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舞毒蛾Methuselah-like分子模拟及靶向小分子抑制剂研究

吴元旺 谢佳铭 丛培娟 曹传旺 孙丽丽

引用本文:
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舞毒蛾Methuselah-like分子模拟及靶向小分子抑制剂研究

    通讯作者: 孙丽丽, sunlili@nefu.edu.cn
  • 中图分类号: S763.3

Molecular Simulation of Lymantria dispar Methuselah-like and Targeting Small Molecular Inhibitors

    Corresponding author: SUN Li-li, sunlili@nefu.edu.cn
  • CLC number: S763.3

  • 摘要: 目的 旨在通过虚拟筛选技术筛选Methuselah-like(Ldmthl1)蛋白潜在的小分子抑制剂,并通过分子动力学模拟、MM-PBSA及生物测定,探究潜在化合物对Ldmthl1蛋白的抑制能力,为针对舞毒蛾Ldmthl1研发新型靶向杀虫剂奠定理论基础。 方法 以舞毒蛾为研究对象,构建Ldmthl1同源模型,虚拟筛选Ldmthl1受体小分子抑制剂,并采用分子动力学和MM-PBSA计算结合自由能分析6种潜在小分子抑制剂与Ldmthl1受体的结合强度;通过生物测定分析6种潜在小分子抑制剂的毒力,同时将6种潜在小分子抑制剂与溴氰菊酯进行联合使用,探究6种潜在化合物的增效作用。 结果 Ldmthl1含7个跨膜结构,符合G蛋白偶联受体结构特点,评估后符合蛋白模型评估标准;分子对接获得20个候选化合物,根据结合方式及结合能确定6种小分子化合物为潜在的抑制剂;分子动力学模拟显示,6种潜在小分子抑制剂通过氢键和疏水作用力与Ldmthl1受体稳定结合;MM-PBSA计算结合自由能发现6种潜在小分子抑制剂与Ldmthl1受体结合紧密;致死浓度LC30溴氰菊酯与6种抑制剂按照1:1、1:2和2:1的比例联合使用饲喂舞毒蛾3龄幼虫,6种抑制剂与溴氰菊酯具有协同增效作用,且当混合比例为1:2时,增效作用最显著,但溴氰菊酯浓度过高时,导致抑制剂无增效作用。 结论 虚拟筛选得到6种可与Ldmthl1受体稳定结合且具有杀虫活性潜在小分子抑制剂,与溴氰菊酯联用后呈现增效作用,本研究可为研发Ldmthl1靶向新型杀虫剂奠定理论基础。
  • 图 1  Ldmthl模型骨架原子的RMSD图

    Figure 1.  RMSD diagram of the skeleton atoms of the Ldmthl model

    图 2  去掉胞内域后的Ldmthl模型及优化后蛋白模型评估结果

    Figure 2.  Evaluation results of Ldmthl model with intracellular domain removed and optimized protein model

    图 3  6个小分子化合物3D结构

    Figure 3.  3D structure of six small molecule compounds

    图 4  Ldmthl与6个小分子化合物复合物模型骨架原子的RMSD图

    Figure 4.  RMSD plots of Ldmthl complexes with six small molecule compound model backbone atoms

    图 5  Ldmthl受体与小分子抑制剂的对接分析

    Figure 5.  Ldmthl receptor and small molecule inhibitors docking result analysis

    表 1  筛选的数据库中小分子化合物对接特性分析

    Table 1.  2-1 Docking characterization of small molecule compounds in the screened database

    编号
    NO.
    化合物
    Compound
    分子式
    Molecular
    formula
    分子量
    NWa
    脂分配系数
    xLogPa
    分子极性
    表面积
    HBAa
    氢键受体
    HBDa
    键供体
    PSAa
    对接分数
    Docking
    Score
    结合能
    Binding Energy/
    (KJ·mol−1)
    VS_015 异喹啉
    Isoquinoline
    C9H7N 129.16 2.1 0 1 12.9 −9.032 −57.69
    VS_072 地奥司明
    Diosmin
    C28H32O15 608.5 −0.8 9 8 234 −8.863 −56.45
    VS_085 罗格列酮
    Rosiglitazone
    C18H19N3O3S 357.4 3.1 6 1 96.8 −9.146 −55.34
    VS_111 大豆苷
    Daidzin
    C21H20O9 416.4 0.7 9 5 146 −9.063 −55.27
    VS_190 麦角甾苷
    Verbascoside
    C29H36O15 624.6 −0.5 10 9 245 −11.084 −54.17
    VS_328 车前子甙
    Plantamajoside
    C29H36O16 640.6 −1 9 8 266 −9.689 −53.46
      注:a,表示小分子化合物特征的缩写。
      Note: a, abbreviation used for features.
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    表 2  MM/PBSA法分析6个化合物与Ldmthl1复合体相关的结合自由能

    Table 2.  Analysis of binding free energies associated with the Ldmthl1 complex of six compounds by MM/PBSA method kcal·mol−1

    相关结合自由能
    Binding energy
    罗格列酮
    Rosiglitazone
    麦角甾苷
    Verbascoside
    地奥司明
    Diosmin
    大豆苷
    Daidzin
    异喹啉
    Isoquinoline
    车前子甙
    Plantamajoside
    ΔEele −32.32 −42.53 −15.98 −38.58 −30.29 −39.56
    ΔGvdw −59.85 −47.98 −51.14 −42.57 −41.82 −36.87
    ΔGnp −8.45 −7.03 −6.88 −7.04 −6.44 −6.67
    ΔGPB 40.43 42.32 27.36 36.68 20.48 40.24
    ΔGcavity −8.45 −7.03 −6.88 −7.04 −6.44 −6.67
    ΔGgas −92.17 −90.51 −67.12 −81.15 −72.11 −68.43
    ΔGsol 31.98 35.29 20.48 29.64 10.04 33.57
    TΔS 19.62 15.86 16.89 21.17 27.80 14.85
    ΔGbinda −68.64 −62.25 −53.52 −58.55 −68.51 −41.53
    ΔGbindb −49.02 −46.39 −36.63 −37.38 −40.71 −26.68
      注:总结合自由能的组成成分包括:电荷能(ΔEele),van der Waals能(ΔGvdw),非极性溶解自由能(ΔGnp),极性溶解自由能(ΔGPB),气化能gas(ΔGgasGvdw + ΔEele),溶解自由能solvation(ΔGsolGnp + ΔGPB),(ΔGbinda)结合自由能没有把熵值的影响考虑在内。(ΔGbindb)结合自由能把熵值的影响考虑在内。
      Notes: The components of the total binding energy are also shown: electrostatic (ΔEele), nonpolar solvation (ΔGnp), polar solvation (ΔGPB), gas (ΔGgasGvdw + ΔEele), solvation(ΔGsolGnp + ΔGPB), (ΔGbinda), the entropy term was not included in the total binding free energy. (ΔGbindb), The entropy term was included in the total binding free energy.
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    表 3  6种抑制剂对舞毒蛾3龄幼虫的毒力(48 h)

    Table 3.  Toxicity of six inhibitors on the 3rd instar L. dispar larvae (48 h)

    编号
    Number
    化合物
    Compound
    LC50 95%置信区间
    LC50 95% confidence
    interval /(μg·g−1)
    LC30 95%置信区间
    LC30 95% confidence
    interval /(μg·g−1)
    斜率
    Lope ± SE
    卡方值
    Chi-square value (χ2df))
    VS_328 车前子甙 Verbascoside 19.16(15.88~23.10) 13.10(11.02~15.57) 3.19 ± 0.05 4.59(13)
    VS_190 麦角甾苷 Plantamajoside 17.58(15.06~20.53) 12.63(10.77~14.81) 3.66 ± 0.04 10.27(13)
    VS_111 大豆苷 Daidzin 6.89(5.50~8.65) 4.02(2.87~5.63) 2.24 ± 0.06 6.03(13)
    VS_085 罗格列酮 Rosiglitazone 6.25(5.09~7.66) 4.03(3.25~4.98) 2.77 ± 0.05 3.45(13)
    VS_072 地奥司明 Diosmin 5.27(4.42~6.28) 3.56(2.91~4.35) 3.10 ± 0.04 2.62(13)
    VS_015 异喹啉 Isoquinoline 2.39(1.76~3.25) 1.26(0.79~1.99) 1.88 ± 0.07 5.52(13)
      注:卡方值小于χ2(13,0.05)=22.36,故毒力回归方程与实际相符。
      Note: The chi-square value is less than χ2(13,0.05)=22.36, so the toxicity regression equation is consistent with the actual situation.
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    表 4  不同比例抑制剂和溴氰菊酯联合处理对舞毒蛾幼虫死亡率的影响及复合毒性评价

    Table 4.  Effect of different proportions of inhibitors and deltamethrin combined treatment on the mortality rate of L. dispar larvae and composite toxicity evaluation

    比例
    Ratio
    处理
    Treatments
    死亡率 mortality /% 复合胁迫表征值
    RI
    复合毒性
    Compound toxicity
    12 h 24 h 36 h 48 h
    1﹕1 二甲基亚砜(DMSO) 0.00c 0.00d 0.00f 0.00g
    车前子甙 0.00c 0.00d 0.00f 0.00g
    麦角甾苷 0.00c 0.00d 0.00f 3.33 ± 4.71g
    罗格列酮 0.00c 0.00d 3.33 ± 4.71ef 13.33 ± 4.71f
    地奥司明 0.00c 0.00d 6.67 ± 4.71e 16.67 ± 4.71de
    大豆苷 0.00c 3.33 ± 4.71cd 6.67 ± 4.71e 16.67 ± 4.71de
    异喹啉 3.33 ± 4.71bc 16.67 ± 4.71b 23.33 ± 4.71b 50.00 ± 8.16c
    溴氰菊酯 0.00c 6.67 ± 4.71c 16.67 ± 4.71cd 33.33 ± 4.71d
    溴氰菊酯 + 车前子甙 0.00c 6.67 ± 4.71c 20.00 ± 8.16c 33.33 ± 4.71d 1.03 相加
    溴氰菊酯 + 麦角甾苷 0.00c 6.67 ± 4.71c 20.00 ± 8.16c 36.67 ± 4.71d 1.11 协同
    溴氰菊酯 + 罗格列酮 0.00c 13.33 ± 4.71b 30.00b 53.33 ± 4.71bc 1.03 相加
    溴氰菊酯 + 地奥司明 6.67 ± 4.71b 33.33 ± 4.71ab 43.33 ± 4.71ab 56.67 ± 4.71bc 1.05 相加
    溴氰菊酯 + 大豆苷 3.33 ± 4.71bc 33.33 ± 4.71ab 43.33 ± 4.71ab 63.33 ± 4.71b 1.12 协同
    溴氰菊酯 + 异喹啉 16.67 ± 4.71a 36.67 ± 4.71a 60.00 ± 8.16a 93.33 ± 4.71a 1.54 协同
    1﹕2 二甲基亚砜(DMSO) 0.00d 0.00g 0.00f 0.00f
    车前子甙 0.00d 0.00g 0.00f 3.33 ± 4.71ef
    麦角甾苷 0.00d 0.00g 0.00f 6.67 ± 4.71e
    罗格列酮 0.00d 3.33 ± 4.71f 13.33 ± 4.71e 36.67 ± 4.71cd
    地奥司明 0.00d 3.33 ± 4.71f 16.67 ± 4.71de 30.00cd
    大豆苷 0.00d 3.33 ± 4.71f 13.33 ± 4.71e 26.67 ± 4.71d
    异喹啉 46.67 ± 4.71b 86.67 ± 4.71b 100.00a 100.00a
    溴氰菊酯 0.00d 6.67 ± 4.71f 16.67 ± 4.71de 23.33 ± 9.43d
    溴氰菊酯 + 车前子甙 0.00d 6.67 ± 4.71f 23.33 ± 4.71d 40.00 ± 8.16c 1.98 协同
    溴氰菊酯 + 麦角甾苷 6.67 ± 4.71d 16.67 ± 4.71e 23.33 ± 4.71d 36.67 ± 4.71cd 1.83 协同
    溴氰菊酯 + 罗格列酮 16.67 ± 4.71c 30.00 ± 8.16de 50.00 ± 8.16c 73.33 ± 4.71bc 1.44 协同
    溴氰菊酯 + 地奥司明 23.33 ± 4.71c 43.33 ± 4.71c 63.33 ± 4.71b 86.67 ± 4.71b 1.26 协同
    溴氰菊酯 + 大豆苷 13.33 ± 4.71cd 33.33 ± 4.71d 56.67 ± 4.71bc 73.33 ± 4.71bc 1.56 协同
    溴氰菊酯 + 异喹啉 80.00 ± 8.16a 100.00a 100.00a 100.00a 1.33 协同
    2﹕1 二甲基亚砜(DMSO) 0.00d 0.00d 0.00d 0.00d
    车前子甙 0.00d 0.00d 0.00d 0.00d
    麦角甾苷 0.00d 0.00d 0.00d 3.33 ± 4.71d
    罗格列酮 0.00d 0.00d 3.33 ± 4.71c 13.33 ± 4.71cd
    地奥司明 0.00d 0.00d 6.67 ± 4.71c 16.67 ± 4.71c
    大豆苷 0.00d 3.33 ± 4.71d 6.67 ± 4.71c 16.67 ± 4.71c
    异喹啉 3.33 ± 4.71d 16.67 ± 4.71c 33.33 ± 4.71b 50.00 ± 8.16b
    溴氰菊酯 46.67 ± 4.71c 80.00 ± 8.16bc 100.00a 100.00a
    溴氰菊酯 + 车前子甙 53.33 ± 4.71bc 86.67 ± 4.71b 100.00a 100.00a 1.03 相加
    溴氰菊酯 + 麦角甾苷 53.33 ± 4.71bc 86.67 ± 4.71b 100.00a 100.00a 1.06 相加
    溴氰菊酯 + 罗格列酮 56.67 ± 4.71bc 90.00ab 100.00a 100.00a 1.02 相加
    溴氰菊酯 + 地奥司明 76.67 ± 4.71ab 96.67 ± 4.71a 100.00a 100.00a 1.06 相加
    溴氰菊酯 + 大豆苷 66.67 ± 4.71b 93.33 ± 4.71ab 100.00a 100.00a 1.05 相加
    溴氰菊酯 + 异喹啉 86.67 ± 4.71a 100.00a 100.00a 100.00a 1.08 相加
      注:采用Duncan分析方法,不同小写字母表示同一时间不同处理间的差异显著性(P < 0.05)。
      Note: The lowercase letters simultaneously show significant differences between treatments by Duncan analysis at 0.05.
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出版历程
  • 收稿日期:  2023-10-20
  • 录用日期:  2023-11-28
  • 网络出版日期:  2024-06-10

舞毒蛾Methuselah-like分子模拟及靶向小分子抑制剂研究

    通讯作者: 孙丽丽, sunlili@nefu.edu.cn
  • 1. 东北林业大学林学院,黑龙江 哈尔滨 150040
  • 2. 内蒙古赤峰市宁城县必斯营子镇人民政府综合保障和技术推广中心,内蒙古 赤峰市 024212
  • 3. 东北林业大学森林生态系统可持续经营教育部重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150040

摘要:  目的 旨在通过虚拟筛选技术筛选Methuselah-like(Ldmthl1)蛋白潜在的小分子抑制剂,并通过分子动力学模拟、MM-PBSA及生物测定,探究潜在化合物对Ldmthl1蛋白的抑制能力,为针对舞毒蛾Ldmthl1研发新型靶向杀虫剂奠定理论基础。 方法 以舞毒蛾为研究对象,构建Ldmthl1同源模型,虚拟筛选Ldmthl1受体小分子抑制剂,并采用分子动力学和MM-PBSA计算结合自由能分析6种潜在小分子抑制剂与Ldmthl1受体的结合强度;通过生物测定分析6种潜在小分子抑制剂的毒力,同时将6种潜在小分子抑制剂与溴氰菊酯进行联合使用,探究6种潜在化合物的增效作用。 结果 Ldmthl1含7个跨膜结构,符合G蛋白偶联受体结构特点,评估后符合蛋白模型评估标准;分子对接获得20个候选化合物,根据结合方式及结合能确定6种小分子化合物为潜在的抑制剂;分子动力学模拟显示,6种潜在小分子抑制剂通过氢键和疏水作用力与Ldmthl1受体稳定结合;MM-PBSA计算结合自由能发现6种潜在小分子抑制剂与Ldmthl1受体结合紧密;致死浓度LC30溴氰菊酯与6种抑制剂按照1:1、1:2和2:1的比例联合使用饲喂舞毒蛾3龄幼虫,6种抑制剂与溴氰菊酯具有协同增效作用,且当混合比例为1:2时,增效作用最显著,但溴氰菊酯浓度过高时,导致抑制剂无增效作用。 结论 虚拟筛选得到6种可与Ldmthl1受体稳定结合且具有杀虫活性潜在小分子抑制剂,与溴氰菊酯联用后呈现增效作用,本研究可为研发Ldmthl1靶向新型杀虫剂奠定理论基础。

English Abstract

  • 计算机辅助药物设计(Computer Aided Drug Design,CADD)是一种以计算机化学为基础,通过计算机的模拟来预测和计算配体与受体生物大分子之间的关系,从而进行先导化合物的优化与设计[1]。CADD技术可以大大缩短新药的开发周期,并降低开发成本[2]。受体-配体作用假说和分子模拟是CADD的理论基础,根据受体结构是否已知,可分为基于配体的药物设计(Ligand-Based Drug Design,LBDD)和基于结构的药物设计(Structure-Based Drug Design,SBDD)两种模式,前者适用于仅具有已知活性化合物而未知候选药物三维结构的药物设计,后者适用于具有已知三维结构的配体-受体结合模式的构建[3]。虚拟筛选是基于分子对接筛选药物分子的方法,是CADD包含的技术之一,其中,分子对接指蛋白质受体和小分子之间通过计算机预测结合区域并且相互识别结合的过程。因此利用分子对接,可以快速匹配到一个或多个能与受体蛋白结合的小分子[4]。该技术现已在害虫防治领域得到广泛应用,Liu等通过定量构效关系(QSAR)模型探索邻氨基苯甲酰胺类化合物与鱼尼丁受体(Ryanodine receptor,RyR)的三维定量构效关系(3D-QSAR)和药效团模型,证明了邻氨基苯甲酰胺类化合物可作为RyR受体的激动剂[5]。Shen等通过虚拟筛选,在天然产物数据库中发现了比四乙基铵(TEA)的活性高20~1 000倍的4种高活性化合物依次是松果林(songorine)、甲苯酰水杨酸(benzoyltalatisamine)、焦展花乌头碱(pyrochasmaconitine)和塔拉萨敏(talatisamine)[6]。杜新凯(2018)借助计算机辅助药物设计筛选出9种不同结构骨架的棉铃虫(Helicoverpa armigera H.)甾醇载体蛋白2(sterol carrier protein-2,SCP-2)小分子抑制剂,并对棉铃虫幼虫进行了生物测定,最终确定了5种HaSCP-2蛋白抑制剂(H1、H7、H14、H19和H29)[7]

    蛋白抑制剂是对蛋白有抑制活性的一种有机小分子,其分子量较小,能与蛋白的活性部位相结合,从而抑制蛋白表达[8]。Méndez-Álvarez等通过虚拟筛选,成功发现了对草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)乙酰胆碱酯酶有抑制活性的3种新的丁香酚类似物[9];牟星等用扁豆碱、残杀威、异丙威3种抑制剂处理褐色橘蚜(Toxoptera citricida K.),并对褐色橘蚜体内乙酰胆碱酯酶活性进行了测定,通过比较3种抑制剂对褐色橘蚜成蚜和若蚜的IC50,发现与若蚜相比,褐色橘蚜成蚜乙酰胆碱酯酶对3种药剂的敏感性呈下调状态,需要更大剂量药剂来抑制成蚜乙酰胆碱酯酶,因此在实际生产中,褐色橘蚜防治应尽量在若蚜期进行[10]。卢琼针对几丁质酶进行抑制剂筛选并进行生物活性研究,确定了具有选择抑制活性和选择杀虫活性的双吲哚生物碱Lynamicin B为候选化合物[11]。此外,抑制剂还可以作用于害虫乙酰胆碱酯酶受体、电压敏感的钠离子通道以及γ-氨基丁酸门控氯离子通道,从而达到杀虫的目的[12-13];Kono等认为在钠离子通道上存在6个神经毒素的结合位点[14],但Zlotkin认为有9个结合位点[15],目前,其中3个结合位点已确定为钠离子通道抑制剂的结合位点[16]

    MethuselahMth)基因最早从黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中鉴定出来,并确定了Mth基因是一个参与调节寿命的G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptors,GPCRs),现已证实在调控果蝇的寿命、应激反应和感知运动方面起着重要作用[17-18]。Song等还发现了Mth在突触前运动神经元中是必需的,抑制Mth基因的表达显著影响果蝇突触传递效率[19]。Zhang等在花绒寄甲(Dastarcus helophoroides F.)中发现3个mth-like基因,实时荧光定量PCR显示其可能参与对花绒寄甲繁殖和发育的调控,氧化、高温、饥饿胁迫下会影响花绒寄甲成虫中3个mth-like基因的表达量,研究结果表明Dhmthl基因可能在花绒寄甲的发育、繁殖和抗逆性方面起重要作用[20]。Cao等发现雌性舞毒蛾(Lymantria dispar L.)的寿命比雄性约长2天,通过分析舞毒蛾不同发育阶段舞毒蛾Ldmthl1基因的表达量,发现雄性Ldmthl1基因的表达明显高于雌性,表明Ldmthl1基因在调节舞毒蛾的寿命中发挥关键的作用。此外,沉默舞毒蛾Ldmthl1基因后,其对溴氰菊酯敏感性显著增强,表明舞毒蛾Ldmthl1基因可能参与了杀虫剂的应激抗性[21]

    舞毒蛾是重要的林业害虫,目前,主要防治方法仍以化学防治为主,但容易产生“3R”问题[22]。因此,迫切需要寻找新型、绿色的农药。通过虚拟筛选研发靶向蛋白理想抑制剂是创制新型杀虫剂的途径之一[23]。尽管对抑制剂的筛选报道很多,但对于舞毒蛾Methuselah-like受体抑制剂的筛选未见报道。本文以舞毒蛾Methuselah-like为研究对象,通过虚拟筛选技术筛选潜在小分子抑制剂,并通过分子动力学模拟、MM-PBSA及生物测定技术,探究潜在化合物对Methuselah-like蛋白的抑制能力,以期为基于舞毒蛾Methuselah-like受体研发靶向新型杀虫剂奠定理论基础。

    • 舞毒蛾Ldmthl1基因(GenBank登录号:AVO20578.1)全长cDNA来自转录组文库[21]。供于虚拟筛选的小分子化合物包括SPECS数据库和ZINC数据库共39 862个小分子化合物。舞毒蛾卵块采自东北林业大学校园内,经10%甲醛溶液浸泡1 h、自来水冲洗10 min,晾干后置于150 mL的洁净无菌的塑料盒中饲养,饲养温度为25 ± 1 ℃,相对湿度为70 ± 5%,光周期为14 L﹕10 D。幼虫所用人工饲料购自中国林业科学研究院森林环境与自然保护研究所。

    • 建模使用2种方法,第1种方法采用AlphaFold2程序进行,使用SignalP-5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽预测,将去除信号肽的舞毒蛾Ldmthl1氨基酸序列输入至AlphaFold2中进行从头建模。第2种方法为胞外域和跨膜-胞内域多模板分别建模,胞外域模板选择黑腹果蝇Dmmthl胞外域蛋白结构(PDB登记号:1FJR,2.30 Å),跨膜-胞内域模板选择人促肾上腺皮质激素释放因子受体1(PDB登记号:4K5Y,2.98Å)、B类人胰高血糖素G蛋白偶联受体结构(PDB登记号:4L6R,3.30 Å)和人胰高血糖素受体(PDB登记号:5EE7,2.50 Å)作为模板[21]。胞外域同源模建的工具选用I-TASSER在线服务器(https://seq2fun.dcmb.med.umich.edu//I-TASSER/),设置Dmmthl胞外域蛋白结构为优先使用模板;跨膜-胞内域多模板建模使用DS2019软件中的Modeller程序进行。生成蛋白模型后,对模型进行分子动力学优化,并通过SAVEv6.0网站(https://www.swissmodel.expasy.org/)ProCheck程序对模型进行评估,进而得到最优蛋白模型。

    • 选择SPECS化合物数据库和ZINC数据库共39 862个小分子化合物用于虚拟筛选,在筛选之前,将这2个数据库整合成一个数据库,利用DS2019对整合完的数据库进行ADMET预测[24],并结合Lipinski类药5原则进行类药性筛选,筛选完成的小分子化合物再整合成一个数据库进行批量分子对接。选取对接成功的化合物,再利用DS2019软件CDOCK和Schrödinger软件的精确筛选程序进一步虚拟筛选。删除结构相似、不稳定的化合物,结合可购买的情况,分别选取每个筛选结果中前10的小分子化合物,选择其中对接分数高、结合能低的小分子化合物作为潜在的小分子抑制剂。

    • 由于Ldmthl1模型结构中不含水分子,在这种环境下体系不稳定,因此需要对体系进行溶剂化,以达到体系的动态平衡。在体系溶剂化后,通过Gromacs计算添加相应数量的平衡离子以保持整个系统的电中性。小分子化合物的力场选择GAFF力场,蛋白质的力场选择ff99SB力场,在此基础上使用Gromacs对6个小分子-蛋白复合物进行20 000 ps的分子动力学模拟,分析6个小分子化合物与Ldmthl1的结合能力。采用Gromacs软件中的MM-PBSA方法计算Ldmthl1与6种小分子化合物的结合自由能,计算原理表达式如下:

      $ {\Delta G}_{bind}={G}_{complex}-{G}_{protein}-{G}_{ligand} $

      GcomplexGproteinGligand分别代表复合物、蛋白质和配体的自由能。

      $ G={E}_{MM} + {G}_{sol}-TS $

      $ {E}_{MM}={E}_{bond} + {E}_{ele} + {E}_{vdw} $

      $ {G}_{sol}={G}_{polar} + {G}_{nonpolar} $

      其中EMM为气相能包括静电相互作用能(Ebond)、电子自由能(Eele)和范德华作用能(Evdw)。Gsol为溶剂化自由能,包括极性溶剂化自由能(Gpolar)和非极性溶剂化自由能(Gnonpolar)。-TS是自由能中的熵变,根据Schlitter公式[25]获得。

    • 抑制剂毒力测定采用饲料混药法进行。使用二甲基亚砜(DMSO)将6种抑制剂固体粉末溶解成10 mg·L−1的母液,加入适量表面活性剂(吐温80)增加抑制剂的可溶性,溶解后用水稀释成不同浓度梯度,在人工饲料制作过程中加入不同浓度梯度的抑制剂并搅拌均匀,自然风干后进行饲喂。每个浓度梯度3个重复,每个重复10头刚蜕皮的舞毒蛾3龄幼虫,在湿度为75 ± 5%,温度为(25 ± 1) ℃、光周期为14 L﹕10 D的培养箱中饲养。48 h后统计舞毒蛾幼虫死亡数,用毛笔轻触舞毒蛾幼虫无任何反应视作死亡。选取死亡率在20%~80%的抑制剂浓度区间,重新设置不同浓度梯度进行抑制剂毒力测定。

    • 采用抑制剂和溴氰菊酯联合处理,溴氰菊酯浓度为亚致死浓度LC30(2.41 μg·g−1,48 h,实验室前期数据),以溴氰菊酯亚致死浓度为标准,将溴氰菊酯分别与6种抑制剂以1﹕1(溴氰菊酯2.41 μg·g−1,抑制剂2.41 μg·g−1)、1﹕2(溴氰菊酯2.41 μg·g−1,抑制剂4.82 μg·g−1)和2﹕1(溴氰菊酯4.82 μg·g−1,抑制剂2.41 μg·g−1)的比例混合,二甲基亚砜(DMSO)溶剂、溴氰菊酯单剂和6种抑制剂单剂作为对照,在饲料制作过程中将单剂与混合药剂加到饲料中搅拌均匀,自然风干后饲喂舞毒蛾幼虫。选取健康、大小一致的刚蜕皮舞毒蛾3龄幼虫,分别用混有不同单剂以及混合药剂的饲料进行饲喂,每组20头,重复3次,每12 h统计死亡数,用毛笔轻触舞毒蛾幼虫无任何反应视作死亡。采用Abott公式评估药剂对舞毒蛾联合毒性[26],期望抑制率Cexp及复合胁迫表征值RI分别用下式表示:

      $ {\mathrm{C}}_{\mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}}=\mathrm{A} + \mathrm{B}-\mathrm{A}\mathrm{B}/100\mathrm{\%} $

      $ \mathrm{R}\mathrm{I}=\mathrm{O}\mathrm{I}/\mathrm{C}exp $

      式中A、B分别表示单一组分胁迫引起的抑制率;OI为复合胁迫引起的抑制率;RI用于判断2种组分对受试对象的复合胁迫情况;RI < 1表示拮抗作用,RI ≈ 1表示简单相加,RI > 1表示协同作用[27]

    • 使用Excel 2019统计数据,利用SPSS 17.0软件计算抑制剂对舞毒蛾幼虫的亚致死浓度LC50、LC30、95%置信区间和相关系数。使用SPSS 17.0软件单因素方差中的Ducan分析进行差异显著性分析(P < 0.05)。使用GraphPad Prism 8软件进行绘图。

    • 分子动力学模拟的各个阶段Ldmthl1模型并分析骨架原子波动情况如图1所示,图中显示1.5 ns后蛋白质构象趋于稳定,取最后1 ns内的蛋白分子构象作为虚拟筛选的受体,进而得到最终受体蛋白模型。由于优化过程中不合理区域始终有氨基酸残基的存在,分区域评估后发现不合理区域位于胞内域结构且始终无法优化,而 Ldmthl的结合区域在跨膜区域,所以评估时去掉胞内域结构进行评估,不会对结果造成影响。去掉胞内域后的模型如图2 A所示,该模型包含7个跨膜结构,符合G蛋白偶联受体蛋白跨膜结构特点;该模型的100%的氨基酸残基位于允许区域,表明优化后的模型结构合理(图2-2B)。

      图  1  Ldmthl模型骨架原子的RMSD图

      Figure 1.  RMSD diagram of the skeleton atoms of the Ldmthl model

      图  2  去掉胞内域后的Ldmthl模型及优化后蛋白模型评估结果

      Figure 2.  Evaluation results of Ldmthl model with intracellular domain removed and optimized protein model

    • 筛选出了6个小分子化合物作为潜在的小分子抑制剂,结构如图3所示。6个小分子化合物对接后得到的对接得分以及结合能量如表1所示。从表中可以看出这6个小分子化合物结合能量值较低,表明这些化合物和蛋白质受体分子Ldmthl1之间有良好的结合能力。

      图  3  6个小分子化合物3D结构

      Figure 3.  3D structure of six small molecule compounds

      表 1  筛选的数据库中小分子化合物对接特性分析

      Table 1.  2-1 Docking characterization of small molecule compounds in the screened database

      编号
      NO.
      化合物
      Compound
      分子式
      Molecular
      formula
      分子量
      NWa
      脂分配系数
      xLogPa
      分子极性
      表面积
      HBAa
      氢键受体
      HBDa
      键供体
      PSAa
      对接分数
      Docking
      Score
      结合能
      Binding Energy/
      (KJ·mol−1)
      VS_015 异喹啉
      Isoquinoline
      C9H7N 129.16 2.1 0 1 12.9 −9.032 −57.69
      VS_072 地奥司明
      Diosmin
      C28H32O15 608.5 −0.8 9 8 234 −8.863 −56.45
      VS_085 罗格列酮
      Rosiglitazone
      C18H19N3O3S 357.4 3.1 6 1 96.8 −9.146 −55.34
      VS_111 大豆苷
      Daidzin
      C21H20O9 416.4 0.7 9 5 146 −9.063 −55.27
      VS_190 麦角甾苷
      Verbascoside
      C29H36O15 624.6 −0.5 10 9 245 −11.084 −54.17
      VS_328 车前子甙
      Plantamajoside
      C29H36O16 640.6 −1 9 8 266 −9.689 −53.46
        注:a,表示小分子化合物特征的缩写。
        Note: a, abbreviation used for features.
    • 6个小分子化合物复合物均从开始波动明显到后面趋于稳定。其中,异喹啉、地奥司明、罗格列酮、麦角甾苷、大豆苷和Ldmthl1复合物在分子动力学模拟5 000 ps后达到RMSD平衡,其RMSD值在1 nm左右;车前子甙原子波动时间较长,但车前子甙-蛋白质复合物在10 000 ps后达到稳定的RMSD平衡,在1 nm左右稳定。

      图  4  Ldmthl与6个小分子化合物复合物模型骨架原子的RMSD图

      Figure 4.  RMSD plots of Ldmthl complexes with six small molecule compound model backbone atoms

    • 对基于上述筛选得到的6个化合物进行对接分析,如图5所示。异喹啉与Ldmthl1的酪氨酸(TYR)168、精氨酸(ARG)332、脯氨酸(PRO)169、HIS237、LEU234通过范德华力结合,而异喹啉与CYS334和GLY239形成重要的氢键作用,缬氨酸(VAL)241、赖氨酸(LYS)333、ILE238通过π-π键与异喹啉结合,形成疏水作用(图5A)。

      图  5  Ldmthl受体与小分子抑制剂的对接分析

      Figure 5.  Ldmthl receptor and small molecule inhibitors docking result analysis

      地奥司明与Ldmthl1的PRO169、ARG322、TYR168、VAL241、CYS334、甘氨酸(GLY)242、LEU234、色氨酸(TRP)339、苯丙氨酸(PHE)347、TRP426、谷氨酸(GLU)GLU413、PHE417、苏氨酸(THR)429、TYR182和TYR185通过范德华力结合,与GLY239、LYS333、GLU342和门冬氨酸(ASP)430形成重要的氢键作用,ILE238、LYS333和TRP335通过π-π键与地奥司明结合(图5B)。

      罗格列酮与Ldmthl1的PHE346、PHE347、LYS235、ILE238、LYS333、HIS237、VAL241、VAL235和PHE346通过范德华力结合,与GLU413、GLU342、GLY239和CYS334形成重要的氢键作用,TRP335、LEU234、PHE259和TRP410通过π-π键与其结合(图5C)。

      大豆苷与Ldmthl1中PHE346、PHE347、LEU234、CYS334、HIS237、VAL241、TYR168、PRO169、THR240、LEU231和天冬酰胺(ASN)433通过范德华力结合,与TRP410、GLU342、GLY239、GLU413和LYS235形成重要的氢键作用,LYS333、TRP335和ILE238则是通过π-π键与其结合(图5D)。

      麦角甾苷与Ldmthl1的GLY242、VAL241、CYS334、LEU234、ILE238、TYR182、TYR185、THR429、PHE347、LEU231、PHE346、TRP410、ASN433、PHE336通过范德华力结合,与ASP430、LYS235、GLU413、GLU342、LYS333、GLY239和HIS237形成重要的氢键作用,而TRP426、LYS333和PHE259则通过π-π键结合,LYS333同时也通过σ键与麦角甾苷结合(图5E)。

      车前子甙与Ldmthl1的TYR112、TYR168、GLY239、ILE238、LEU234、HIS237、CYS334、PHE346、TRP410、ASN433、TRP335、TRP339、PHE347、PHE417和TRP426以范德华力结合,与ARG332、GLU413、GLU342、CYS333、LYS235和GLN140形成重要的氢键作用,LEU231和PRO169通过π-π键与车前子甙结合(图5F)。

    • 对接复合物的总自由结合能ΔGbindb表2。6个小分子化合物与蛋白质分子受体之间的结合自由能分别为−49.02 kcal·mol−1、−46.39 kcal·mol−1、−36.63 kcal·mol−1、−37.38 kcal·mol−1、−40.71 kcal·mol−1和−26.68 kcal·mol−1。6个小分子化合物与蛋白质分子受体的结合中van der Walls能(ΔGvdw)和电荷能(ΔEele)贡献了主要能量,非极性自由能(ΔGnp)贡献了少部分能量。上述数据表明,这6个小分子与受体具有良好的结合自由能,且与Ldmthl1的结合模式是稳定可靠的。

      表 2  MM/PBSA法分析6个化合物与Ldmthl1复合体相关的结合自由能

      Table 2.  Analysis of binding free energies associated with the Ldmthl1 complex of six compounds by MM/PBSA method kcal·mol−1

      相关结合自由能
      Binding energy
      罗格列酮
      Rosiglitazone
      麦角甾苷
      Verbascoside
      地奥司明
      Diosmin
      大豆苷
      Daidzin
      异喹啉
      Isoquinoline
      车前子甙
      Plantamajoside
      ΔEele −32.32 −42.53 −15.98 −38.58 −30.29 −39.56
      ΔGvdw −59.85 −47.98 −51.14 −42.57 −41.82 −36.87
      ΔGnp −8.45 −7.03 −6.88 −7.04 −6.44 −6.67
      ΔGPB 40.43 42.32 27.36 36.68 20.48 40.24
      ΔGcavity −8.45 −7.03 −6.88 −7.04 −6.44 −6.67
      ΔGgas −92.17 −90.51 −67.12 −81.15 −72.11 −68.43
      ΔGsol 31.98 35.29 20.48 29.64 10.04 33.57
      TΔS 19.62 15.86 16.89 21.17 27.80 14.85
      ΔGbinda −68.64 −62.25 −53.52 −58.55 −68.51 −41.53
      ΔGbindb −49.02 −46.39 −36.63 −37.38 −40.71 −26.68
        注:总结合自由能的组成成分包括:电荷能(ΔEele),van der Waals能(ΔGvdw),非极性溶解自由能(ΔGnp),极性溶解自由能(ΔGPB),气化能gas(ΔGgasGvdw + ΔEele),溶解自由能solvation(ΔGsolGnp + ΔGPB),(ΔGbinda)结合自由能没有把熵值的影响考虑在内。(ΔGbindb)结合自由能把熵值的影响考虑在内。
        Notes: The components of the total binding energy are also shown: electrostatic (ΔEele), nonpolar solvation (ΔGnp), polar solvation (ΔGPB), gas (ΔGgasGvdw + ΔEele), solvation(ΔGsolGnp + ΔGPB), (ΔGbinda), the entropy term was not included in the total binding free energy. (ΔGbindb), The entropy term was included in the total binding free energy.
    • 6种抑制剂对舞毒蛾幼虫的LC50分别为19.16 μg·g−1、17.58 μg·g−1、6.89 μg·g−1、6.25 μg·g−1、5.27 μg·g−1和2.39 μg·g−1;LC30分别为13.10 μg·g−1、12.63 μg·g−1、4.04 μg·g−1、4.03 μg·g−1、3.56 μg·g−1和1.26 μg·g−1。抑制剂毒力最高的为异喹啉,其次为地奥司明、罗格列酮和大豆苷。

      表 3  6种抑制剂对舞毒蛾3龄幼虫的毒力(48 h)

      Table 3.  Toxicity of six inhibitors on the 3rd instar L. dispar larvae (48 h)

      编号
      Number
      化合物
      Compound
      LC50 95%置信区间
      LC50 95% confidence
      interval /(μg·g−1)
      LC30 95%置信区间
      LC30 95% confidence
      interval /(μg·g−1)
      斜率
      Lope ± SE
      卡方值
      Chi-square value (χ2df))
      VS_328 车前子甙 Verbascoside 19.16(15.88~23.10) 13.10(11.02~15.57) 3.19 ± 0.05 4.59(13)
      VS_190 麦角甾苷 Plantamajoside 17.58(15.06~20.53) 12.63(10.77~14.81) 3.66 ± 0.04 10.27(13)
      VS_111 大豆苷 Daidzin 6.89(5.50~8.65) 4.02(2.87~5.63) 2.24 ± 0.06 6.03(13)
      VS_085 罗格列酮 Rosiglitazone 6.25(5.09~7.66) 4.03(3.25~4.98) 2.77 ± 0.05 3.45(13)
      VS_072 地奥司明 Diosmin 5.27(4.42~6.28) 3.56(2.91~4.35) 3.10 ± 0.04 2.62(13)
      VS_015 异喹啉 Isoquinoline 2.39(1.76~3.25) 1.26(0.79~1.99) 1.88 ± 0.07 5.52(13)
        注:卡方值小于χ2(13,0.05)=22.36,故毒力回归方程与实际相符。
        Note: The chi-square value is less than χ2(13,0.05)=22.36, so the toxicity regression equation is consistent with the actual situation.
    • 不同抑制剂与溴氰菊酯联合作用对舞毒蛾幼虫死亡率影响如表4所示。在溴氰菊酯:抑制剂=1:1的联合处理下处理舞毒蛾幼虫48 h后,各联合处理组幼虫死亡率均显著高于抑制剂单剂处理(P < 0.05,下同),罗格列酮、地奥司明、大豆苷和异喹啉4种抑制剂与溴氰菊酯联用处理组的幼虫死亡率显著高于溴氰菊酯处理组;在溴氰菊酯﹕抑制剂=1﹕2的联合处理下处理舞毒蛾幼虫48 h后,除异喹啉单剂处理组与溴氰菊酯 + 异喹啉联合处理组的舞毒蛾幼虫死亡率无显著性差异外,各联合处理组的幼虫死亡率显著高于抑制剂单剂与溴氰菊酯处理组;在溴氰菊酯﹕抑制剂=2﹕1的联合处理下处理舞毒蛾幼虫48 h后,各联合处理组幼虫死亡率均显著高于抑制剂单剂处理,但与溴氰菊酯单剂处理组无显著性差异。溴氰菊酯与6种抑制剂以不同比例联合处理的复合毒性表现为毒性相加或协同作用。

      表 4  不同比例抑制剂和溴氰菊酯联合处理对舞毒蛾幼虫死亡率的影响及复合毒性评价

      Table 4.  Effect of different proportions of inhibitors and deltamethrin combined treatment on the mortality rate of L. dispar larvae and composite toxicity evaluation

      比例
      Ratio
      处理
      Treatments
      死亡率 mortality /% 复合胁迫表征值
      RI
      复合毒性
      Compound toxicity
      12 h 24 h 36 h 48 h
      1﹕1 二甲基亚砜(DMSO) 0.00c 0.00d 0.00f 0.00g
      车前子甙 0.00c 0.00d 0.00f 0.00g
      麦角甾苷 0.00c 0.00d 0.00f 3.33 ± 4.71g
      罗格列酮 0.00c 0.00d 3.33 ± 4.71ef 13.33 ± 4.71f
      地奥司明 0.00c 0.00d 6.67 ± 4.71e 16.67 ± 4.71de
      大豆苷 0.00c 3.33 ± 4.71cd 6.67 ± 4.71e 16.67 ± 4.71de
      异喹啉 3.33 ± 4.71bc 16.67 ± 4.71b 23.33 ± 4.71b 50.00 ± 8.16c
      溴氰菊酯 0.00c 6.67 ± 4.71c 16.67 ± 4.71cd 33.33 ± 4.71d
      溴氰菊酯 + 车前子甙 0.00c 6.67 ± 4.71c 20.00 ± 8.16c 33.33 ± 4.71d 1.03 相加
      溴氰菊酯 + 麦角甾苷 0.00c 6.67 ± 4.71c 20.00 ± 8.16c 36.67 ± 4.71d 1.11 协同
      溴氰菊酯 + 罗格列酮 0.00c 13.33 ± 4.71b 30.00b 53.33 ± 4.71bc 1.03 相加
      溴氰菊酯 + 地奥司明 6.67 ± 4.71b 33.33 ± 4.71ab 43.33 ± 4.71ab 56.67 ± 4.71bc 1.05 相加
      溴氰菊酯 + 大豆苷 3.33 ± 4.71bc 33.33 ± 4.71ab 43.33 ± 4.71ab 63.33 ± 4.71b 1.12 协同
      溴氰菊酯 + 异喹啉 16.67 ± 4.71a 36.67 ± 4.71a 60.00 ± 8.16a 93.33 ± 4.71a 1.54 协同
      1﹕2 二甲基亚砜(DMSO) 0.00d 0.00g 0.00f 0.00f
      车前子甙 0.00d 0.00g 0.00f 3.33 ± 4.71ef
      麦角甾苷 0.00d 0.00g 0.00f 6.67 ± 4.71e
      罗格列酮 0.00d 3.33 ± 4.71f 13.33 ± 4.71e 36.67 ± 4.71cd
      地奥司明 0.00d 3.33 ± 4.71f 16.67 ± 4.71de 30.00cd
      大豆苷 0.00d 3.33 ± 4.71f 13.33 ± 4.71e 26.67 ± 4.71d
      异喹啉 46.67 ± 4.71b 86.67 ± 4.71b 100.00a 100.00a
      溴氰菊酯 0.00d 6.67 ± 4.71f 16.67 ± 4.71de 23.33 ± 9.43d
      溴氰菊酯 + 车前子甙 0.00d 6.67 ± 4.71f 23.33 ± 4.71d 40.00 ± 8.16c 1.98 协同
      溴氰菊酯 + 麦角甾苷 6.67 ± 4.71d 16.67 ± 4.71e 23.33 ± 4.71d 36.67 ± 4.71cd 1.83 协同
      溴氰菊酯 + 罗格列酮 16.67 ± 4.71c 30.00 ± 8.16de 50.00 ± 8.16c 73.33 ± 4.71bc 1.44 协同
      溴氰菊酯 + 地奥司明 23.33 ± 4.71c 43.33 ± 4.71c 63.33 ± 4.71b 86.67 ± 4.71b 1.26 协同
      溴氰菊酯 + 大豆苷 13.33 ± 4.71cd 33.33 ± 4.71d 56.67 ± 4.71bc 73.33 ± 4.71bc 1.56 协同
      溴氰菊酯 + 异喹啉 80.00 ± 8.16a 100.00a 100.00a 100.00a 1.33 协同
      2﹕1 二甲基亚砜(DMSO) 0.00d 0.00d 0.00d 0.00d
      车前子甙 0.00d 0.00d 0.00d 0.00d
      麦角甾苷 0.00d 0.00d 0.00d 3.33 ± 4.71d
      罗格列酮 0.00d 0.00d 3.33 ± 4.71c 13.33 ± 4.71cd
      地奥司明 0.00d 0.00d 6.67 ± 4.71c 16.67 ± 4.71c
      大豆苷 0.00d 3.33 ± 4.71d 6.67 ± 4.71c 16.67 ± 4.71c
      异喹啉 3.33 ± 4.71d 16.67 ± 4.71c 33.33 ± 4.71b 50.00 ± 8.16b
      溴氰菊酯 46.67 ± 4.71c 80.00 ± 8.16bc 100.00a 100.00a
      溴氰菊酯 + 车前子甙 53.33 ± 4.71bc 86.67 ± 4.71b 100.00a 100.00a 1.03 相加
      溴氰菊酯 + 麦角甾苷 53.33 ± 4.71bc 86.67 ± 4.71b 100.00a 100.00a 1.06 相加
      溴氰菊酯 + 罗格列酮 56.67 ± 4.71bc 90.00ab 100.00a 100.00a 1.02 相加
      溴氰菊酯 + 地奥司明 76.67 ± 4.71ab 96.67 ± 4.71a 100.00a 100.00a 1.06 相加
      溴氰菊酯 + 大豆苷 66.67 ± 4.71b 93.33 ± 4.71ab 100.00a 100.00a 1.05 相加
      溴氰菊酯 + 异喹啉 86.67 ± 4.71a 100.00a 100.00a 100.00a 1.08 相加
        注:采用Duncan分析方法,不同小写字母表示同一时间不同处理间的差异显著性(P < 0.05)。
        Note: The lowercase letters simultaneously show significant differences between treatments by Duncan analysis at 0.05.
    • 本文运用虚拟筛选技术筛选潜在小分子抑制剂,通过分子动力学模拟研究 Ldmthl1 与 6 种化合物的结合模式及结合稳定性,并运用生物测定技术来探究6种小分子抑制剂的杀虫活性以及和溴氰菊酯联用是否具有增效性。首先使用PDB数据库中的Ldmthl同源模板进行建模,但因为同源性小于30%,为了提高模型的准确性,采用AlphaFold2从头建模和胞外域、跨膜-胞内域多模板分别建模两种方法建模,优化模型后进行虚拟筛选,最终筛选出6个小分子化合物作为潜在的小分子抑制剂。

      为了探究Ldmthl1蛋白与6个小分子化合物的结合稳定性,采用分子动力学模拟分析了两者的结合模式,在20 000 ps的分子动力学模拟过程中,6个小分子化合物在10 000 ps后均趋于稳定,可视化结果显示ILE238、GLY239、LEU234、HIS237、CYS334为对接口袋关键氨基酸残基并且形成稳定的氢键和疏水作用力,这些结果表明6种小分子化合物和Ldmthl1蛋白受体间有良好的结合模式。王新阳(2015)基于分子动力学模拟分析了几种抑制剂与几丁质酶的结合情况,通过分析复合物在溶液中的波动情况,最终观察到复合物在40 000 ps处达到平衡稳定状态,从而确定了抑制剂可与几丁质酶稳定结合[28];赵威(2022)运用虚拟筛选技术,获得了18个气味结合蛋白(OBPs)的调节剂,通过分子动力学模拟,发现这18种化合物在与OBPs结合的过程中,轨迹出现短暂的波动,但最终趋于稳定,表明18种化合物是OBPs的潜在调节剂[29],与本文结果类似。结合自由能的计算结果显示,6个小分子化合物与蛋白质分子受体之间具有良好的结合自由能,结合模式稳定,虽然结合过程中极性溶解自由能阻碍了复合体的形成,且非极性自由能与电子能的贡献微乎其微,但van der Waals和电荷能在结合过程中贡献了大量的能量,依然能够形成稳定的复合物。刘蒙蒙(2013)通过分子动力学模拟分析筛选出的潜在抑制剂与昆虫β-N-乙酰己糖胺酶在结合过程中,通过对结合自由能的分析,发现其中van der Waals的贡献值最高,在小分子化合物与蛋白质分子结合的过程中起到了积极作用,而电子能在小分子化合物与蛋白质之间结合的过程中起到消极作用,得出当van der Waals高,电子能小时对受体和配体的结合具有促进作用[30]

      农药使用会导致害虫抗药性的增加,从而降低农药的杀虫效率,因此在生产实践中,常常多种化学药剂混合使用,能够延缓抗药性的产生[31]。马跃敏(2019)通过用致死量LC25苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒素(Cry1Ac)和黄酮联合处理棉铃虫,其死亡率显著增高,表明Cry1Ac和黄酮具有联合增效作用[32]。王紫军(2023)将球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株Bb-YM与四氯虫酰胺按1/3、1/5、1/7的剂量混用后发现对二化螟(Chilo suppressalis W.)幼虫的杀虫效果显著,其增效比分别为494.90、179.63和62.96,增效作用十分明显,混用后致死中时间LT50显著缩短,显著提高杀虫速度[33]。本文首先测定了6种抑制剂对舞毒蛾幼虫毒力,结果显示取食添加抑制剂的人工饲料后舞毒蛾幼虫的存活率显著下降,说明6种抑制剂具有杀虫活性。然后将6种小分子抑制剂与溴氰菊酯按照1﹕1、1﹕2和2﹕1的比例混合添加到人工饲料中饲喂舞毒蛾幼虫。研究结果表明在抑制剂和溴氰菊酯1﹕1和1﹕2的比例下,抑制剂的增效作用显著,而在抑制剂和溴氰菊酯2﹕1的比例下,抑制剂增效作用低于1﹕1和1﹕2比例,推测可能是高浓度的溴氰菊酯影响了抑制剂的增效作用。复合毒力分析表明3种比例下复合胁迫表征值均大于1,6种小分子抑制剂与溴氰菊酯联用后均能对溴氰菊酯杀虫效率产生增效。

    • 本文运用虚拟筛选得到6种潜在的小分子抑制剂,可与Ldmthl1稳定结合,且与溴氰菊酯联用后具有增效作用,可为昆虫蛋白抑制剂及蛋白功能的研究提供理论基础,对开发新型绿色农药增效剂防治舞毒蛾的防治具有重要的指导意义。

参考文献 (33)

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