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杜仲胶颗粒提取纯化及胶颗粒显微观察研究

杨正伟 秦利军 赵德刚

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杜仲胶颗粒提取纯化及胶颗粒显微观察研究

    通讯作者: 赵德刚, dgzhao@gzu.edu.cn
  • 基金项目:

    贵州省研究生导师工作室建设项目 黔教研合GZS字[2016]03

    贵州省生物学一流学科建设项目 GNYL[2017]009

    国家自然科学基金“杜仲橡胶颗粒蛋白编码基因克隆及功能分析” 31870285

    “十二五”农村领域国家科技计划课题“杜仲功能基因组研究与应用” 2013AA102605-05

  • 中图分类号: S759.3

Extraction, Purification and Microscopic Observation of Rubber Particles Extracted from Eucommia ulmoides

    Corresponding author: De-gang ZHAO, dgzhao@gzu.edu.cn
  • CLC number: S759.3

  • 摘要: 目的 建立快速、简便、重复性好、得率高的杜仲胶颗粒提取技术,为进一步分析胶颗粒膜蛋白、脂肪酸、糖脂等组成及杜仲橡胶分子量奠定基础。 方法 以杜仲叶片和翅果为材料,利用不同离心条件及研磨次数探究杜仲胶颗粒得率,并结合光镜与电镜观察结果,探讨适合从不同杜仲组织器官中提取胶颗粒的最优条件。 结果 杜仲组织(叶片或翅果)液氮经速冻、反复研磨捣碎6次过滤10次,在4℃条件下以5 000 g离心力,45度定角离心10 min,并反复漂洗8次得到的杜仲胶颗粒含量最高。在此条件下,以10月采摘的杜仲叶和翅果为材料,提取的杜仲胶颗粒含量可分别达3.70 g·kg-1叶片、5.37 g·kg-1翅果。进一步观察发现,不论是杜仲叶片或翅果随着其发育的成熟,组织中胶颗粒粒径大小和积累量均呈现先增加后稳定的变化趋势。杜仲胶颗粒在光镜和电镜下呈球形,胶颗粒间粒径大小差异较大。以10月杜仲叶、翅果及树皮为例,小胶颗粒(1~4 μm)分别占39%,53%,98.38%,中等胶颗粒(4~7 μm)分别占38%,34%,0.12%,大胶颗粒(7~11 μm)分别占23%,13%,0.05%。 结论 本研究建立的杜仲胶颗粒提取技术较为快捷,得率高,可快速对不同时期不同组织器官的杜仲胶颗粒进行提取。
  • 图 1  不同离心条件对杜仲胶颗粒提取的影响

    Figure 1.  Effect of different centrifugation conditions on extraction ratio of E.ulmoides rubber particles

    图 2  不同研磨次数对胶颗粒提取率的影响

    Figure 2.  Effect of grinding numbers on the extraction rate of E. ulmoides rubber particles

    图 3  不同月份杜仲叶片和翅果胶颗粒的积累变化

    Figure 3.  Accumulation of rubber particles in E.ulmoides leaves and samara in different months

    图 4  杜仲翅果胶颗粒粒径的变化规律

    Figure 4.  Variation of particle sizer of E.ulmoides rubber particles in samara

    图 5  杜仲叶片胶颗粒粒径的变化规律

    Figure 5.  Variation of particle size of E.ulmoides rubber particles in leaves

    图 6  杜仲叶、翅果及树皮中胶颗粒显微观察

    Figure 6.  Microscopic observation of the E. ulmoides rubber particles separated from leaves, samara and barks

  • [1] 梅蛟, 杨帆.杜仲治疗高血压研究进展[J].世界最新医学信息文摘, 2018, 18(81):35-36.

    [2] 杜红岩.杜仲优质高产栽培[M].北京:中国林业出版社, 1996:215-219.

    [3] 杜红岩, 赵戈, 卢绪奎.论我国杜仲产业化与培育技术的发展[J].林业科学研究, 2000, 13(5):554-561. doi: 10.3321/j.issn:1001-1498.2000.05.018

    [4] 赵德刚, 韩玉珍, 傅永福, 等.杜仲胶生物合成相关蛋白质的研究[J].中国农业大学学报, 1999, 4(1):114. doi: 10.3321/j.issn:1007-4333.1999.01.032

    [5] 严瑞芳.一种古老而又年轻的天然高分子——杜仲胶[J].高分子通报, 1989(2):39-41.

    [6] 傅玉成.杜仲胶记忆材料的性质与应用[J].高分子材料科学与工程, 1992(4):123-126.

    [7] 卢敏, 胡正海, 田兰馨.杜仲茎韧皮部超微结构的初步研究[J].浙江林学院学报, 1990, 7(4):316-321.

    [8] 田兰馨, 卢敏, 胡正海.杜仲含胶细胞发生和发育的研究[J].植物学报, 1990, 32(1):1-6. doi: 10.3321/j.issn:1000-4025.1990.01.001

    [9] 杜兰英, 杜红岩, 乌云塔娜, 等.杜仲树皮含胶特性的个体变异规律[J].林业科学研究, 2005, 18(2):169-172. doi: 10.3321/j.issn:1001-1498.2005.02.012

    [10] 杜红岩, 谢碧霞, 邵松梅.杜仲胶研究的进展与发展前景[J].中南林学院学报, 2003, 23(4):95-99. doi: 10.3969/j.issn.1673-923X.2003.04.009

    [11] 杜红岩, 赵戈, 卢绪奎.论我国杜仲产业化与培训技术的发展[J].林业科学研究, 2000, 13(5):554-561. doi: 10.3321/j.issn:1001-1498.2000.05.018

    [12] 马娟, 林永慧, 刘彪, 等.我国杜仲胶的发展现状与展望[J].安徽农业科学, 2012, 40(6):3396-3398. doi: 10.3969/j.issn.0517-6611.2012.06.070

    [13]

    Tangpakdee J, Tanaka Y, Shiba K I, et al. Structure and biosynthesis of trans-polyisoprene from Eucommia ulmoides[J]. Phytochemistry, 1997, 45(1):75-80.
    [14] 朱峰, 岳红, 祖恩峰, 等.新型功能材料杜仲胶的研究与应用[J].安徽大学学报:自然科学版, 2005, 29(3):89-94.

    [15]

    Dickenson P B. Electron microscopical studies of latex vessel system of Hevea brasiliensis[J]. Rubber Research Institute of Malaya Journal, 1969, 21(1):543-559.
    [16] 段翠芳, 聂智毅, 曾日中.橡胶粒子膜蛋白双向电泳体系的建立和质谱初步分析[J].热带作物学报, 2006, 27(3):22-29. doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2006.03.005

    [17] 史敏晶, 吴继林, 郝秉中, 等.橡胶树橡胶粒子起源的超微结构分析[J].林业科学, 2016, 52(2):114-119.

    [18]

    Siler D J, Goodrich T M, Konish K. Composition of rubber particles of Hevea brasiliensis, Parthenuim argertatum, Ficus elastica and Euphorbia lactiflua indicates unconventional surface structure[J]. Plant Physiology Biochemistry, 1997, 35:881-889.
    [19]

    Cornish K, Windle W J J. Rubber particles from four different species, examined by transmission electron microscopy and electron-paramagnetic-resonance spin labeling, are found to consist of a homogeneous rubber core enclosed by a contiguous, monolayer biomembrane[J]. Planta, 1999, 210(1):85-96. doi: 10.1007/s004250050657
    [20] 王敏杰, 韩玉珍, 刘卫平, 等.杜仲胶颗粒结合蛋白的分离、纯化及抗体制备[J].林业科学, 2003, 39(4):23-29. doi: 10.3321/j.issn:1001-7488.2003.04.004

    [21]

    Suzuki N, Uefuji H, Nishikawa T, et al. Construction and analysis of EST libraries of the trans-polyisoprene producing plant, Eucommia ulmoides Oliver[J]. Planta, 2012, 236(5):1405-1417. doi: 10.1007/s00425-012-1679-x
    [22]

    Wuyun T N, Wang L, Liu H, et al. The hardy rubber tree genome provides insights into the evolution of polyisoprene biosynthesis[J]. Molecular Plant, 2018, 11(3):429-442. doi: 10.1016/j.molp.2017.11.014
    [23] 王惠.杜仲胶粒的分离纯化与胶粒结合蛋白的分析[D].北京: 北京林业大学, 2006.

    [24] 周莉英, 黎斌, 苏印泉.杜仲含胶细胞形态特征的研究[J].西北植物学报, 2001, 21(3):566-569, 619-620. doi: 10.3321/j.issn:1000-4025.2001.03.028

    [25]

    Nakazawa Y, Bamba T, Takeda T, et al. Production of eucommia-rubber from Eucommia ulmoides Oliv. (hardy rubber tree)[J]. Plant Biotechnology, 2009, 26(1):71-79. doi: 10.5511/plantbiotechnology.26.71
  • [1] 杜红岩杜兰英李芳东谢碧霞 . 杜仲果实含胶特性的个体变异规律. 林业科学研究, 2004, 17(6): 706-710.
    [2] 杜兰英杜红岩乌云塔娜杨绍彬谢碧霞 . 杜仲树皮含胶特性的个体变异规律. 林业科学研究, 2005, 18(2): 169-172.
    [3] 李芳东乌云塔娜杜红岩 . 杜仲高产胶无性系遗传参数估计与改良效果分析. 林业科学研究, 2007, 20(4): 458-463.
    [4] 刘攀峰杜红岩乌云塔娜杜兰英孙志强 . 杜仲HDR基因全长cDNA克隆与序列分析. 林业科学研究, 2013, 26(4): 447-453.
    [5] 杜红岩赵戈卢绪奎 . 论我国杜仲产业化与培育技术的发展. 林业科学研究, 2000, 13(5): 554-561.
    [6] 杜红岩李钦赫锦锦刘昌勇刘攀峰 . 不同变异类型杜仲皮中几种主要活性成分含量的比较. 林业科学研究, 2011, 24(2): 230-233.
    [7] 吴敏杜红岩乌云塔娜刘攀峰荆腾 . 杜仲基因组微卫星特征及SSR标记开发. 林业科学研究, 2015, 28(3): 387-393.
    [8] 黄海燕杜红岩乌云塔娜朱高浦 . 基于SSR分子标记的杜仲遗传多样性体系建立. 林业科学研究, 2013, 26(6): 795-799.
    [9] 吴敏赵阳马志刚刘攀峰杜红岩孙志强 . 果园化栽培模式杜仲雄花、果实和叶片产量的调查分析. 林业科学研究, 2014, 27(2): 270-276.
    [10] 刘攀峰杜红岩乌云塔娜黄海燕朱高浦 . 杜仲1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因cDNA全长克隆与序列分析. 林业科学研究, 2012, 25(2): 195-200.
    [11] 朱景乐李芳东杜红岩王彬 . 三个观赏型杜仲无性系叶片色素含量比较. 林业科学研究, 2014, 27(4): 562-564.
    [12] 杜红岩杜兰英李芳东 . 杜仲果实内杜仲胶形成积累规律的研究. 林业科学研究, 2004, 17(2): 185-191.
    [13] 杜庆鑫刘攀峰庆军杜红岩 . 杜仲雄花形态性状的遗传多样性分析. 林业科学研究, 2016, 29(5): 670-675.
    [14] 董尚胜翁蔚查森俊童启庆 . 杜仲茶风味化学的研究 Ⅲ.复火对杜仲红茶品质成分的影响. 林业科学研究, 2001, 14(1): 73-77.
    [15] 董尚胜翁蔚韩颖生童启庆 . 杜仲茶风味化学的研究Ⅱ.复火对杜仲绿茶品质成分的影响. 林业科学研究, 2000, 13(1): 93-96.
    [16] 周政贤谢双喜 . 杜仲人工林生物量及生产力研究. 林业科学研究, 1994, 7(6): 646-651.
    [17] 王鹤松张劲松孟平高峻任庆福贾长荣 . 华北石质山区杜仲人工林蒸腾特征及水分供求关系. 林业科学研究, 2008, 21(4): 475-480.
    [18] . 杜仲人工林蒸腾时间演变的分形特征及可预报时长. 林业科学研究, 2009, 22(6): 807-812.
    [19] 杜红岩李钦李福海孙彦超杜兰英 . 杜仲种仁桃叶珊瑚苷含量的测定及积累规律. 林业科学研究, 2009, 22(5): 744-746.
    [20] 魏艳秀刘攀峰杜庆鑫杜红岩 . 不同种质杜仲叶中多酚和黄酮含量差异性分析. 林业科学研究, 2016, 29(4): 529-535.
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-03-10
  • 录用日期:  2019-07-01
  • 刊出日期:  2019-12-01

杜仲胶颗粒提取纯化及胶颗粒显微观察研究

    通讯作者: 赵德刚, dgzhao@gzu.edu.cn
  • 1. 贵州大学生命科学学院, 农业生物工程研究院, 山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室, 贵州 贵阳 550025
  • 2. 贵州省农业科学院, 贵州 贵阳 550006
基金项目:  贵州省研究生导师工作室建设项目 黔教研合GZS字[2016]03贵州省生物学一流学科建设项目 GNYL[2017]009国家自然科学基金“杜仲橡胶颗粒蛋白编码基因克隆及功能分析” 31870285“十二五”农村领域国家科技计划课题“杜仲功能基因组研究与应用” 2013AA102605-05

摘要:  目的 建立快速、简便、重复性好、得率高的杜仲胶颗粒提取技术,为进一步分析胶颗粒膜蛋白、脂肪酸、糖脂等组成及杜仲橡胶分子量奠定基础。 方法 以杜仲叶片和翅果为材料,利用不同离心条件及研磨次数探究杜仲胶颗粒得率,并结合光镜与电镜观察结果,探讨适合从不同杜仲组织器官中提取胶颗粒的最优条件。 结果 杜仲组织(叶片或翅果)液氮经速冻、反复研磨捣碎6次过滤10次,在4℃条件下以5 000 g离心力,45度定角离心10 min,并反复漂洗8次得到的杜仲胶颗粒含量最高。在此条件下,以10月采摘的杜仲叶和翅果为材料,提取的杜仲胶颗粒含量可分别达3.70 g·kg-1叶片、5.37 g·kg-1翅果。进一步观察发现,不论是杜仲叶片或翅果随着其发育的成熟,组织中胶颗粒粒径大小和积累量均呈现先增加后稳定的变化趋势。杜仲胶颗粒在光镜和电镜下呈球形,胶颗粒间粒径大小差异较大。以10月杜仲叶、翅果及树皮为例,小胶颗粒(1~4 μm)分别占39%,53%,98.38%,中等胶颗粒(4~7 μm)分别占38%,34%,0.12%,大胶颗粒(7~11 μm)分别占23%,13%,0.05%。 结论 本研究建立的杜仲胶颗粒提取技术较为快捷,得率高,可快速对不同时期不同组织器官的杜仲胶颗粒进行提取。

English Abstract

  • 杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)是杜仲科杜仲属落叶乔木,为我国特有名贵经济树种。杜仲皮是名贵中药材,具有补肝肾、强筋骨以及安胎等作用[1]。另外,杜仲是世界上适应范围最广的重要胶源树种[2-3],也是温带最具开发潜力的胶源树种[4]。杜仲胶不仅具有橡(胶)塑(料)二重性,可开发兼具热塑性、热弹性和高弹性的功能材料,如高质量的轮胎、高尔夫球、假肢套等产品[5],杜仲胶还具有绝缘性好,耐酸碱且不易腐蚀等特点,是制造海底电缆绝缘带的理想材料[6]。研究表明,杜仲的根、茎、叶、花、果实的韧皮部薄壁细胞中分布有细长、两端膨大、内部充满胶颗粒的特化丝状单细胞[7-9],它是杜仲植株体内合成和储藏硬性橡胶的场所[10]。研究发现,杜仲果实中含胶率高达12%以上,居杜仲树各部位含胶量之首,比杜仲叶片高46倍[11]。杜仲橡胶也称古塔波胶或巴拉塔胶[12],分子构象测定表明杜仲胶为反式-聚异戊二烯[13],与巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell. Arg.),银胶菊(Parthenium aryentatuim L.)等合成的顺式-聚异戊二烯橡胶互为同分异构体[14]。早期研究者对巴西橡胶研究发现,橡胶树树皮韧皮部含有网络分布的乳汁管可分泌出胶乳,而胶乳中又含有大量包裹有几个到上千个橡胶分子的胶颗粒[15-16],胶颗粒的主要功能是合成和贮藏天然橡胶[17]。显微观察表明,胶颗粒是一类不连续的亚细胞器,内部由橡胶分子组成疏水核心区,外部则由脂类和蛋白质组成的“半单位膜”包裹[18-19]。与橡胶树不同,杜仲树皮韧皮部不含网络状乳汁管,胶颗粒主要存在于含胶细胞中,分离提取及纯化条件相对较为复杂。2003年,王敏杰等[20]采用反复漂洗/离心法对杜仲叶胶颗粒进行了提取纯化,并从杜仲叶胶颗粒上分离鉴定出两种丰度最高膜结合蛋白,EuRPP56和EuRPP30,之后更多参与杜仲胶合成的相关蛋白基因被报道[21-22]。王惠[23]通过改进提取方法,从叶中获得纯度更高的杜仲胶颗粒,但该法仅适用于胶含量累积最高时期的杜仲组织中胶颗粒的提取。因此,探索可适用于杜仲不同生长期各器官中胶颗粒的提取工艺条件,为深入研究杜仲胶颗粒的功能具有重要意义。本研究通过对已有杜仲胶颗粒提取工艺进行改良、优化,并结合胶颗粒形态观察,形成可适用于杜仲各生长期不同组织器官中杜仲胶颗粒的提取条件,进而为研究杜仲胶粒的分化形成机制、杜仲胶分子的累积规律以及杜仲胶合成的分子机制奠定基础。

    • 植物材料于2018年取自种植于贵州大学农业生物工程研究院实验农场杜仲资源圃中的多年生杜仲植株的当年生叶片及翅果。

    • 仪器:水平离心机(ThermoFisher Scientific Inc.),Allegra X-30R Centrifuge定角(45度)离心机(Beckman Coulter Inc.),BX43光学显微镜(OLYMPUS Inc.),S3400扫描电子显微镜(Hitachi Inc.),e-1010离子溅射仪(Hitachi Inc.),电子天平(北京丹佛仪器有限公司),PH计(上海洪纪仪器设备有限公司)等。

      试剂:三羟甲基氨基甲烷(Tris)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、β-巯基乙醇(BME)及抗坏血酸(Vc)购于Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司,氟化钾(KF)、硫酸镁(MgSO4),异丙醇(isopropanol)、盐酸(HCl)购于天津市科密欧化学试剂有限公司,2.5%戊二醛固定液购于Solarbio(北京)科技有限公司。

    • 按照不同月份(6、7、8、9、10和11月)分别采收杜仲植株叶片(6—11月)及翅果(6—10月),擦去表面灰尘后置于自来水下冲洗干净,用干净的吸水纸吸干植物材料表面的水分后用液氮速冻,保存于-80℃超低温冰箱备用。

    • 参照赵德刚博士后出站报告[4]及王惠[23]硕士论文中杜仲胶颗粒提取方法并略作修改。取-80℃超低温冰箱冻存的新鲜杜仲叶(或翅果)加入组织研磨杵中用液氮迅速研磨成粉,称取适量样品粉末至含有400 mL预冷提取缓冲液的1 L烧杯中,于冰上快速搅拌抽提1 min,之后将组织匀浆液在4℃条件下迅速过200目不锈钢筛网并收集滤液,滤液分装于6支4℃预冷的50 mL离心管中备用。滤液分别按以下2种方法进行离心操作:①离心管在4℃条件下以5 000 g水平离心10 min后,小心取出后利用20 mL干净注射器将6支离心管中上层悬浮物合并转移至3支洁净的10 mL离心管中备用;②离心管在4℃条件下以5 000 g定角(45度)离心10 min后,分别以注射器收集液面漂浮物和以移液枪收集贴附于临近液面上层管壁处的悬浮物,合并后转移至3支洁净的10 mL离心管中备用。分别将上述2种处理获得的合并悬浮物于冰上放置30 min,于4℃,5 000 g水平离心8 min,弃去下清液,加入8 mL预冷的漂洗缓冲液重悬后,4℃,5 000 g水平离心8 min,弃去漂洗液,再次以漂洗缓冲液重悬、离心,重复6~8次。提取缓冲液:100 mmol·L-1 Tris-HCl,50 mmol·L-1 KF,2%(W/V)Vc,5 mmol·L-1 MgSO4,pH=7.5),临用前加入2%(W/V)PVP,β-巯基乙醇(终浓度为5 mmol·L-1),0.1 mmol·L-1 PMSF异丙醇溶液。漂洗缓冲液:100 mmol·L-1 Tris-HCl,5 mmol·L-1 MgSO4,10 mmol·L-1 β-巯基乙醇。

    • 准确称取-80℃冻存的、采摘于10月的杜仲叶(或翅果)100 g于组织研磨杵中加入液氮迅速研磨成粉,迅速转移至预冷的400 mL提取缓冲液中,于冰上快速搅拌抽提1 min,将组织匀浆液在4℃条件下过200目不锈钢筛网并收集滤液,滤液转移至50 mL离心管中,再按照1.2.2中第二种方法对样品进行杜仲胶颗粒提取。将第一次过滤所得植物样品分别按照不同次数(1、2、3、4、5和6次)再次研磨(无需加液氮研磨),每研磨一次约10 min,提取缓冲液浸提过滤2次,同时烘干提取纯化后的杜仲胶颗粒。计算出杜仲样品在不同研磨次数处理后杜仲胶颗粒得率。

    • 精确称取-80℃冻存、取自不同月份的杜仲叶片(6—11月)和杜仲翅果(6—10月)各100 g,结合1.3.3方法中植物样品6次研磨10次过滤,滤液采用1.3.2方法中经4℃条件下5 000 g定角离心(45度)10 min提取杜仲胶颗粒;同时烘干提取纯化后的杜仲胶颗粒,计算杜仲胶颗粒在不同生长期杜仲叶或翅果中的含量,分析不同杜仲组织中胶颗粒含量随月份变化的动态积累规律。另外,利用OLYMPUS BX43光学显微镜对提取的胶颗粒大小进行观察,并以其自带测量工具对各生育期不同杜仲器官组织中胶颗粒大小进行测定,每组设3个重复。

    • 取10月杜仲叶片和翅果提取纯化后的胶颗粒(约0.0