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唾液是刺吸式昆虫与寄主植物相互作用的重要媒介,其主要成分为唾液蛋白,并含有大量可溶性酶类[1]。唾液在昆虫唾液腺中合成和贮存,通过取食被注入并作用于植物组织,具有克服寄主植物抗性、帮助口针穿刺、消化食物、解毒次生代谢物质和克服寄主植物抗性等功能[2-3]。蚜虫通过针状口器吸食植物汁液,阻碍植物生长,导致植物的叶、花、芽出现畸形,还可能传播病毒或者引起其他危害,是农、林植物上的重要害虫。五倍子蚜通过取食将唾液注入植物组织,其中的酶类或特定功能蛋白能诱导植物产生一系列生化反应,引起植物组织的不正常增生,从而形成具有特定结构和功能的虫瘿[4-5]。
昆虫的唾液是植物虫瘿形成和生长的关键物质,是虫瘿形成的“启动子”[6]。与自由生长的蚜虫相比,瘿蚜通常具有专化性强、个体数量大、局限于特定部位取食和极少造成寄主植物枯萎或死亡的特点,代表了一种独特的昆虫与植物相互关系的作用类型[7]。瘿蚜与寄主植物不仅仅是简单的取食与防御的关系,而是操控与适应的关系,从某种意义上说,瘿蚜与寄主植物已经形成了一种特殊的共生关系[8],因此,对瘿蚜唾液成分的研究,不仅有助于揭示虫瘿形成机理,还可为刺吸式昆虫与寄主植物的协同进化研究提供依据。
由于蚜虫个体小,特定阶段的生活期短,唾液蛋白收集困难和易于降解等原因,给蚜虫唾液的提取、分离和鉴定带来了很大困难。到目前为止,仅对豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)、麦长管蚜(Sitobion avenae)、桃蚜(Myzus persicae)和角倍蚜(Schlechtendalia chinensis)等少数种类的唾液进行过研究[9-14]。这些研究均以蚜虫为研究对象,采用双层膜夹营养液模拟蚜虫取食过程收集唾液[15],或进一步解剖蚜虫唾液腺提取蛋白并鉴定[16],因此鉴定的蛋白为模拟取食注入营养液或唾液腺贮存的蛋白,而不是蚜虫正常取食过程中注入植物组织的蛋白。本研究以五倍子蚜的重要种类肚倍蚜指名亚种(Kaburagia rhusicola rhusicola)(Aphididae: Eriosomatinae: Fordini)在青麸杨(Rhus potaninii)上形成的虫瘿为材料,根据虫瘿组织的结构特点,建立了从虫瘿组织中提取、浓缩、液质联用分析和鉴定唾液蛋白的方法,应用该方法成功提取和鉴定了肚倍蚜注入虫瘿组织中的唾液蛋白。
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经Bradford法酶标仪检测,真空冷冻干燥法浓缩样品的蛋白浓度为39 μg·mL−1;超滤膜浓缩法浓缩液中没有检测出蛋白。表明真空冷冻干燥法浓缩液中含有蛋白,且浓度已达到了质谱分析的要求,可用于虫瘿组织中肚倍蚜唾液蛋白的浓缩。
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经垂直板电泳检测,超滤膜浓缩样品的胶块,考马斯亮蓝染色时没有明显条带;真空冷冻干燥法浓缩液样品,考马斯亮蓝染色有微弱的蛋白条带,表明所收集肚倍唾液蛋白提取液的蛋白浓度较低。
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经LC-MS/MS分析,真空冷冻干燥法浓缩样品的质谱图上有蛋白质峰(图1),表明提取的蛋白已经达到了质谱分析的要求,可以进行蛋白种类鉴定与分析;超滤膜浓缩法得到的产物没有蛋白质峰。
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考马斯亮蓝染色胶块没有出现明显的条带,因此选择做溶液酶解,将质谱分析结果与豌豆蚜蛋白数据库和拟南芥蛋白数据库分别进行比对检索,分别鉴定出5种和7种,共计12种蛋白,分子量介于30.9~157.6 kDa,匹配的肽段数为1~4条,编码氨基酸长度为277~1 421(表1)。经过文献检索与蛋白功能分析,在豌豆蚜蛋白库检索的5种蛋白质中,其中编号ACYPI 006711的为延伸因子蛋白,具有GTP蛋白结合功能,该蛋白在角倍蚜(S. chinensis)的唾液和唾液腺中也被鉴定到;另有编号ACYPI 006969的为Actin蛋白,为细胞骨架结构功能蛋白,在角倍蚜唾液腺中也被鉴定到[14],其它的2种分别为组蛋白、黏合连接蛋白,具有核小体DNA结合和磷脂酸结合功能;另1种为松脂蛋白或记忆蛋白,具有mRNA分离或剪切功能。由于ACYPI 006711和ACYPI 006969蛋白在与肚倍蚜亲缘关系相近的角倍蚜唾液或唾液腺中存在(图2),并具有与虫瘿诱导相关的功能,因此可以判断从肚倍蚜虫瘿组织中鉴定的蛋白有很大的可能来自于肚倍蚜唾液,并与虫瘿的诱导和形成有关。而ACYPI007671、ACYPI003311和ACYPI002474为唾液的特异蛋白,在唾液蛋白中占有较高的比例,推测它们也可能与虫瘿的形成有关,ACYPI007671和ACYPI003311为特异结合蛋白,是完成生命活动的基本蛋白。对上述特异蛋白的功能研究,将是今后虫瘿形成机理研究的重点。从拟南芥蛋白数据库中鉴定出的7种蛋白,分别为跨膜蛋白、ATP合成蛋白、热激蛋白、伴侣蛋白和磷酸羧化酶蛋白等,其功能包括磷脂酸结合、ATP结合与合成、蛋白转运、蛋白乙酰化、卡尔文循环和CO2固定等,这些蛋白可能是在虫瘿组织切割过程中,从组织细胞间溶解的蛋白,其功能可能与寄主植物组织的基本组成或植物组织增生和生长等相关。
表 1 从虫瘿组织中鉴定的所有蛋白种类及特征
Table 1. All protein types and characteristics of K. rhusicola rhusicola identified from gall tissue
蛋白标号
Protein noName
名称Molecular Function
分子功能Sum PEP Score
总PEP分值Coverage
覆盖Peptides number
肽段数量Length/aa
长度MW/kDa
大小ACYPI 002474 Pinin/MemA protein松脂/记忆蛋白 mRNA splicing; via spliceosomemRNA剪切功能;剪接体 0.49 2.79 1 358 42.3 ACYPI 006969 Actin 42A肌动蛋白 Structural constituent of cytoskeleton细胞骨架的结构成分 4.35 12.65 4 427 48 ACYPI 006711 Elongation factor 1-alpha 2-like延伸因子蛋白 GTP bindingGTP结合功能 2.21 4.33 2 462 50.2 ACYPI 007671 histone H3 组蛋白 Histoneproteins involved in the structure of chromatin in eukaryotic cells组蛋白参与真核细胞染色质的结构 1.12 3.25 1 277 30.9 ACYPI 003311 Partitioning defective 3 homolog isoform划分有缺陷的3同系物亚型 Phosphatidic acid binding磷脂酸结合 0.83 0.56 1 1421 157.6 Q9FJY0 Uncharacterized protein未标记蛋白 Hypothetical protein保守假定蛋白质 0.51 1.95 1 614 69 Q56Y48 Transmembrane protein跨膜蛋白 Hypothetical protein保守假定蛋白质 0.49 3.08 1 325 38.2 P19366 ATP synthase subunit beta ATP合成酶亚基β ATP synthesis; ATP-binding; Chloroplast ATP合成;ATP结合;叶绿体 3.58 6.83 3 498 53.9 P21238 Chaperonin 60 subunit 伴侣蛋白 ATP-binding; Nucleotide-binding ATP结合;核苷酸结合 1.45 2.05 1 586 62 Q9FFR3 6-phosphogluconate dehydrogenase 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 Hloroplastic叶绿体 1.39 2.05 1 487 53.3 Q9LTX9 Heat shock protein 热休克蛋白 Alternative splicing; Protein transport选择性剪接;蛋白质转运 1.14 1.39 1 718 77 O03042 Ribulose bisphosphate carboxylase large chain 核糖二磷酸羧化酶大链 3D-structure; Acetylation; Calvin cycle; Carbon dioxide fixation三维结构;乙酰化;卡尔文循环;二氧化碳固定 6.61 7.10 3 479 52.9
虫瘿组织中肚倍蚜唾液蛋白的提取和鉴定
Salivary Protein Collection and Identification of Galling Aphid Kaburagia rhusicola rhusicola from Plant Gall Tissue
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摘要:
目的 唾液是蚜虫与寄主植物相互作用的重要媒介,是诱导植物形成虫瘿的关键因子,对瘿蚜唾液成分的研究,不仅有助于揭示虫瘿形成机理,还可为刺吸式昆虫与寄主植物的协同进化研究提供依据。由于蚜虫唾液的提取和浓缩难度很大,到目前为止仅对少数种类进行过研究。 方法 以五倍子蚜的重要种类肚倍蚜指名亚种在青麸杨上形成的虫瘿为材料,根据虫瘿组织的结构特点,建立了从虫瘿组织中提取、浓缩、液质联用分析鉴定唾液蛋白的方法。 结果 应用超滤膜浓缩法和冷冻干燥法处理样品,经LC-MS/MS分析,真空冷冻干燥法浓缩样品的质谱图上有蛋白质峰,成功鉴定出肚倍蚜注入虫瘿组织中的部分唾液蛋白,分子量介于30.9~157.6 kDa,匹配的肽段数为1~4条,编码氨基酸长度为277~1 421。以豌豆蚜蛋白数据库为参考鉴定出5种蛋白(ACYPI 002474、ACYPI 006969、ACYPI 006711、ACYPI 007671、ACYPI 003311),分别为松脂蛋白、肌动蛋白、延伸因子蛋白、组蛋白和黏合连接蛋白。以拟南芥蛋白数据库为参考鉴定出7种蛋白(Q9FJY0、Q56Y48、P19366、P21238、Q9FFR3、Q9LTX9、O03042),分别为跨膜蛋白、ATP合成蛋白、伴侣蛋白、热激蛋白和磷酸羧化酶蛋白等。 结论 本研究应用LC-MS/MS方法从虫瘿组织中鉴定出12种蛋白,其中编号为ACYPI 006711的为延伸因子蛋白,在角倍蚜的唾液和唾液腺中被鉴定到;编号为ACYPI 006969的为Actin蛋白,在角倍蚜唾液腺中也被鉴定到。由此可以判断,从肚倍蚜虫瘿组织中鉴定的蛋白有很大的可能来自于肚倍蚜唾液,这也为进一步研究虫瘿内唾液蛋白的功能提供了依据。 Abstract:Objectives To analyze and identify the contents of aphid saliva so as to provide reference for coevolution research between the sap-sucking insects and host plants. Method A novel method was introduced to collect and concentrate saliva of a galling aphid, Kaburagia rhusicola rhusicola, from the gall tissue on Rhus potaninii. The samples were treated by applying ultrafiltration membrane concentration and freeze drying, and analyzed by LC-MS/MS. Result Protein peaks were found on the mass spectrum of concentrated samples by vacuum freeze-drying, and partial salivary proteins were successful identified in the gall tissue of K. rhusicola rhusicola, The molecular mass was between 30.9-157.6 kDa, The number of matched peptides was 1-4, and the length of the encoded amino acid was 277-1421. Five proteins were identified in the Acyrthosiphon pisum, (ACYPI 002474, ACYPI 006969, ACYPI 006711, ACYPI 007671, ACYPI 003311), i.e. pinin protein, actin protein, elongation factor protein, histone protein and adhesive proteins. Seven proteins were identified in the Arabidopsis protein database (Q9FJY0, Q56Y48, P19366, P21238, Q9FFR3, Q9LTX9, O03042), i.e. uncharacterized protein, transmembrane protein, ATP synthase protein, chaperonin protein, heat shock protein and phosphocarboxylase protein, etc. Conclusion In this study, 12 kinds of proteins were extracted by LC-MS/MS from gall tissue. The elongation factor protein, numbered ACYPI 006711, was identified in the saliva and salivary glands of Schlechtendalia chinensis; the actin protein, numbered ACYPI 006969, was also identified in the salivary gland of Schlechtendalia chinensis. It can be inferred that the proteins identified from the gall tissues of Kaburagia rhusicola, most likely come from the saliva of the Kaburagia rhusicola rhusicola. -
表 1 从虫瘿组织中鉴定的所有蛋白种类及特征
Table 1. All protein types and characteristics of K. rhusicola rhusicola identified from gall tissue
蛋白标号
Protein noName
名称Molecular Function
分子功能Sum PEP Score
总PEP分值Coverage
覆盖Peptides number
肽段数量Length/aa
长度MW/kDa
大小ACYPI 002474 Pinin/MemA protein松脂/记忆蛋白 mRNA splicing; via spliceosomemRNA剪切功能;剪接体 0.49 2.79 1 358 42.3 ACYPI 006969 Actin 42A肌动蛋白 Structural constituent of cytoskeleton细胞骨架的结构成分 4.35 12.65 4 427 48 ACYPI 006711 Elongation factor 1-alpha 2-like延伸因子蛋白 GTP bindingGTP结合功能 2.21 4.33 2 462 50.2 ACYPI 007671 histone H3 组蛋白 Histoneproteins involved in the structure of chromatin in eukaryotic cells组蛋白参与真核细胞染色质的结构 1.12 3.25 1 277 30.9 ACYPI 003311 Partitioning defective 3 homolog isoform划分有缺陷的3同系物亚型 Phosphatidic acid binding磷脂酸结合 0.83 0.56 1 1421 157.6 Q9FJY0 Uncharacterized protein未标记蛋白 Hypothetical protein保守假定蛋白质 0.51 1.95 1 614 69 Q56Y48 Transmembrane protein跨膜蛋白 Hypothetical protein保守假定蛋白质 0.49 3.08 1 325 38.2 P19366 ATP synthase subunit beta ATP合成酶亚基β ATP synthesis; ATP-binding; Chloroplast ATP合成;ATP结合;叶绿体 3.58 6.83 3 498 53.9 P21238 Chaperonin 60 subunit 伴侣蛋白 ATP-binding; Nucleotide-binding ATP结合;核苷酸结合 1.45 2.05 1 586 62 Q9FFR3 6-phosphogluconate dehydrogenase 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 Hloroplastic叶绿体 1.39 2.05 1 487 53.3 Q9LTX9 Heat shock protein 热休克蛋白 Alternative splicing; Protein transport选择性剪接;蛋白质转运 1.14 1.39 1 718 77 O03042 Ribulose bisphosphate carboxylase large chain 核糖二磷酸羧化酶大链 3D-structure; Acetylation; Calvin cycle; Carbon dioxide fixation三维结构;乙酰化;卡尔文循环;二氧化碳固定 6.61 7.10 3 479 52.9 -
[1] 严 盈, 刘万学, 万方浩. 唾液成分在刺吸式昆虫与植物关系中的作用[J]. 昆虫学报, 2008, 51(5):537-544. doi: 10.3321/j.issn:0454-6296.2008.05.014 [2] Madhusudhan V V, Miles P W. Mobility of salivary components as possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid[J]. Entomologia Experimentalis et Applicata, 1998, 86(1): 25-39. doi: 10.1046/j.1570-7458.1998.00262.x [3] 刘长莉, 卢利霞, 许艳丽, 等. 灰飞虱唾液腺三大解毒酶家族的转录组分析[J]. 昆虫学报, 2013, 56(12):1509-1515. [4] Stone G N, Cook J M. The structure of cynipid oak galls: patterns in the evolution of an extended phenotype[J]. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 1998, 265(1400): 979-988. doi: 10.1098/rspb.1998.0387 [5] Miller D G, Crespi B. The evolution of inquilinism, host-plant use and mitochondrial substitution rates in Tamalia gall aphids[J]. Journal of Evolutionary Biology, 2003, 16(4): 731-743. doi: 10.1046/j.1420-9101.2003.00567.x [6] Harris M O, Stuart J J, Mohan M, et al. Grasses and gall midges: plant defense and insect adaptation[J]. Annual Review of Entomology, 2003, 48: 549-577. doi: 10.1146/annurev.ento.48.091801.112559 [7] Wool D. Galling aphids: Specialization, biological complexity, and variation[J]. Annual Review of Entomology, 2004, 49: 175-192. doi: 10.1146/annurev.ento.49.061802.123236 [8] Nathan P. Specialised placement of morphs within the gall of the social aphid Pemphigus spyrothecae[J]. BMC Evolutionary Biology, 2007, 7: 18. doi: 10.1186/1471-2148-7-18 [9] 娄永根, 程家安. 植物的诱导抗虫性[J]. 昆虫学报, 1997, 40(3):320-331. doi: 10.3321/j.issn:0454-6296.1997.03.018 [10] Harmel N, Létocart E, Cherqui A, et al. Identification of aphid salivary proteins: a proteomic investigation of Myzus persicae[J]. Insect Molecular Biology, 2008, 17(2): 165-174. doi: 10.1111/j.1365-2583.2008.00790.x [11] Carolan J C, Fitzroy C I, Ashton P D, et al. The secreted salivary proteome of the pea aphid Acyrthosiphon pisum characterised by mass spectrometry[J]. Proteomics, 2009, 9(9): 2457-2467. doi: 10.1002/pmic.200800692 [12] 刘 勇, 孙玉诚, 王国红. 植物和刺吸式口器昆虫的诱导防御与反防御研究进展[J]. 应用昆虫学报, 2001, 48(4):1052-1059. [13] Rao S A, Carolan J C, Wilkinson T L. Proteomic profiling of cereal aphid saliva reveals both ubiquitous and adaptive secreted proteins[J]. PloS one, 2013, 8(2): e57413. doi: 10.1371/journal.pone.0057413 [14] Yang Z X, Ma L, Francis F, et al. Proteins identified from saliva and salivary glands of the Chinese gall aphid Schlechtendalia chinensis[J]. Proteomics, 2018, 18(9): e1700378. doi: 10.1002/pmic.201700378 [15] 唐翊峰. 角倍蚜瘿外世代的生物学特性研究[D]. 北京: 中国林业科学研究院, 2014. [16] 马 琳, 杨子祥, 唐翊峰, 等. 角倍蚜唾液的提取和蛋白鉴定[J]. 环境昆虫学报, 2015, 37(2):302-307. [17] Wang Z H, Ge J Q, Chen H, et al. An insect nucleoside diphosphate kinase (NDK) functions as an effector protein in wheat-Hessian fly interactions[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2018, 100: 30-38. doi: 10.1016/j.ibmb.2018.06.003 [18] 刘 平. 角倍蚜的生态适应性研究[D]. 北京: 中国林业科学研究院, 2014. [19] 陆 沁, 杨子祥, 吴海霞, 等. 角倍蚜虫瘿的组织学结构与功能解析[J]. 环境昆虫学报, 2018, 40(1):1-10. [20] Peng Z, Miles P W. Acceptability of catechin and its oxidative condensation products to the rose aphid, Mactosiphum rosae[J]. Entomologia Experimentalis et Applicata, 1988, 47(3): 255-265. doi: 10.1111/j.1570-7458.1988.tb01144.x [21] Miles P W. Aphid saliva[J]. Biological Reviews, 1999, 74(1): 41-85. doi: 10.1017/S0006323198005271 [22] 殷海娣, 黄翠虹, 薛 堃, 等. 昆虫唾液成分在昆虫与植物关系中的作用[J]. 昆虫学报, 2006, 49(5):843-849. doi: 10.3321/j.issn:0454-6296.2006.05.020 [23] 黄海剑. 褐飞虱唾液蛋白功能及唾液腺在水稻齿叶矮缩病毒传播中的作用机制研究[D]. 浙江: 浙江大学, 2018. [24] Miles P W, Harrewijn P. Discharge by aphids of soluble secretions into dietary sources[J]. Entomologia Experimentalis et Application, 1991, 59: 123-134. doi: 10.1111/j.1570-7458.1991.tb01495.x [25] Tjallingii W F, Cherqui A. Aphid saliva and aphid - plant interactions[J]. Experimental and Applied Entomology, 1999, 10: 169-174. [26] Wang Y C, Tang M, Hao P Y, et al. Penetration into rice tissues by brown plant hopper and fine structure of the salivary sheaths[J]. Entomologia Experimentalis et Applicata, 2008, 129: 295-307. doi: 10.1111/j.1570-7458.2008.00785.x