桃外果皮鲜样，加入1 mL蒸馏水，以研钵充分匀浆后转移至离心管中，用80 ℃水浴锅水浴提取1 h，之后以12 000 r/min、4 ℃的条件下离心10 min。取上清液10 µL与130 µL的蒸馏水加入离心管中，加入试剂一40 µL，试剂二60 µL，用蒸馏水做标曲，以酶标仪在波长650 nm下检测单宁的含量。

总黄酮含量的测定：采用NaNO₂-Al(NO₃)₃-NaOH显色法测定黄酮总含量，以苏州格锐思生物科技有限公司的试剂盒进行测定。称取约0.1 g核桃外果皮鲜样，加入1.5 mL的60%乙醇研磨，60 ℃振荡提取2 h（若蒸发用60%乙醇定容至1.5 mL），在12 000 r/min、25 ℃的条件下离心10 min，将离心管中加入50 µL的上清液与15 µL的试剂一、30 µL试剂二和105 µL试剂三迅速混匀。用蒸馏水做标曲，以酶标仪在波长510 nm下检测总黄酮含量。

酶液的提取：称取约0.1 g核桃外果皮鲜样，放入带有液氮的研钵中研磨后加入1 mL提取液，用离心机在12 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，上清液则为酶液提取液。提取液中含有50 mmol/L（pH 7.8）的磷酸缓冲液和1%的聚乙烯吡咯烷酮，所用试剂盒购自苏州格锐思生物科技有限公司。

过氧化物酶(POD)活性的测定：采用愈创木酚法^[17]。

过氧化氢酶（CAT）活性的测定：采用钼酸铵法^[18]。

超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定：采用黄嘌呤氧化酶法^[19]。

采用Microsoft Excel 2013进行数据汇总，采用SPSS 22统计分析软件对数据进行方差显著性分析，采用Duncan’s多重比较进行检验相关指标的差异性，采用origin 2018软件对数据进行处理与绘图。

由图2a可知，核桃果实外果皮可溶性蛋白的含量随苹果蠹蛾蛀食时间的推移存在较大差异。苹果蠹蛾为害12 h时与对照相比可溶性蛋白含量增加，增加量为3.15%，但无显著差异（P<0.05）。然而，在为害24、36、48、72 h时可溶性蛋白含量持续降低，与对照相比分别低于13.02%、13.81%、20.67%、23.64%，差异水平均显著（P>0.05）。可见在为害24 h时，可溶性蛋白含量显著降低，核桃外果皮可能开始产生防御反应。

图  2  苹果蠹蛾为害后核桃果实外果皮营养物质含量的变化

Figure 2.  Changes of nutrient content in Walnut husk after feeding by Cydia pomonella

由图2b可知，苹果蠹蛾为害不同时间段后，核桃果实外果皮可溶性糖逐渐下降。为害12、24、36、48、72 h时可溶性糖含量分别比对照低于1.51%、2.78%、4.15%、20.66%、29.42%。其中，在苹果蠹蛾为害12～36 h内与对照相比均无显著差异（P<0.05），在为害48 h时与对照相比差异水平显著（P>0.05）。可见在危害48 h时，可溶性糖含量显著降低，进而可能抵御苹果蠹蛾的为害。

综上所述，核桃果实外果皮营养物质的含量随着苹果蠹蛾为害时间的延长而逐渐降低，由此推测核桃果实外果皮可能通过改变营养物质进而影响苹果蠹蛾的生长发育，其中不同营养物质所改变的时间有所差异。

根据图3a可知，随着苹果蠹蛾为害时间的延长，核桃果实外果皮中胡桃醌的含量与对照相比均增加，其含量呈先上升后下降的趋势。在苹果蠹蛾为害24～72 h时与对照相比胡桃醌的含量均有显著差异（P>0.05），其中在为害48 h时胡桃醌含量达到最高，为976.68 µg·g⁻¹ FW，与对照相比增加44.48%。为害36 h和72 h与对照相比胡桃醌含量变化较小，分别增加25.60%和22.32%。由此可见在为害48 h时，苹果蠹蛾幼虫的取食可能受到影响。

图  3  苹果蠹蛾为害后核桃果实外果皮次生代谢物质含量与防御酶活性的变化

Figure 3.  Changes of secondary metabolite content and defense enzyme activities in walnut husk after feeding by Cydia pomonella

由图3b可知，苹果蠹蛾为害不同时间，与对照相比每个时间点的类黄酮的含量均增加，其含量的表达趋势逐渐上升。在取食24 h时与对照相比类黄酮含量差异显著（P>0.05），其含量为8.47 mg·g⁻¹，是对照的1.21倍，在为害72 h时类黄酮含量达到最高为9.95 mg·g⁻¹，是对照的1.41倍。由此可知苹果蠹蛾为害不同时间后类黄酮的大量合成，可能是因为类黄酮参与对苹果蠹蛾的防御所导致。

由图3c可知，苹果蠹蛾为害时间不同，核桃果实外果皮单宁含量不同，其单宁含量呈先增加后降低的趋势。在为害12 h时，与对照相比差异显著（P>0.05），单宁含量为对照的1.26倍，在为害24 h时，单宁含量达到最高，为4.11 mg·g⁻¹，是对照的1.33倍，进一步说明在为害24 h时，核桃果实外果皮可能已产生抗虫性能。在为害12～48 h内，单宁的含量均显著高于对照（P>0.05），但在为害72 h时，与对照相比单宁含量无显著差异（P<0.05），且含量比对照低0.97倍。

综上所述，苹果蠹蛾为害不同时间点，核桃果实外果皮次生代谢物的含量变化趋势不同，可见核桃外果皮中的不同次生代谢物在苹果蠹蛾胁迫时均产生相应的抗性。

通过对核桃果实外果皮CAT活性的测定，由图3d可知，随着取食时间的推移CAT活性呈先增加后降低再增加的趋势。由于苹果蠹蛾的取食诱导，核桃果实外果皮CAT的活性迅速增加，在为害12 h时，与对照相比CAT活性差异显著（P>0.05），在为害24 h时，虽然CAT活性增加，但是与对照相比无显著差异（P<0.05），在为害36～48 h内，与对照相比CAT活性均显著降低（P>0.05），在为害36 h时，CAT活性达最低值（24.65 U·min⁻¹·g⁻¹），在为害72 h时，CAT活性达峰值为55.97 U·min⁻¹·g⁻¹，是对照的1.45倍，差异水平达到显著（P>0.05）。

根据图3e所示，苹果蠹蛾为害不同时间后，核桃果实外果皮中POD的活性具有显著影响。在为害0～36 h内迅速降低，在为害36 h时，POD活性降到最低值为12.89 U·min⁻¹·g⁻¹，差异水平显著（P>0.05），在为害48～72 h内，POD活性迅速增加，均高于对照，与对照相比均差异显著（P>0.05），在为害72 h时，POD活性达到峰值为66.44 U·min⁻¹·g⁻¹，是对照的1.62倍。

通过对核桃果实外果皮中SOD活性的测定，根据图3f可知，核桃果实外果皮应对苹果蠹蛾不同时间的取食胁迫时，体内的SOD活性迅速提升，在为害24 h时达到峰值623.69 U·g⁻¹，是对照的1.98倍，之后SOD的活性有所回落，在取食36 h（329.22 U·g⁻¹）和48 h（335.15 U·g⁻¹）时，核桃果实外果皮中SOD活性虽高于对照，但是三者均无差异性（P<0.05），在取食72 h时，核桃果实外果皮中SOD活性低于对照，但与对照相比SOD活性无显著差异（P<0.05）。结果表明，苹果蠹蛾为害核桃果实外果皮时，核桃果实外果皮防御酶会迅速应对，由此可见核桃果实外果皮对苹果蠹蛾的为害产生明显的诱导防御反应。

对于植食性昆虫而言，取食是唯一获取生长发育所需营养的必须途径，因此植物在面对植食性昆虫损害与入侵的时候，可通过对营养物质含量的调节，进而影响植食性昆虫的生长发育与繁殖，降低了昆虫的存活率而获得抗虫性^[20-22]。在李传明^[22]等人的研究中发现辣椒（Capsicum annuum Linnaeus）被烟粉虱（Bemisia tabaci Gennadius）为害时自身的可溶性糖含量增加，可溶性蛋白含量降低，进而对烟粉虱产生抗性；李胜^[23]等人研究表明在颈盲蝽（Pachypeltis Sp）为害不同时间后，薇甘菊（Mikania micrantha Kunth）可溶性糖含量相比对照均显著上升，可溶性蛋白含量逐渐下降。本研究发现，苹果蠹蛾为害后，可溶性糖含量与可溶性蛋白含量均降低，其中可溶蛋白含量在为害24 h是与对照相比差异显著，可溶性糖含量与对照相比在为害48 h时差异显著。但是对于这些营养物质含量与抗虫的相关性，目前无绝对定论^[24]。也有研究表明一些刺吸式的昆虫如蝽类，此昆虫的唾液酶中包含一些淀粉酶、蛋白酶等，有助于将食物进行体外消化，将淀粉转化为麦芽糖最终分解为葡萄糖^[25]。因此对于苹果蠹蛾为害后核桃果实外果皮中可溶性糖与可溶性蛋白含量的变化是植物自身调节还是由于某些物质的分解所导致，有待进一步研究。

在植物体内含有一类结构复杂、种类较多的次生代谢物质，这类物质不能直接参与植物的生长发育，但是在植食性昆虫为害时，可有效抑制、干扰昆虫的一些交配、取食行为，同时也可以吸引天敌，进而诱杀。因此在植物防御植食性昆虫为害时发挥重要作用，也是衡量植物抗性的重要指标^[26-27]。在前人的研究中发现刚竹毒蛾（Pantana phyllostachysae Chao）为害毛竹（Phyllostachys edulis Houz）叶片时，单宁与类黄酮的含量均显著上升；马尾松毛虫（Dendrolimus punctatus Walker）为害马尾松（Pinus massoniana Lamb）后，其叶片中的单宁含量显著升高；当甜槠（Castanopsis eyrei Totch）被红腹柄天牛（Aphredisinm faldermannii rufiventris Gressitt）为害后，其植物体内的类黄酮含量显著升高^[28-30]。本研究发现在苹果蠹蛾为害不同时间后单宁含量在12～48 h均显著高于对照，其中在为害24 h时单宁含量达到峰值，由此可以推断此时间点核桃果实外果皮可能产生抗性，抵御苹果蠹蛾的为害；为害不同时间类黄酮的含量均持续升高并差异显著，说明苹果蠹蛾为害可诱导核桃果实外果皮中类黄酮含量的升高，进而提高核桃果实外果皮对苹果蠹蛾的抗性。胡桃醌是核桃果实外果皮中主要的次生代谢物之一，其具有抗氧化、抑菌、杀虫的作用^[31]。王雨萌^[32]等人研究表明胡桃醌对小菜蛾（Plutella xylostella Linnaeus）、蚜虫具有较好的触杀作用，对白粉虱（Trialeurodes vaporariorum Westwood）成虫具有胃毒作用。Piskorski^[33]等人研究表明当苹果蠹蛾取食含有胡桃醌的饲料时与对照相比，幼虫发育历期延长，体重减少，当胡桃醌的含量是核桃果实外果皮的两倍时对幼虫有毒杀的作用。在本研究中，苹果蠹蛾取食核桃果实外果皮，因此胡桃醌含量的高低与核桃果实外果皮对苹果蠹蛾的抗性有关，故胡桃醌的含量可以作为评价核桃种或品种抗苹果蠹蛾的指标之一。可见在苹果蠹蛾为害不同时间后，次生代谢物含量均有变化，其在24～48 h之间，从单宁、类黄酮和胡桃醌含量的变化趋势推测这3种物质可能相互协同，因此本研究从物质含量变化的角度揭示核桃果实外果皮受虫害胁迫后其防御响应的机制，但对于更深层次的防御机制研究需进一步的研究。

植物与病虫害对抗时，防御酶起着非常重要的作用，能作用昆虫使昆虫中毒或者营养失衡^[34]。其中CAT、POD、SOD等防御酶是植物在逆境胁迫下最为关键的酶^[35]。CAT的主要功能是将植物体内的H₂O₂分解，维持植物相关组织活性；POD与植物体内活性氧代谢有关，主要维持植物体内自由基平衡，同时参与木质素合成，在植物抗病虫害中起着重要作用；SOD的主要功能是植物在逆境条件下清除自由基，延缓植物衰老^[36]。陈鹏^[37]等人研究表明当二斑叶螨（Tetranychus cinnabarinus Koch）为害草莓（Fragaria ananassa Duch）叶片不同时间时，SOD活性呈先上升后降低的趋势；母小庆^[38]等人研究梨小食心虫（Grapholita molesta Busck）与苹果蠹蛾对苹果果实防御酶活性的影响中表明，在遭受害虫为害后，SOD活性随时间的推移而呈上升趋势；李胜^[23]等人研究表明颈盲蝽为害薇甘菊后，随着时间的推移，POD与CAT活性呈先上升后下降的趋势，而SOD呈先降低后上升再降低的趋势。可见寄主植物与植食性昆虫不同，防御酶活性趋势也有较大差异。本研究发现苹果蠹蛾为害核桃果实外果皮后，SOD活性先上升后，在为害24 h时达到峰值，之后活性逐渐降低；CAT活性呈先上升后降低再上升的趋势；POD活性呈先降低后升高的趋势，CAT与POD均在在为害72 h是达到峰值。由此可见苹果蠹蛾为害胁迫会引起核桃果实外果皮酶促反应中相关酶活性的变化，进而抵御苹果蠹蛾的为害。从防御酶活性变化趋势推测SOD、CAT与POD可能存在拮抗作用，但对于防御酶相互作用的分子机制需进一步研究。

近年来农业产业发展结构的不断调整与果园管理模式的改变，苹果蠹蛾已在我国各大果区严重发生，尤其在核桃园区中扩散面积呈上升趋势。因此本研究明确苹果蠹蛾为害后，可诱导核桃果实外果皮营养物质与次生代谢物质的含量、防御酶活性的变化，进而从物质含量变化的角度揭示核桃果实外果皮受苹果蠹蛾为害后其防御的响应机制。由于植物自身在应对生物与非生物胁迫时，相关防御体系、代谢途径形式多样化，因此在今后的研究中从微观代谢途径的变化进一步研究，探究植物应对虫害胁迫时所产生的防御机制，为苹果蠹蛾的绿色防控奠定基础。

本研究发现苹果蠹蛾为害诱导核桃果实外果皮在营养物质、次生代谢物质以及防御酶活性方面产生防御响应。其中单宁含量与CAT、POD、SOD活性在苹果蠹蛾为害12 h时较对照差异显著（P>0.05）；可溶性蛋白、胡桃醌以及类黄酮含量在苹果蠹蛾为害24 h时较对照差异显著（P>0.05）；可溶性糖含量在苹果蠹蛾为害48 h时较对照差异显著（P>0.05）。为之后核桃抗虫品种的选育提供科学的理论依据。