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无刺枸骨(Ilex cornuta var. fortunei),是冬青属(Ilex L.)植物枸骨(Ilex cornuta Lindl. et Paxt.)的自然变种,是一种常绿小乔木或灌木,其叶形奇特,球形核果入秋成熟转红,鲜艳夺目,是一种良好的观赏树种[1]。枸骨在我国长江下游各省均有分布,且其根、树皮、叶与果实等均可入药,具有益肾、活络强筋等功效,可用于治疗风湿性关节酸痛、腰肌劳损等病症[2]。此外,有文献报道,无刺枸骨具有降血脂、抗生育和抑菌等作用[3],但具体作用机制不明。
目前,关于无刺枸骨的研究主要集中在无刺枸骨快速繁殖与扦插技术[4-5]、嫁接与造型技术[6],无刺枸骨叶片结构对环境温度的适应[7]、枸骨和无刺枸骨不同光强下光合能力比较[8],无刺枸骨不同部位齐墩果酸和熊果酸的含量分析[1]及果实总黄酮的提取及稳定性研究[3]等,对无刺枸骨果实化学成分的研究较少,而对其果实抗氧化和抑菌活性研究仍处于空白阶段。本文以无刺枸骨果实为对象,采用多种极性不同的溶剂分别对其果实的活性物质进行萃取,并采用2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法、滤纸片抑菌法检测其活性物质的抗氧化活性与抑菌活性;同时结合GC-MS(气相色谱-质谱联用)技术对抗氧化及抑菌活性显著的正丁醇萃取物化学组成进行分析鉴定,以期为无刺枸骨果实资源的综合利用与开发提供数据支持。
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高压蒸汽灭菌锅(SQ510C型,重庆雅马拓科技公司)、恒温培养箱(ZGP-2050型,上海智城分析仪器公司)、超净工作台(ZHJH-C1106B型,上海智城分析仪器公司)、紫外可见分光光度计(UV754N型,上海精密科学仪器公司)、气相色谱-质谱联用仪(Agilent 7890A-5975C型,美国Agilent公司)。
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2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)与1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)购于东京化成株式会社,均为分析纯;无水乙醇、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、过硫酸钾等试剂购于上海国药集团,均为分析纯;酵母提取物、蛋白胨、琼脂粉和维生素C等生化试剂购于上海生工有限公司。
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实验所用的无刺枸骨成熟期果实(凭证标本采集号-03;采集人:佘新松;鉴定人:方建新;采集地点:安徽屯溪;采集时间:2019年12月4日)采集于黄山学院校园内。
本文抑菌实验所用菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和变形杆菌(Proteusbacillus vulgaris),以上菌株保存于黄山学院微生物学实验中心且均购自于中国典型培养物保藏中心。抑菌实验所用固体培养基为LB(Luria-Bertani)平板培养基,其配制方法参考文献[9]。
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将采集的新鲜无刺枸骨果实去果梗后粉碎至糊状,称取20.0 g糊状果实于500 mL圆底烧瓶中,加入200 mL甲醇并于60 ℃恒温萃取3 h;过滤后收集上清液,并向滤渣中再加入新甲醇200 mL后重复提取2次;将3次提取液合并后于旋转蒸发仪内60 ℃真空蒸干得到甲醇粗提物,收集并称质量后用100 mL双蒸水重悬甲醇粗提物,再按1:1等体积比依次加入100 mL正丁醇、乙酸乙酯和石油醚进行萃取,各萃取溶剂分别重复3次,收集300 mL各萃取相溶剂后于旋转蒸发仪内60 ℃减压旋干并称质量;最后用无水乙醇分别将上述萃取物配制成10 mg·mL−1溶液,保存于4℃冰箱备用。
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参考文献[10]方法检测并改进无刺枸骨果实萃取物清除ABTS自由基的能力,方法如下:按体积比1∶1分别移取2.45 mmol·L−1 K2S2O8溶液与7 mmol·L−1 ABTS溶液混匀并避光反应12 h;用甲醇将反应后ABTS液稀释至λ 734 nm吸光值为0.68~0.72待用。分别移取无刺枸骨果实甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物不同浓度溶液200 μL于2 mL上述甲醇稀释后的ABTS溶液中,混匀后于暗处室温反应6 min测其吸光值Ax。以相同方法测定200 μL甲醇与2 mL反应后的ABTS溶液反应后的吸光值A0;同时,测定100 μL不同浓度的无刺枸骨果实甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物溶液与2 mL甲醇反应后的吸光值Ay,每组重复测定3次。以Vc为阳性对照,采用上述方法测定其清除ABTS自由基的能力,重复3次。按公式(1)计算清除ABTS自由基的清除率(Y),取其平均值进行分析。
$ Y = \left( {1 - \left( {Ax + Ay} \right){\rm{ }}/{A_0}} \right) \times 100\% $
(1) -
参考文献[11]方法并适当改善检测无刺枸骨果实萃取物清除DPPH自由基的能力,方法如下:分别移取经无水乙醇稀释的无刺枸骨果实甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物溶液100 μL于0.06 mmol·L−1 DPPH-乙醇(95%)溶液中配制成一系列不同浓度的溶液,混匀并避光反应20 min后于λ517 nm处测定吸光值Bx。同时,吸取100 μL无水乙醇至DPPH-乙醇(95%)溶液中作为对照组,测定其吸光值B0。以Vc为阳性对照,采用上述方法测定其清除DPPH自由基的能力,重复3次。按公式(2)计算清除DPPH自由基的清除率(Z),取平均值进行分析。
$ Z = \left( {1 - {B_x}/{B_0}} \right) \times 100{\text{%}} $
(2) -
参考文献[9]方法检测无刺枸骨果实萃取物对不同受试菌的抑菌活性,方法如下:将活化后的受试菌枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和变形杆菌培养至λ600 nm 处吸光值为0.25~0.35,吸取100 μL上述菌液于LB固体培养基上涂布均匀,放置直径6 mm无菌滤纸片,分别吸取10 μL无刺枸骨果实甲醇粗提物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物滴加于纸片中央;以无水乙醇为空白对照,将以上LB固体培养基于37℃恒温培养12 h,测量并记录抑菌圈的大小,重复3次,以其均值进行分析。
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依据文献[12-13]的方法并改进,采用HP-5 MS石英毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)为色谱柱对无刺枸骨果实甲醇粗提取物的正丁醇萃取物进行GC-MS分析,萃取物进样量为0.5 μL;以纯度99.999 %氦气作为载气,流速设置为1.0 mL·min−1;柱箱采取程序梯度升温:起始温度设置为50℃,先以4℃·min−1速率升至150℃后保持1 min,再以1℃·min−1速率升至220℃后维持1 min,最后以3℃·min−1速率升至260℃后维持5 min,共运行50 min。
采用电子轰击(EI)离子源,70 eV电子能量;设置离子源为230℃,四极杆为150℃;扫描质量数范围m/z为50.0~500.0,质谱数据库选择为标准谱库NIST08。
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参考文献[14-16]中的方法并适当修改测定正丁醇萃取物的成分,具体参数简述如下:取1 μL待测样品注入UPLC仪器中,设置流速为0.3 mL·min−1;采用ACQUITY HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)色谱柱,柱温恒定为30℃;流动相分别为0.1%甲醇水溶液(A)和乙腈(B);洗脱程序设置为:0~10 min,5% B;10~20 min,20% B;20~28 min,40% B;28~38 min,60% B;38~43 min,100% B;43~46 min,100% B;46~50 min,5% B。采用电喷雾离子源(ESI),正离子模式;离子源温度设为100℃,脱溶剂气(N2)温度为400℃;毛细管电压设为2.0 kV,锥孔电压为40 V;锥孔气(N2)流量设为50 L·h−1;利用氩气作为碰撞气,碰撞能量为6 V和20~30 V。
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将无刺枸骨果实甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚等萃取物稀释为一系列浓度梯度,检测其对ABTS自由基的清除作用。图1表明:无刺枸骨果实甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯与石油醚萃取物对ABTS自由基的清除作用均与萃取物浓度呈正相关,即ABTS自由基清除率随萃取物浓度增加而增大,当正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取物浓度分别为0.075、0.125、0.625 mg·mL−1时,对ABTS自由基清除率分别为99.68%、99.95%、53.21%。阳性对照Vc浓度(X)与ABTS自由基清除率(Y)的线性回归方程为:Y=20783.00X+5.94 (R2=0.9711)。无刺枸骨果实甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取物及Vc对ABTS自由基清除作用的ED50值分别为0.0336、0.0540、0.5591、0.0021 mg·mL−1。
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分别取无刺枸骨果实甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚等萃取物稀释为一系列梯度,检测其对DPPH自由基的清除作用。图2可知:无刺枸骨果实甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯与石油醚萃取物对DPPH自由基的清除作用均与萃取物浓度呈正相关,且随着萃取物浓度增加,DPPH清除率显著增大。当正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取物浓度分别为0.125、0.25、1.25 mg·mL−1时,对DPPH自由基清除率分别为90.83%、98.15%、75.50%。阳性对照Vc浓度(X)与DPPH自由基清除率(Y)的线性回归方程为:Y=18 986.00X+4.49 (R2=0.987 3)。无刺枸骨果实甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取物及Vc对ABTS自由基清除作用的ED50值分别为0.054 3、0.096 4、0.774 1、0.002 4 mg·mL−1。
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以滤纸片抑菌法检测无刺枸骨果实甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌与变形杆菌的抑菌活性。图3结果表明:正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物对上述5种受试菌均有抑制作用。与对照乙醇相比,正丁醇萃取物的抑菌效果最显著,对5种受试菌的抑制作用顺序为:鼠伤寒沙门氏菌>变形杆菌>枯草芽孢杆菌>绿脓杆菌>金黄色葡萄球菌,抑菌圈减去同条件下乙醇对照的均值分别为6.20、5.15、4.24、3.45、3.24 mm;乙酸乙酯萃取物对枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和变形杆菌有显著抑制作用,对金黄色葡萄球菌与绿脓杆菌无显著抑制作用;石油醚萃取物对枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌有显著抑制作用,对绿脓杆菌和变形杆菌无显著的抑制作用。
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无刺枸骨果实甲醇粗提取物的正丁醇萃取物抗氧化活性和抑菌效果最好,故采用GC-MS技术对其进行化学组成分析,总离子流结果见图4。通过与标准谱库NIST08的质谱峰比对分析,结合峰面积归一法分析其各组分的相对含量(表1)。由图4和表1可知:无刺枸骨果实甲醇粗提取物的正丁醇萃取物中共分离出色谱峰35个,经鉴定后得到14个化合物(表1),占正丁醇萃取物总量的83.15%,其相对含量高于1.00%的化合物依次为N1-(叔丁基)-2-(2-[2-[(叔丁基氨基)碳硫基]肼基]亚乙基)肼-1-碳硫酰胺(48.63%)、丁醛二丁基乙缩醛(25.53%)、1-丁氧基-2-乙基-1-己烯(2.37%)、丁酸丁酯(1.67%)和丙位癸内酯(1.04%),这5种组分占总化合物的79.24%。
图 4 无刺枸骨果实甲醇粗提取物的正丁醇萃取物GC-MS总离子流
Figure 4. The total ion chromatogram of the 1-butanol extraction from the crude methanol extract of the fructus of I. cornuta var fortunei by GC-MS
表 1 无刺枸骨果实甲醇粗提取物的正丁醇萃取物的GC-MS鉴定结果
Table 1. The chemical constituents of the 1-butanol extraction from the crude methanol extract of the fructus of I. cornuta var fortunei by GC-MS
编号
No.保留时间
Retention time/min化合物
Compound分子式
Molecular formula相对含量
Relative content/%1 5.261 2-甲基-1-丁醇 2-Methyl-1-butanol C5H12O 0.84 2 8.602 糠醛 Furfural C5H4O2 0.25 3 9.266 3-庚醇 3-Heptanol C7H16O 0.12 4 9.891 异丁酸丁酯 Butyl isobutyrate C8H16O2 0.20 5 10.075 丁酸异丁酯 Isobutyl butyrate C8H16O2 0.52 6 10.603 2-乙基己醛 2-Ethylhexanal C8H16O 0.94 7 11.552 丁酸丁酯 Butyl butyrate C8H16O2 1.67 8 12.753 2-乙基己烯醛 2-Ethylhexenal C8H14O 0.38 9 16.745 叔丁醚 Di-tert-butyl ether C8H18O 0.21 10 17.938 1-丁氧基-2-乙基-1-己烯 1-Butoxy-2-ethyl-1-hexene C12H24O 2.37 11 18.503 丙位癸内酯 γ-Decalactone C10H18O2 1.04 12 19.664 丁醛二丁基乙缩醛 Butyraldehyde dibutyl acetal C12H26O2 25.53 13 25.771 1,1,3,3-四丁氧基-2-丙酮 1,1,3,3-tetrabutoxy-2-propanone C19H38O5 0.45 14 27.948 N1-(叔丁基)-2-(2-[2-[(叔丁基氨基)碳硫基]肼基]亚乙基)肼-1-碳硫酰胺
N1-(tert-Butyl)-2-(2-[2-[(tert-butylamino)carbothioyl]hydrazono]ethylidene)hydrazine-1-carbothioamideC12H24N6S2 48.63 -
利用UPLC-Q-TOF/MS同时对无刺枸骨果实甲醇粗提取物的正丁醇萃取物化学组成进行定性分析,其总离子流结果见图5,推测和鉴定出化合物共10种(表2)。从表2可知:鉴定出的10种化合物含有2种乙酰腈、2种酯类、3种羧酸、2种酮类和1种酰胺。
表 2 无刺枸骨果实甲醇粗提取物的正丁醇萃取物的UPLC-Q-TOF/MS鉴定结果
Table 2. The chemical constituents of the 1-butanol extraction from the crude methanol extract of the fructus of I. cornuta var fortunei by UPLC-Q-TOF/MS
编号
No.保留时间
Retention time /min实测值
Measured
value理论值
Theoretical
value碎片离子
Fragment ion误差
Error/×10−3分子式
Molecular formula化合物
Chemical compound1 2.09 330.118 7 330.118 9 312.107 9, 168.065 0, 152.069 4, 123.043 5, 105.032 3 0.2 C14H20NO8 2-((4R,5S,6S)-4,5-二羟基-6-(((2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧代)环己-2-烯-1-亚基)乙酰腈
2-((4R,5S,6S)-4,5-dihydroxy-6-(((2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)cyclohex-2-en-1-ylidene)acetonitrile2 4.51 314.123 1 314.124 0 314.123 6, 296.112 8, 152.070 8, 135.043 8,107.047 9 0.9 C14H20NO7 (3,4,5-三羟基-6-羟甲基-四氢-吡喃-2-基)-氨甲酸苯甲基酯
(3,4,5-Trihydroxy-6-hydroxymethyl-tetrahydro-pyran-2-yl)-carbamic acid benzyl ester3 5.77 355.101 9 355.102 9 355.102 0, 164.041 6, 145.027 7, 135.043 1, 117.032 6 1.0 C16H19O9 (1S,3R,4R,5R)-3-((3-(3,4-二羟基苯基)丙烯酰)氧代)-1,4,5-三羟基环己羧酸
(1S,3R,4R,5R)-3-((3-(3,4-dihydroxyphenyl)acryloyl)oxy)-1,4,5-trihydroxycyclohexanecarboxylic acid4 6.06 312.107 6 312.108 3 312.107 7, 192.064, 151.057 0, 145.049 0, 123.043 2 0.7 C14H17NO7 (R)-2-(4-羟基苯基)-2-(((2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧代)乙酰腈
(R)-2-(4-hydroxyphenyl)-2-(((2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)acetonitrile5 18.62 369.117 6 369.118 6 305.096 4, 179.063 7, 177.053 8, 163.038 5, 145.027 3 1.0 C17H21O9 6-((2S,3R,4R,5S,6R)-3,4-二羟基-6-(羟甲基)-5-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-氧基)-8-羟基-3-甲基-1H-异色烯-1-酮
6-((2S,3R,4R,5S,6R)-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-5-methoxytetrahydro-2H-pyran-2-yloxy)-8-hydroxy-3-methyl-1H-isochromen-1-one6 20.34 611.162 0 611.161 2 611.162 5, 465.102 3, 303.053 6, 293.101 7, 145.049 2, 127.038 3 0.8 C27H31O16 2-(3,4-二羟基-苯基)-5,7-二羟基-3-[(1R,5S,6S)-4-(S)-羟基-3-(R)-羟基-6-甲基-5-((2S,3R,4R,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-羟甲基-四氢-吡喃-2-氧基)-四氢-吡喃-2-氧基]-色烯-4-酮
2-(3,4-Dihydroxy-phenyl)-5,7-dihydroxy-3-[(1R,5S,6S)-4-(S)-hydroxy-3-(R)-hydroxy-6-methyl-5-((2S,3R,4R,5R,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-hydroxymethyl-tetrahydro-pyran-2-yloxy)-tetrahydro-pyran-2-yloxy]-chromen-4-one7 22.34 540.244 7 540.245 8 523.212 1, 346.171 9, 343.152 7, 331.153 6, 285.111 1, 281.086 5, 178.092 9 1.1 C27H34N5O7 1-[2-(2-{2-[2-氨基-3-(4-羟基-苯基)-丙酰氨基]-乙酰基氨基}-乙酰基氨基)-3-苯基-丙酰]-吡咯烷-2-羧酸
1-[2-(2-{2-[2-Amino-3-(4-hydroxy-phenyl)-propionylamino]-acetylamino}-acetylamino)-3-phenyl-propionyl]-pyrrolidine-2-carboxylic acid8 26.27 473.361 0 473.363 1 455.350 8, 437.340 6, 409.345 2, 391.334 7 2.1 C30H49O4 (1S,2R,4aS,6aS,6bR,9R,10S,12aR)-10-羟基-9-(羟甲基)-1,2,6a,6b,9,12a-六甲基-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-二十氢苉-4a-羧酸
(1S,2R,4aS,6aS,6bR,9R,10S,12aR)-10-hydroxy-9-(hydroxymethyl)-1,2,6a,6b,9,12a-hexamethyl-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-icosahydropicene-4a-carboxylic acid9 33.21 520.342 1 520.338 7 520.339 1, 502.328 4, 258.109 5, 185.075 7, 184.072 7 3.4 C28H46N3O6 (3S,4S)-乙基3-羟基-4-((S)-3-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(3-甲基丁酰氨基)丁酰氨基)丁酰氨基)-5-苯基戊酸酯
(3S,4S)-ethyl-3-hydroxy-4-((S)-3-methyl-2-((S)-3-methyl-2-(3-methylbutanamido)butanamido)butanamido)-5-phenylpentanoate10 35.23 496.340 8 496.338 7 496.339 0, 478.328 3, 184.110 4, 2.1 C26H46N3O6 N-((2S,3S,5R)-6-(丁基氨基)-3-羟基-1-(异丙基氨基)-5-甲基-6-羰基己烷-2-基)-4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苯酰胺
N-((2S,3S,5R)-6-(butylamino)-3-hydroxy-1-(isopropylamino)-5-methyl-6-oxohexan-2-yl)-4-methoxy-3-(3-methoxypropoxy)benzamide
无刺枸骨果实化学成分及其抗氧化和抑菌活性研究
Study on Constituents of Ilex cornuta var. fortunei Fruit and Their Antioxidant and Bacteriostatic Activity
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摘要:
目的 探究无刺枸骨果实的化学成分及功能,为种质资源的开发利用提供基础。 方法 利用正丁醇、乙酸乙酯和石油醚等萃取剂对无刺枸骨果实成分进行萃取,并采用2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)法、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法和滤纸片抑菌法测定其萃取物的抗氧化与抑菌活性;结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术对正丁醇萃取物的化学组分进行鉴定。 结果 无刺枸骨果实甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物对ABTS和DPPH自由基均有明显的清除作用,且清除率与萃取物浓度间呈线性正相关。抑菌试验结果表明:正丁醇提取物对于所有菌株均具有极显著的抑菌作用,且是3种萃取剂中抑菌作用最强的;而乙酸乙酯萃取物对于枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和变形杆菌也具有极显著抑菌作用;石油醚萃取物对枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和变形杆菌抑制作用显著。结合GC-MS与UPLC-Q-TOF/MS技术,本文首次证实无刺枸骨果实含有抗氧化与抑菌活性的药用成分——绿原酸。 结论 本研究首次采用多种萃取剂对无刺枸骨果实成分进行萃取和鉴定,并通过试验证明其萃取物具有显著的抗氧化和抑菌活性,该结果为无刺枸骨果实资源的开发利用提供了数据支持。 Abstract:Objective To explore the chemical composition and function of the fruit of Ilex cornuta var. fortunei for the purpose of development and utilization. Method Firstly, 1-butanol, ethyl acetate and petroleum ether were used to extract the active components from the fruit of I. cornuta var. fortunei. Then the free radical scavenging assays against 2,2′-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine (DPPH) coupled with the filter paper slice bacteriostasis were used to evaluate their antioxidant and bacteriostatic activities. Meanwhile, the chemical components of 1-butanol extraction were identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Result The 1-butanol, ethyl acetate and petroleum ether extracts from the crude methanol extract of the fruits of I. cornuta var. fortunei had significant scavenging effects on ABTS and DPPH free radicals, and the scavenging rate was positively correlated with the extract concentration. The results of antibacterial test showed that the 1-butanol extraction had the best antibacterial effect among all strains tested, and had the strongest bacteriostatic effect among the three extractants. The ethyl acetate extraction and the petroleum ether extract had the best antibacterial effect on Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, and Proteusbacillus vulgaris. Combining with GC-MS and UPLC-Q-TOF/MS technology, it was reported for the first time that the fruits of I. cornuta var. fortunei contains chlorogenic acid, a medicinal ingredient with antioxidant and antibacterial activity. Conclusion In this study, a variety of extractants were used for the first time to extract and identify the components of the fruits of I. cornuta var. fortunei, and the results show that the extracts have significant antioxidant and antibacterial activities.. -
表 1 无刺枸骨果实甲醇粗提取物的正丁醇萃取物的GC-MS鉴定结果
Table 1. The chemical constituents of the 1-butanol extraction from the crude methanol extract of the fructus of I. cornuta var fortunei by GC-MS
编号
No.保留时间
Retention time/min化合物
Compound分子式
Molecular formula相对含量
Relative content/%1 5.261 2-甲基-1-丁醇 2-Methyl-1-butanol C5H12O 0.84 2 8.602 糠醛 Furfural C5H4O2 0.25 3 9.266 3-庚醇 3-Heptanol C7H16O 0.12 4 9.891 异丁酸丁酯 Butyl isobutyrate C8H16O2 0.20 5 10.075 丁酸异丁酯 Isobutyl butyrate C8H16O2 0.52 6 10.603 2-乙基己醛 2-Ethylhexanal C8H16O 0.94 7 11.552 丁酸丁酯 Butyl butyrate C8H16O2 1.67 8 12.753 2-乙基己烯醛 2-Ethylhexenal C8H14O 0.38 9 16.745 叔丁醚 Di-tert-butyl ether C8H18O 0.21 10 17.938 1-丁氧基-2-乙基-1-己烯 1-Butoxy-2-ethyl-1-hexene C12H24O 2.37 11 18.503 丙位癸内酯 γ-Decalactone C10H18O2 1.04 12 19.664 丁醛二丁基乙缩醛 Butyraldehyde dibutyl acetal C12H26O2 25.53 13 25.771 1,1,3,3-四丁氧基-2-丙酮 1,1,3,3-tetrabutoxy-2-propanone C19H38O5 0.45 14 27.948 N1-(叔丁基)-2-(2-[2-[(叔丁基氨基)碳硫基]肼基]亚乙基)肼-1-碳硫酰胺
N1-(tert-Butyl)-2-(2-[2-[(tert-butylamino)carbothioyl]hydrazono]ethylidene)hydrazine-1-carbothioamideC12H24N6S2 48.63 表 2 无刺枸骨果实甲醇粗提取物的正丁醇萃取物的UPLC-Q-TOF/MS鉴定结果
Table 2. The chemical constituents of the 1-butanol extraction from the crude methanol extract of the fructus of I. cornuta var fortunei by UPLC-Q-TOF/MS
编号
No.保留时间
Retention time /min实测值
Measured
value理论值
Theoretical
value碎片离子
Fragment ion误差
Error/×10−3分子式
Molecular formula化合物
Chemical compound1 2.09 330.118 7 330.118 9 312.107 9, 168.065 0, 152.069 4, 123.043 5, 105.032 3 0.2 C14H20NO8 2-((4R,5S,6S)-4,5-二羟基-6-(((2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧代)环己-2-烯-1-亚基)乙酰腈
2-((4R,5S,6S)-4,5-dihydroxy-6-(((2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)cyclohex-2-en-1-ylidene)acetonitrile2 4.51 314.123 1 314.124 0 314.123 6, 296.112 8, 152.070 8, 135.043 8,107.047 9 0.9 C14H20NO7 (3,4,5-三羟基-6-羟甲基-四氢-吡喃-2-基)-氨甲酸苯甲基酯
(3,4,5-Trihydroxy-6-hydroxymethyl-tetrahydro-pyran-2-yl)-carbamic acid benzyl ester3 5.77 355.101 9 355.102 9 355.102 0, 164.041 6, 145.027 7, 135.043 1, 117.032 6 1.0 C16H19O9 (1S,3R,4R,5R)-3-((3-(3,4-二羟基苯基)丙烯酰)氧代)-1,4,5-三羟基环己羧酸
(1S,3R,4R,5R)-3-((3-(3,4-dihydroxyphenyl)acryloyl)oxy)-1,4,5-trihydroxycyclohexanecarboxylic acid4 6.06 312.107 6 312.108 3 312.107 7, 192.064, 151.057 0, 145.049 0, 123.043 2 0.7 C14H17NO7 (R)-2-(4-羟基苯基)-2-(((2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧代)乙酰腈
(R)-2-(4-hydroxyphenyl)-2-(((2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)acetonitrile5 18.62 369.117 6 369.118 6 305.096 4, 179.063 7, 177.053 8, 163.038 5, 145.027 3 1.0 C17H21O9 6-((2S,3R,4R,5S,6R)-3,4-二羟基-6-(羟甲基)-5-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-氧基)-8-羟基-3-甲基-1H-异色烯-1-酮
6-((2S,3R,4R,5S,6R)-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-5-methoxytetrahydro-2H-pyran-2-yloxy)-8-hydroxy-3-methyl-1H-isochromen-1-one6 20.34 611.162 0 611.161 2 611.162 5, 465.102 3, 303.053 6, 293.101 7, 145.049 2, 127.038 3 0.8 C27H31O16 2-(3,4-二羟基-苯基)-5,7-二羟基-3-[(1R,5S,6S)-4-(S)-羟基-3-(R)-羟基-6-甲基-5-((2S,3R,4R,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-羟甲基-四氢-吡喃-2-氧基)-四氢-吡喃-2-氧基]-色烯-4-酮
2-(3,4-Dihydroxy-phenyl)-5,7-dihydroxy-3-[(1R,5S,6S)-4-(S)-hydroxy-3-(R)-hydroxy-6-methyl-5-((2S,3R,4R,5R,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-hydroxymethyl-tetrahydro-pyran-2-yloxy)-tetrahydro-pyran-2-yloxy]-chromen-4-one7 22.34 540.244 7 540.245 8 523.212 1, 346.171 9, 343.152 7, 331.153 6, 285.111 1, 281.086 5, 178.092 9 1.1 C27H34N5O7 1-[2-(2-{2-[2-氨基-3-(4-羟基-苯基)-丙酰氨基]-乙酰基氨基}-乙酰基氨基)-3-苯基-丙酰]-吡咯烷-2-羧酸
1-[2-(2-{2-[2-Amino-3-(4-hydroxy-phenyl)-propionylamino]-acetylamino}-acetylamino)-3-phenyl-propionyl]-pyrrolidine-2-carboxylic acid8 26.27 473.361 0 473.363 1 455.350 8, 437.340 6, 409.345 2, 391.334 7 2.1 C30H49O4 (1S,2R,4aS,6aS,6bR,9R,10S,12aR)-10-羟基-9-(羟甲基)-1,2,6a,6b,9,12a-六甲基-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-二十氢苉-4a-羧酸
(1S,2R,4aS,6aS,6bR,9R,10S,12aR)-10-hydroxy-9-(hydroxymethyl)-1,2,6a,6b,9,12a-hexamethyl-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-icosahydropicene-4a-carboxylic acid9 33.21 520.342 1 520.338 7 520.339 1, 502.328 4, 258.109 5, 185.075 7, 184.072 7 3.4 C28H46N3O6 (3S,4S)-乙基3-羟基-4-((S)-3-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(3-甲基丁酰氨基)丁酰氨基)丁酰氨基)-5-苯基戊酸酯
(3S,4S)-ethyl-3-hydroxy-4-((S)-3-methyl-2-((S)-3-methyl-2-(3-methylbutanamido)butanamido)butanamido)-5-phenylpentanoate10 35.23 496.340 8 496.338 7 496.339 0, 478.328 3, 184.110 4, 2.1 C26H46N3O6 N-((2S,3S,5R)-6-(丁基氨基)-3-羟基-1-(异丙基氨基)-5-甲基-6-羰基己烷-2-基)-4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苯酰胺
N-((2S,3S,5R)-6-(butylamino)-3-hydroxy-1-(isopropylamino)-5-methyl-6-oxohexan-2-yl)-4-methoxy-3-(3-methoxypropoxy)benzamide -
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