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生防菌株森吉木霉M75挥发性气体的抑菌活性分析

张铭 朱帆 张辉 程元 谢宪 张星耀 梁军

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生防菌株森吉木霉M75挥发性气体的抑菌活性分析

    作者简介: 张铭,博士,工程师。主要研究方向:园林植物病原菌鉴定及生物防治。E-mail:mingmingzhang2021@126.com.
    通讯作者: 梁军, liangjun@caf.ac.cn
  • 中图分类号: S763.15

Analysis of Antifungal Activity of Volatile Gas from Biocontrol Strain Trichoderma songyi M75

    Corresponding author: Liang Jun, liangjun@caf.ac.cn
  • CLC number: S763.15

  • 摘要: 目的 解析生防菌株森吉木霉M75产生的挥发性有机化合物的成分。 方法 利用顶空固相微萃取气相色谱-质谱联用技术(headspace solid phase microextraction-gas chromatography-massspectrometry, HSSPME-GC-MS)对森吉木霉(Trichoderma songyi)M75产生的挥发性气体中的有机化合物进行成分解析,并对其中的成分进行抑菌活性的检测。 结果 从森吉木霉M75菌株产生的挥发性气体中鉴定出18种化合物,包括醛类、萜类、酮类、烷烃类、芳烃类、酯类等。其中6-戊基-2H-吡喃-酮(6pp)含量最高,相对含量为18.56%,对松球壳孢菌(Sphaeropsis sapinea)抑制效果最好的化合物是芳樟醇,相对含量为5.86%,并且芳樟醇的抑菌谱较广,对多种植物病原菌如金黄壳囊菌(Cytospora chrysosperma)、栗疫菌(Cryphonectria parastica)和链格孢(Alternria sp)也具有较好的抑制效果,抑菌率均达到70.00%以上。 结论 木霉属真菌普遍具有产挥发性有机化合物的能力,本研究成功解析了森吉木霉M75菌株产生的挥发性有机化合物,为木霉的抑菌机制及抑菌物质的代谢等研究提供科学依据,为利用木霉属真菌开发生物防治剂奠定了基础。
  • 图 1  森吉木霉M75挥发性气体对松枯梢病病原菌4-0-5的抑菌活性

    Figure 1.  Antimicrobial activity of volatile gas of T. songyi M75 against S.sapinea 4-0-5

    图 2  芳樟醇对几种病原真菌的抑菌活性

    Figure 2.  Inhibition activity of Linalool against several of plant pathogens

    表 1  森吉木霉M75的气相色谱-质谱采集条件

    Table 1.  Collection conditions of T. songyi M75 by GC-MS

    项目 Items 参数 Parameters
    进样量(Injection Volume) 1 mL
    分流模式(Front Inlet Mode) 不分流
    载气(Carrier Gas) 高纯氦气(纯度99.99%)
    色谱柱(Column)
    柱流速(Column Flow)
    柱箱升温程序(Oven Temperature Ramp)

    前进样口温度(Front Injection Temperature)
    传输线温度(Transfer Line Temperature)
    离子源温度(Ion Source Temperature)
    DB-5MS (30.0 m × 0.25 mm × 0.25 μm)
    1.0 mL·min−1
    40 ℃ 初始温度保持5 min,以5 ℃·min−1升至280 ℃,
    保持5 min不分流进样
    250 ℃
    280 ℃
    230 ℃
    四级杆温度(Quad Temperature) 150 ℃
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    表 2  5种购买的挥发性化合物纯品

    Table 2.  5 kinds of purchased pure volatile compounds

    序号
    Number
    化合物
    Compound
    纯度
    Purity
    沸点
    Boiling point /°C
    密度
    Density/(g·cm−3)
    分子量
    Molecular weight
    保存条件
    Storage condition/°C
    1 (+)-柠檬烯 D-Limonene ≥ 95.0% 177.0 0.800 136.234 2-8
    2 (+)-α-P烯 ( + )-alpha-Pinene ≥ 99.0% 155.0 0.860 136.234 2-8
    3 芳樟醇 Linalool ≥ 97.0% 198.5 0.900 154.250 2-8
    4 Β-雪松烯 ( + )-beta-Cedrene ≥ 98.0% 262.5 0.940 204.351 2-8
    5 6-戊基-2H-吡喃-2-酮 6-Pentyl-2H-pyran-2-one ≥ 96.0% 93.0 1.004 166.217 2-8
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    表 3  森吉木霉M75挥发性气体的抑菌谱

    Table 3.  Antimicrobial activity of volatile gases of T. songyi M75

    序号
    Number
    菌株号
    Strains
    植物病原真菌
    Plant pathogens
    种名
    Species
    抑菌率(%)
    Inhibition rate
    1cfcc 82382围小丛壳菌Glomerella cingulata100.00 ± 0.00 a
    2cfcc 80374犁头霉Absidia sp.100.00 ± 0.00 a
    3cfcc 86526葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea100.00 ± 0.00 a
    4cfcc 83994栗疫菌Cryphonectria parastica100.00 ± 0.00 a
    5cfcc 5171链格孢Alternaria sp.84.64 ± 0.13 b
    6cfcc 86773金黄壳囊孢Cytospora chrysosperma80.78 ± 0.85 c
    7cfcc 84715尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum55.15 ± 1.04 d
    8cfcc 5517枯斑盘多毛菌Pestalotiopsis funerea47.47 ± 1.15 e
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    表 4  森吉木霉M75挥发性气体的GC-MS分析结果

    Table 4.  GC-MS analysis results of volatile gases producted by T. songyi M75

    保留时间(min)
    Retention time
    可能的化合物
    Possible compound
    分子式
    Formula
    物质分类
    Class
    相对含量(%)
    Realtive content
    11.22 正辛醛 Octanal C8H16O 醛 Aldehyde 4.42
    12.06 (+)-柠檬烯 D-Limonene C10H16 萜 Terpenes 0.12
    12.56 (+)-α-P烯 (+)-alpha-Pinene C10H16 萜 Terpenes 1.05
    14.18 芳樟醇 Linalool C10H18O 萜 Terpenes 5.86
    20.17 3-乙基-3-甲基-癸烷 Decane, 3-ethyl-3-methyl- C13H28 烷烃 Alkanes 6.58
    23.53 顺式-α-香柠檬烯 cis-.alpha.-Bergamotene C15H24 萜 Terpenes 1.65
    24.32 6-戊基-2H-吡喃-2-酮 6-Pentyl-2H-pyran-2-one C10H14O2 酮 Ketone 18.56
    24.67 1-甲基-4-(6-甲基庚-5-烯-2-基)环己-1,3-二烯
    1-Methyl-4-(6-methylhept-5-en-2-yl)cyclohexa-1,3-diene
    C15H24 萜 Terpenes 4.35
    25.15 2-[(2R,4aS)-4a,8-二甲基-1,2,3,4,4a,5,6,7-八氢萘-2-基]丙-2-醇
    10-epi-.gamma.-Eudesmol
    C15H26O 萜 Terpenes 4.56
    25.25 氨基甲酸甲酯-2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-甲基苯酚
    Phenol, 2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-4-methyl-, methylcarbamate
    C17H27NO2 芳烃
    Aromatics
    5.52
    25.75 N-(2,3,4-三氟苯甲酰基)-1-丙氨酸-甲酯
    l-Alanine, N-(2,3,4-trifluorobenzoyl)-, methyl ester
    C11H10F3NO3 酯 Ester 3.42
    25.78 Β-雪松烯 1H-3a,7-Methanoazulene, octahydro-3,8,8-
    trimethyl-6-methylene-, [3R-(3.alpha.,3a.beta.,7.beta.,8a.alpha.)]-
    C15H24 萜 Terpenes 3.87
    26.62 d-奈洛利多 d-Nerolidol C15H26O 萜 Terpenes 1.52
    27.56 十六烷 Hexadecane C16H34 烷烃 Alkanes 1.50
    35.79 香紫苏烯Naphthalene, decahydro-1,1,4a-trimethyl-6-
    methylene-5-(3-methylene-4-pentenyl)-, [4aS-(4a.alpha.,5.alpha.,8a.beta.)]-
    C20H32 萜 Terpenes 8.85
    36.55 希宾 Hibaene C20H32 萜 Terpenes 1.54
    39.00 油酸乙酯 Ethyl Oleate C20H38O2 酯 Ester 0.86
    40.59 松柏烯 1,3,6,10-Cyclotetradecatetraene,
    3,7,11-trimethyl-14-(1-methylethyl)-, [S-(E,Z,E,E)]-
    C20H32 萜 Terpenes 0.98
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    表 5  不同浓度的5种挥发性化合物纯品对松球壳孢菌的抑菌活性测定

    Table 5.  Inhibition activities of different concentrations of 5 pure volatile compounds against S. sapinea

    化合物纯品用量
    Dosage/μL
    抑菌率 Inhibition rate/%
    1 2 3 4 5
    5 32.80 ± 0.63 e 42.30 ± 0.27 e 66.50 ± 0.84 e 26.70 ± 1.43 d 54.70 ± 1.23 cd
    10 40.52 ± 0.45 d 50.01 ± 0.38 d 70.53 ± 0.46 d 30.54 ± 1.31 c 55.41 ± 1.05 c
    15 45.71 ± 0.46 c 53.32 ± 0.48 c 77.22 ± 0.85 c 40.05 ± 0.52 bc 60.25 ± 0.85 bc
    20 50.55 ± 0.67 b 56.74 ± 0.75 b 82.71 ± 1.54 b 42.54 ± 0.44 ab 63.83 ± 1.42 b
    25 54.85 ± 0.46 a 62.71 ± 0.42 a 84.05 ± 0.76 a 44.53 ± 0.73 a 69.54 ± 1.15 a
      注:1为(+)-柠檬烯,2为(+)-α-P烯,3为芳樟醇,4为Β-雪松烯,5为6-戊基-2H-吡喃-2-酮
      Notes: 1: D-Limonene, 2: (+)-alpha-Pinene, 3: Linalool, 4: (+)-b-Cedrene, 5: 6-Pentyl-2H-pyran-2-one
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    表 6  芳樟醇对多种植物病原真菌的抑菌活性

    Table 6.  Inhibition activity of Linalool against several of plant pathogens

    序号
    No.
    菌株号
    Strains
    植物病原真菌
    Plant pathogens
    对照组菌落直径
    Colony diameter of control /cm
    处理组菌落直径
    Colony diameter of treatment /cm
    抑菌率/%
    Inhibition rate
    1 cfcc 86773 金黄壳囊孢 7.80 ± 0.20 0.00 ± 0.00 100.00 ± 0.00 a
    2 cfcc 83394 栗疫菌 7.80 ± 0.15 0.78 ± 0.05 90.00 ± 0.30 b
    3 cfcc 5171 链格孢 5.50 ± 0.20 1.60 ± 0.02 70.91 ± 0.40 c
    4 cfcc 82382 围小丛壳菌 4.50 ± 0.03 1.40 ± 0.04 68.89 ± 0.10 cd
    5 cfcc 86526 葡萄座腔菌 8.0 ± 0.15 3.00 ± 0.03 62.50 ± 0.15 d
    6 cfcc 84715 尖孢镰刀菌 3.53 ± 0.05 1.60 ± 0.15 54.67 ± 0.35 e
    7 cfcc 80374 犁头霉 8.50 ± 0.25 4.35 ± 0.12 48.82 ± 0.25 f
    8 cfcc 5517 枯斑盘多毛菌 6.25 ± 0.15 4.00 ± 0.20 37.50 ± 0.85 g
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  • 网络出版日期:  2024-06-06

生防菌株森吉木霉M75挥发性气体的抑菌活性分析

    通讯作者: 梁军, liangjun@caf.ac.cn
    作者简介: 张铭,博士,工程师。主要研究方向:园林植物病原菌鉴定及生物防治。E-mail:mingmingzhang2021@126.com
  • 1. 北京市植物园管理处/北京市花卉园艺工程技术研究中心,北京 100093
  • 2. 中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所,国家林业和草原局森林保护学重点实验室,北京 100091
  • 3. 石家庄学院地理科学与环境学院,河北 石家庄 050035
  • 4. 聊城大学农学与农业工程学院,山东 聊城 252000
  • 5. 昆嵛山森林生态系统国家定位观测研究站,山东 烟台 264100

摘要:  目的 解析生防菌株森吉木霉M75产生的挥发性有机化合物的成分。 方法 利用顶空固相微萃取气相色谱-质谱联用技术(headspace solid phase microextraction-gas chromatography-massspectrometry, HSSPME-GC-MS)对森吉木霉(Trichoderma songyi)M75产生的挥发性气体中的有机化合物进行成分解析,并对其中的成分进行抑菌活性的检测。 结果 从森吉木霉M75菌株产生的挥发性气体中鉴定出18种化合物,包括醛类、萜类、酮类、烷烃类、芳烃类、酯类等。其中6-戊基-2H-吡喃-酮(6pp)含量最高,相对含量为18.56%,对松球壳孢菌(Sphaeropsis sapinea)抑制效果最好的化合物是芳樟醇,相对含量为5.86%,并且芳樟醇的抑菌谱较广,对多种植物病原菌如金黄壳囊菌(Cytospora chrysosperma)、栗疫菌(Cryphonectria parastica)和链格孢(Alternria sp)也具有较好的抑制效果,抑菌率均达到70.00%以上。 结论 木霉属真菌普遍具有产挥发性有机化合物的能力,本研究成功解析了森吉木霉M75菌株产生的挥发性有机化合物,为木霉的抑菌机制及抑菌物质的代谢等研究提供科学依据,为利用木霉属真菌开发生物防治剂奠定了基础。

English Abstract

  • 木霉菌是一类小分子代产谢物的高生产者,在农业领域具有显著的应用效果[1-2],其次级代谢产物如聚酮类化合物等具有抗真菌、细菌和提高植物寄主抗性等功能,已被证明对多种植物病原真菌具有抑制作用[3]。挥发性代谢物,也称为挥发性有机化合物(volatile organic compounds,VOCs),是指分子量小、沸点低、极性低和高蒸气压(>0.1 kPa)的一类有机化合物[4]。研究表明,木霉菌在生长代谢过程中会产生多种挥发性有机化合物,它们的化学成分组成多样,包括脂肪族碳氢化合物、萜烯和脂肪酸等[5]。据报道,木霉菌释放的挥发性有机物在研发生物农药方面发挥着重要作用[6-7],目前,越来越多的木霉菌被用作农业土壤的生物杀菌剂和生物肥料,以促进植物生长。

    本研究分离得到的菌株M75经鉴定是一株森吉木霉(Trichoderma songyi (M.S. Park, S.Y. Oh & Y.W. Lim)),前期研究表明该菌株与松枯梢病病原菌松球壳孢菌(Sphaeropsis sapinea (Fr.) Dyko & B. Sutton)对峙培养后,表现出较强的拮抗活性,且该菌株的发酵液也能抑制多种植物病原菌的生长[8]。但目前还未见有关森吉木霉挥发性气体的研究,因此本研究利用顶空固相微萃取技术HS-SPME,收集森吉木霉M75产生的挥发性气体,利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术对挥发性气体中的有机化合物进行成分分析,并通过购买的几种化合物纯品进行抑菌活性的检测,从中筛选出对松球壳孢菌及其他多种病原真菌具有高效抑菌活性的物质成分,为森吉木霉M75生物抑制剂的有效开发利用提供理论支持。

    • 松枯梢病病原菌松球壳孢菌4-0-5与拮抗真菌森吉木霉M75由中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所森林病理学实验室分离、鉴定和保存。

      其他供试植物病原真菌:金黄壳囊孢(Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr.)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea (Moug.) Ces & De Not)、栗疫菌(Cryphonectria parastica (Murrill) M.E. Barr )、链格孢(Alternaria sp. Nees)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum Smith & Swingle)、围小丛壳菌(Glomerella cingulata (G.F. Atk.) Spauld. & H. Schrenk)、犁头霉(Absidia sp. Tiegh)和枯斑盘多毛菌(Pestalotiopsis funerea (Desm.) Steyaert)均由中国林业微生物菌种保藏管理中心(China Forestry Culture Collection Center,以下简称CFCC)提供。

      主要试剂包括氯化钠(国药集团化学试剂有限公司)、正己烷(德国默克公司)、标准品氘代对二甲苯(浓度为:5 ppm,云南西力生物技术股份有限公司)、(+)-柠檬烯、(+)-α-P烯、芳樟醇、Β-雪松烯、6-戊基-2H-吡喃-酮(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)。

    • 用打孔器打取5 mm直径的M75株菌饼,点接在PDA培养基上表面后,28 ℃恒温培养5 d获得新鲜菌落。打取直径5 mm的新鲜菌饼,接入PDB培养液中(200 mL),180 r·min−1、28 ℃振荡培养4 d,转移至50 mL离心管中,4 ℃、10 000 r·min−1高速冷冻10 min,弃沉淀,收集上清液,经0.45 μm微孔滤膜过滤除菌后,得到森吉木霉M75菌株的无菌发酵滤液。

    • 采用双皿倒扣法[9]检测森吉木霉M75挥发性气体对松球壳孢菌4-0-5的抑菌活性,将M75菌株点接在PDA平板上,28 ℃恒温培养7 d,再另外打取选取新鲜的松球壳孢菌菌饼,接种在新的PDA平板中央,将新平板(即病原菌生长的平板)倒扣在森吉木霉M75的平板上,用保鲜膜将两个培养皿密封,于28 ℃恒温培养,接种了松球壳孢菌4-0-5的培养皿在上方,以未经森吉木霉M75挥发性气体处理的病原菌平板作为对照。每组处理重复3次。于28 ℃恒温培养箱中连续培养4—7 d,然后通过十字交叉法确定出各组病原真菌的菌落扩展直径,计算抑菌率。抑菌率计算公式如下:

      $\begin{split} & \mathrm{抑}\mathrm{菌}\mathrm{率}(\mathrm{\%})=\\ & \frac{\mathrm{病}\mathrm{原}\mathrm{菌}\mathrm{对}\mathrm{照}\mathrm{菌}\mathrm{落}\mathrm{直}\mathrm{径}(\mathrm{C}\mathrm{K})-\mathrm{处}\mathrm{理}\mathrm{菌}\mathrm{落}\mathrm{直}\mathrm{径}(\mathrm{T}\mathrm{R})}{\mathrm{病}\mathrm{原}\mathrm{菌}\mathrm{对}\mathrm{照}\mathrm{菌}\mathrm{落}\mathrm{直}\mathrm{径}(\mathrm{C}\mathrm{K})}\\ & \times 100 \end{split} $

    • 将8种供试植物病原真菌作为靶标真菌,检测森吉木霉M75挥发性气体的抑菌活性,抑菌率的计算参照1.2.2中的方法。

    • 用打孔器取森吉木霉M75菌块(直径5mm)置于PDA培养基中,28 ℃暗培养5 d,收集50 mg菌丝体置于−80 ℃冷冻24 h。将菌丝体从−80 ℃冰箱中取出后,置于液氮中充分研磨破碎,涡旋混合均匀后,取1.0 mL样品于顶空瓶中,分别加入饱和NaCl溶液,10 μL内标溶液,采用全自动顶空固相微萃取(Automatic headspace solid phase microextraction)即HS-SPME进行样本萃取,以供GC-MS分析。

    • 进样参数如下:老化温度250 ℃,持续5 min;加热温度60 ℃,持续12 min;吸附时间20 min;解析5 min;进样后老化5 min,重复进行3次,以空白顶空瓶作为对照。相关采集条件详见表1

      表 1  森吉木霉M75的气相色谱-质谱采集条件

      Table 1.  Collection conditions of T. songyi M75 by GC-MS

      项目 Items 参数 Parameters
      进样量(Injection Volume) 1 mL
      分流模式(Front Inlet Mode) 不分流
      载气(Carrier Gas) 高纯氦气(纯度99.99%)
      色谱柱(Column)
      柱流速(Column Flow)
      柱箱升温程序(Oven Temperature Ramp)

      前进样口温度(Front Injection Temperature)
      传输线温度(Transfer Line Temperature)
      离子源温度(Ion Source Temperature)
      DB-5MS (30.0 m × 0.25 mm × 0.25 μm)
      1.0 mL·min−1
      40 ℃ 初始温度保持5 min,以5 ℃·min−1升至280 ℃,
      保持5 min不分流进样
      250 ℃
      280 ℃
      230 ℃
      四级杆温度(Quad Temperature) 150 ℃
    • GC-MS分析获取的原始数据文件首先由MassHunter软件(Agilent)进行峰提取,检索NIST11标准谱质谱图库,获得特征峰的质荷比、保留时间和峰面积等信息[10],然后将再根据离子流峰面积归一法计算每种成分的相对百分含量[11]。其中保留指数计算,并对单个Peak进行过滤,只保留单组空值不多于50%或所有组中空值不多于50%的峰面积数据,利用内标归一化进行数据标准化处理。

    • 从市面上购买5种由GC-MS分析鉴定出的森吉木霉M75挥发性化合物纯品(表2),分别检测它们对松枯梢病病原菌松球壳孢菌4-0-5的抑菌活性。首先制备PDA平板,用打孔器选取直径5 mm的新鲜的松球壳孢菌点接在平板中央,其次在培养基平板边缘划取大小约为1 cm × 1 cm的方块,将其取出弃用,在此处嵌入已灭菌的1.5 mL离心管的管盖,用移液枪吸取不同体积的5种化合物纯品,将其分别加入管盖内,最后用双层封口膜将培养皿封好,于28 ℃恒温培养箱中培养。每种化合物纯品设置5、10、15、20、25 μL四个梯度,以在离心管管盖上加入同等体积的无菌水作为对照,每个处理重复3次。采用十字交叉法动态测量每种化合物纯品对松球壳孢菌的抑制效果,计算抑菌率,抑菌率计算公式同1.2.2。

      表 2  5种购买的挥发性化合物纯品

      Table 2.  5 kinds of purchased pure volatile compounds

      序号
      Number
      化合物
      Compound
      纯度
      Purity
      沸点
      Boiling point /°C
      密度
      Density/(g·cm−3)
      分子量
      Molecular weight
      保存条件
      Storage condition/°C
      1 (+)-柠檬烯 D-Limonene ≥ 95.0% 177.0 0.800 136.234 2-8
      2 (+)-α-P烯 ( + )-alpha-Pinene ≥ 99.0% 155.0 0.860 136.234 2-8
      3 芳樟醇 Linalool ≥ 97.0% 198.5 0.900 154.250 2-8
      4 Β-雪松烯 ( + )-beta-Cedrene ≥ 98.0% 262.5 0.940 204.351 2-8
      5 6-戊基-2H-吡喃-2-酮 6-Pentyl-2H-pyran-2-one ≥ 96.0% 93.0 1.004 166.217 2-8
    • 所获数据结果使用Excel 2010和 SPSS 26.0软件进行统计分析。

    • 森吉木霉M75产生的挥发性气体对松球壳孢菌4-0-5的抑菌活性结果如图1所示。

      图  1  森吉木霉M75挥发性气体对松枯梢病病原菌4-0-5的抑菌活性

      Figure 1.  Antimicrobial activity of volatile gas of T. songyi M75 against S.sapinea 4-0-5

      在处理4 d后,对照组菌丝正常生长扩展,而经M75处理的病原菌菌丝无法正常生长,被抑制率达100%。此后,将处理组上方的森吉木霉M75平皿拆下,再继续观察,发现被抑制的松球壳孢菌菌丝的生长均无明显变化,未见有新的菌丝长出。说明森吉木霉M75菌株产生的挥发性气体能显著抑制松枯梢病病原菌菌丝的生长,且在解除限制后,病原菌菌丝也无法继续正常生长。

    • 利用双皿倒扣法测定了森吉木霉M75挥发性气体对8种常见的植物病原真菌的抑菌活性,结果表明,森吉木霉M75挥发性气体对这8种常见的植物病原真菌均具有不同程度的抑菌活性,抑菌效果在47.47%~100.00%之间(表3)。其中,对围小丛壳菌、犁头霉、葡萄座腔菌、栗疫菌的抑菌活性最高,抑菌率达到100%,在处理5 d后,对照组中的病原菌菌落正常生长,其中:围小丛壳菌菌落直径为3.70 cm、犁头霉菌落直径为6.10 cm、葡萄座腔菌菌落直径为6.43 cm、栗疫菌菌落直径为7.07 cm,但在森吉木霉M75挥发性气体的抑制下,以上四种病原菌的菌落都无法正常生长扩展(试验组),菌落直径均为0 cm,但对枯斑盘多毛菌的抑制效果最差,抑菌率为47.47%。这表明森吉木霉M75所产生的挥发性气体的抑菌谱较为广泛,对多种植物病原真菌均有不同程度的抑制菌丝生长的作用。

      表 3  森吉木霉M75挥发性气体的抑菌谱

      Table 3.  Antimicrobial activity of volatile gases of T. songyi M75

      序号
      Number
      菌株号
      Strains
      植物病原真菌
      Plant pathogens
      种名
      Species
      抑菌率(%)
      Inhibition rate
      1cfcc 82382围小丛壳菌Glomerella cingulata100.00 ± 0.00 a
      2cfcc 80374犁头霉Absidia sp.100.00 ± 0.00 a
      3cfcc 86526葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea100.00 ± 0.00 a
      4cfcc 83994栗疫菌Cryphonectria parastica100.00 ± 0.00 a
      5cfcc 5171链格孢Alternaria sp.84.64 ± 0.13 b
      6cfcc 86773金黄壳囊孢Cytospora chrysosperma80.78 ± 0.85 c
      7cfcc 84715尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum55.15 ± 1.04 d
      8cfcc 5517枯斑盘多毛菌Pestalotiopsis funerea47.47 ± 1.15 e
    • 采用全自动顶空微萃取技术HS-SPME对森吉木霉M75挥发性气体进行萃取,利用气相色谱-质谱联用仪GC-MS对样本进行成分分析,经NIST05数据库检索比对,共识别到18种挥发性化合物,其中包括醛类、萜类、酮类、烷烃类、芳烃类、酯类等,其中,醛类1种,相对含量4.42%;萜类有11种,相对含量34.35%;酮类1种,相对含量18.56%;烷烃类2种,相对含量8.08%;芳烃类1种,相对含量为5.52%;酯类物质2种,相对含量为4.28%。这18种挥发性有机化合物占总挥发性气体的75.21%。其中6-戊基-2H-吡喃-2-酮的相对含量最高,为18.56%,其次为香紫苏烯,相对含量为8.85%,相对含量最低的组分是(+)-柠檬烯,仅为0.12%(表4)。

      表 4  森吉木霉M75挥发性气体的GC-MS分析结果

      Table 4.  GC-MS analysis results of volatile gases producted by T. songyi M75

      保留时间(min)
      Retention time
      可能的化合物
      Possible compound
      分子式
      Formula
      物质分类
      Class
      相对含量(%)
      Realtive content
      11.22 正辛醛 Octanal C8H16O 醛 Aldehyde 4.42
      12.06 (+)-柠檬烯 D-Limonene C10H16 萜 Terpenes 0.12
      12.56 (+)-α-P烯 (+)-alpha-Pinene C10H16 萜 Terpenes 1.05
      14.18 芳樟醇 Linalool C10H18O 萜 Terpenes 5.86
      20.17 3-乙基-3-甲基-癸烷 Decane, 3-ethyl-3-methyl- C13H28 烷烃 Alkanes 6.58
      23.53 顺式-α-香柠檬烯 cis-.alpha.-Bergamotene C15H24 萜 Terpenes 1.65
      24.32 6-戊基-2H-吡喃-2-酮 6-Pentyl-2H-pyran-2-one C10H14O2 酮 Ketone 18.56
      24.67 1-甲基-4-(6-甲基庚-5-烯-2-基)环己-1,3-二烯
      1-Methyl-4-(6-methylhept-5-en-2-yl)cyclohexa-1,3-diene
      C15H24 萜 Terpenes 4.35
      25.15 2-[(2R,4aS)-4a,8-二甲基-1,2,3,4,4a,5,6,7-八氢萘-2-基]丙-2-醇
      10-epi-.gamma.-Eudesmol
      C15H26O 萜 Terpenes 4.56
      25.25 氨基甲酸甲酯-2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-甲基苯酚
      Phenol, 2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-4-methyl-, methylcarbamate
      C17H27NO2 芳烃
      Aromatics
      5.52
      25.75 N-(2,3,4-三氟苯甲酰基)-1-丙氨酸-甲酯
      l-Alanine, N-(2,3,4-trifluorobenzoyl)-, methyl ester
      C11H10F3NO3 酯 Ester 3.42
      25.78 Β-雪松烯 1H-3a,7-Methanoazulene, octahydro-3,8,8-
      trimethyl-6-methylene-, [3R-(3.alpha.,3a.beta.,7.beta.,8a.alpha.)]-
      C15H24 萜 Terpenes 3.87
      26.62 d-奈洛利多 d-Nerolidol C15H26O 萜 Terpenes 1.52
      27.56 十六烷 Hexadecane C16H34 烷烃 Alkanes 1.50
      35.79 香紫苏烯Naphthalene, decahydro-1,1,4a-trimethyl-6-
      methylene-5-(3-methylene-4-pentenyl)-, [4aS-(4a.alpha.,5.alpha.,8a.beta.)]-
      C20H32 萜 Terpenes 8.85
      36.55 希宾 Hibaene C20H32 萜 Terpenes 1.54
      39.00 油酸乙酯 Ethyl Oleate C20H38O2 酯 Ester 0.86
      40.59 松柏烯 1,3,6,10-Cyclotetradecatetraene,
      3,7,11-trimethyl-14-(1-methylethyl)-, [S-(E,Z,E,E)]-
      C20H32 萜 Terpenes 0.98
    • 不同浓度的5种挥发性化合物纯品对松球壳孢菌4-0-5菌株的抑菌活性如表5所示,在施药剂量为5 μL时,这5种化合物纯品的抑菌率均没有超过70.00%,说明此时施药剂量过小,而随着施药剂量逐渐加大,这几种挥发性化合物纯品对松球壳孢菌的抑制效果均逐渐加强。当每皿施药量为20 μL(内径9 mm的培养皿),几种挥发性化合物的抑菌率为芳樟醇(抑菌率82.71%)>6-戊基-2H-吡喃-2-酮(抑菌率63.83%)>(+)-α-P烯(抑菌率56.74%)>(+)-柠檬烯(抑菌率50.55%)>Β-雪松烯(抑菌率42.54%)。通过对比分析这5种挥发性化合物对松球壳孢菌的抑菌活性发现,第3组化合物芳樟醇的抑菌活性最强,当施药剂量为15 μL时,可达到75.00%以上的抑制率,当施药量逐渐加大时,抑菌活性也随之相应提高,因此推测松球壳孢菌对芳樟醇这一挥发性化合物较为敏感,所以选择抑菌效果最好的挥发性化合物芳樟醇进行下一步试验。

      表 5  不同浓度的5种挥发性化合物纯品对松球壳孢菌的抑菌活性测定

      Table 5.  Inhibition activities of different concentrations of 5 pure volatile compounds against S. sapinea

      化合物纯品用量
      Dosage/μL
      抑菌率 Inhibition rate/%
      1 2 3 4 5
      5 32.80 ± 0.63 e 42.30 ± 0.27 e 66.50 ± 0.84 e 26.70 ± 1.43 d 54.70 ± 1.23 cd
      10 40.52 ± 0.45 d 50.01 ± 0.38 d 70.53 ± 0.46 d 30.54 ± 1.31 c 55.41 ± 1.05 c
      15 45.71 ± 0.46 c 53.32 ± 0.48 c 77.22 ± 0.85 c 40.05 ± 0.52 bc 60.25 ± 0.85 bc
      20 50.55 ± 0.67 b 56.74 ± 0.75 b 82.71 ± 1.54 b 42.54 ± 0.44 ab 63.83 ± 1.42 b
      25 54.85 ± 0.46 a 62.71 ± 0.42 a 84.05 ± 0.76 a 44.53 ± 0.73 a 69.54 ± 1.15 a
        注:1为(+)-柠檬烯,2为(+)-α-P烯,3为芳樟醇,4为Β-雪松烯,5为6-戊基-2H-吡喃-2-酮
        Notes: 1: D-Limonene, 2: (+)-alpha-Pinene, 3: Linalool, 4: (+)-b-Cedrene, 5: 6-Pentyl-2H-pyran-2-one
    • 从以上5种挥发性化合物中筛选出1种对松球壳孢菌具有显著抑制作用的成分,芳樟醇,当固定施药量为每皿20 μL时(测定培养4 d后的菌落直径),对以下8种植物病原真菌均具有一定的抑菌活性(表6图2)。对金黄壳囊孢的抑菌率为100.00%,能完全抑制其菌丝的生长和菌落的扩展;对栗疫菌的抑菌活性为90.00%,对链格孢、围小丛壳菌和葡萄座腔菌的抑制率分别为70.91%、68.89%和62.50%,均具有较好的抑制作用。但对尖孢镰刀菌、犁头霉和枯斑盘多毛菌的抑制效果不甚理想,抑菌率分别为54.67%、48.82%和37.50%。此外,将盛有芳樟醇的离心管盖取出后,再继续连续观察3 d后,发现被芳樟醇抑制的金黄壳囊孢和栗疫菌的菌落无显著变化,未观察到有新的菌丝生长,其他几种真菌在接触芳樟醇的抑制后,菌落均有不同程度的生长扩展,但与对照组相比速度缓慢。

      表 6  芳樟醇对多种植物病原真菌的抑菌活性

      Table 6.  Inhibition activity of Linalool against several of plant pathogens

      序号
      No.
      菌株号
      Strains
      植物病原真菌
      Plant pathogens
      对照组菌落直径
      Colony diameter of control /cm
      处理组菌落直径
      Colony diameter of treatment /cm
      抑菌率/%
      Inhibition rate
      1 cfcc 86773 金黄壳囊孢 7.80 ± 0.20 0.00 ± 0.00 100.00 ± 0.00 a
      2 cfcc 83394 栗疫菌 7.80 ± 0.15 0.78 ± 0.05 90.00 ± 0.30 b
      3 cfcc 5171 链格孢 5.50 ± 0.20 1.60 ± 0.02 70.91 ± 0.40 c
      4 cfcc 82382 围小丛壳菌 4.50 ± 0.03 1.40 ± 0.04 68.89 ± 0.10 cd
      5 cfcc 86526 葡萄座腔菌 8.0 ± 0.15 3.00 ± 0.03 62.50 ± 0.15 d
      6 cfcc 84715 尖孢镰刀菌 3.53 ± 0.05 1.60 ± 0.15 54.67 ± 0.35 e
      7 cfcc 80374 犁头霉 8.50 ± 0.25 4.35 ± 0.12 48.82 ± 0.25 f
      8 cfcc 5517 枯斑盘多毛菌 6.25 ± 0.15 4.00 ± 0.20 37.50 ± 0.85 g

      图  2  芳樟醇对几种病原真菌的抑菌活性

      Figure 2.  Inhibition activity of Linalool against several of plant pathogens

    • 近年来,测定挥发性有机化合物的方法和分析技术有了很大的发展和提升[12-13],应用最为广泛的提取方法主要是顶空固相微萃取法(HS-SPME),因其操作简便,需要的样品量少,萃取时间短,高灵敏度,并且还能最大化将挥发性物质物质萃取出来[14]。气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术因其可靠、经济,并且能高效准确的分离、鉴定和量化挥发性气体中的物质成分,在挥发性气体的识别和组分分析中逐渐占据主导地位[15-17]。这一技术进步对微生物和真菌等的挥发性气体的分析也产生了巨大影响,越来越多的物种及其挥发性产物被广泛研究和鉴定。因此本研究采用固相顶空微萃取-气相色谱质谱联用HS-SPME-GC-MS测定方法,对森吉木霉M75菌株挥发性气体中的物质成分进行萃取、分析和鉴定。

      到目前为止,已从木霉菌属真菌(Trichoderma)的挥发性气体中鉴定出480多种物质。大量的研究表明,木霉属真菌释放的这些挥发性气体被证实与真菌的拮抗活性密切相关,它们可以显著抑制多种植物病原真菌和木材腐朽真菌菌丝体的生长[18-20],这取决于木霉菌的种类、培养时间,并与植物的发育阶段及处理时间等多方面的因素[21-22]。同时,真菌挥发性有机化合物通常是以多种化合物的混合物的形式存在,并且真菌具有复杂的气味特征,其产生的化合物种类通常具有物种特异性甚至是菌株特异性[23-24]。椰子气味挥发性物质6-戊基-2H-吡喃-酮(6PP)是最早从木霉菌种提取的挥发性化合物之一[25],在本研究中,在森吉木霉M75挥发性气体中成功鉴定了18种挥发性化合物,包括醛类、萜类、酮类、烷烃类、芳烃类、酯类等。同时,从森吉木霉M75菌株的挥发性气体中也鉴定出6PP,并且6PP的含量占比最高,相对含量为18.56%,但经过抑菌活性试验测定,在添加量为每皿25 μL时,6-戊基-2H-吡喃-酮对松球壳孢菌的抑菌效果为69.50%,抑菌效果一般,此时同等添加剂量的挥发性化合物芳樟醇对松球壳孢菌的抑菌作用达84.05%。在此之前,也有大量研究表明,芳樟醇是一种对多种植物病原真菌具有良好的抑菌效果的广谱抗菌剂,对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌等具有抑菌活性[26-27]。GUO等通过研究芳樟醇对荧光假单胞杆菌的抗菌活性时发现,芳樟醇可以破坏细胞结构,削弱病原菌的呼吸代谢系统的能力[28]。HE等对芳樟醇抑制李斯特菌的研究过程中发现,经芳樟醇处理后,李斯特菌的代谢产物发生了显著变化,氨基酸含量降低,明确了芳樟醇的杀菌机制是使病原菌的代谢途径产生紊乱[29]

      因此,虽然以往的研究表明,6-戊基-2H-吡喃-酮对多种植物病原真菌具有抑制作用,但本研究中发现,森吉木霉M75挥发性气体中对松球壳孢菌抑制效果最好的化合物纯品是芳樟醇,并且芳樟醇对多种植物病原真菌的抑制效果良好,它能显著抑制金黄壳囊孢和栗疫菌的生长,表明芳樟醇具有强大的抑菌活性,而森吉木霉M75菌株也具有较高的开发利用潜力和生防价值。

    • 本研究采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法(HS-SPME-GC-MS)对森吉木霉M75的挥发性气体成分进行萃取、鉴定和分析,成功鉴定了18种化合物,包括醛类、萜类、酮类、烷烃类、芳烃类、酯类等。其中6-戊基-2H-吡喃-酮含量最高,相对含量为18.56%,但对松球壳孢菌抑制效果最好的化合物是芳樟醇,相对含量为5.86%,并且芳樟醇对金黄壳囊菌、栗疫菌和链格孢也具有较好的抑制效果,抑菌率达到70.00%以上。

参考文献 (29)

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