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楸树(Catalpa bungei)为紫葳科(Bignoniaceae)梓属(Catalpa)的落叶乔木[1],是我国特有的珍贵优质用材树种和园林观赏树种,其材性优良,干形端直,树姿优美,用途十分广泛。楸树根系发达,耐旱耐寒,具有防风固沙的良好生态价值[2],其体内的活性成分具有多种药理作用[3-4]。自然状态下,楸树自花授粉不育,仅能通过昆虫的活动进行少量授粉,结实量很低,出种率仅10%左右[2];生产上,目前主要通过嫁接、组织培养等方法进行繁殖。近年来,对楸树的种质资源调查、良种选育、繁殖和栽培技术、抗性机理等方面开展了较多工作[2, 4],而对楸树生殖生物学的研究,特别是对种子和胚胎发育过程中生理特性和规律的研究少有报道[5]。
植物激素在植物胚胎发育、种子萌发、果实成熟、营养生长等生长发育的各阶段均发挥重要作用,尤其是胚胎的正常发育需要多种激素的动态平衡及某一时期某一激素的主导作用[6-8]。楸树的自花授粉不育可能与传粉受精和胚胎发育有关[5],因此,开展楸树胚胎发育过程及内源激素的研究可为探明自花授粉不育的机理奠定基础。植物体细胞胚胎发生技术是植物快速繁殖的重要手段和遗传转化的有效体系,体胚发生与合子胚发育过程具有类似的机制[9],研究合子胚发育过程中的内源激素含量变化可为体胚诱导提供参考。本研究通过对楸树胚胎发育过程中生长素、细胞分裂素、赤霉素和脱落酸等激素含量变化的分析,揭示内源激素在楸树合子胚发育过程的调控作用,可作为楸树体胚诱导中外源激素添加的依据,为解决楸树体胚诱导率低这一技术瓶颈提供理论支撑。
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植物胚胎发育始于合子胚分裂,经过原胚发育和胚的分化,最终形成成熟胚胎。合子胚第一次的不对等分裂形成的二细胞原胚直至球形胚期间的胚胎发育状态为原胚时期。双子叶原胚发育历经球形胚、心形胚、鱼雷胚时期,最终发育为子叶胚。
楸树胚胎发育过程的观察结果表明:合子胚首先进入球形胚时期(图1A),胚胎被大量透明状胚乳包裹。由于球形胚两侧的细胞单位时间内较上下的两部分细胞分裂次数多,因而产生2个子叶原基,胚胎进入心形胚阶段(图1B)。心形胚的2个侧生突起发育成为2片侧生的子叶,子叶下方的细胞发育成为胚轴,子叶和胚轴进行伸长生长,形成鱼雷胚(图1C)。从球形胚到鱼雷胚,胚胎呈现乳白色,大小变化不明显,透明状的胚乳一直存在。胚胎体积迅速增大,进入子叶胚时期,此时可见2片明显的子叶,约呈90°角,胚胎透明度有所下降(图1D)。授粉70 d后,胚胎体积进一步增加,子叶变得狭长并位于同一直线上,整个胚胎呈现长条状;此时胚乳已经完全消失,胚胎白色不透明,仅在子叶连接处为浅黄色(图1E)。再经过20 d左右的发育,胚胎成熟,为浅黄色,子叶边缘及连接处颜色较深,呈黄褐色,但胚胎的体积较早期子叶胚时有所下降(图1F)。
2个无性系的胚胎发育速度在授粉后45 d存在较大差异(表1),60粒洛楸1号种子中,处于心形胚时期的有43个,占71.67%,处于鱼雷胚时期的仅有2个;洛楸3号的胚胎发育速度更快,60粒种子中处于子叶胚时期的已有20个,占33.33%,处于心形胚和鱼雷胚时期的分别占20.00%和31.67%。这种差异表明,洛楸1号胚胎发育的同步性高,而洛楸3号胚胎发育不同步,同时存在各时期的胚胎,且各时期的比例差别也不明显。在授粉70 d后,2个无性系的胚胎都全部到达子叶胚时期,均无其它发育时间的胚胎。授粉90 d后,洛楸1号种子的长度和宽度都比授粉70 d的显著增加,且长宽比下降(图2),表明授粉70 d时胚胎未达到成熟状态,细胞仍在不断分裂。授粉90 d的洛楸3号种子与授粉70 d时相比,长度、宽度略有下降,长宽比则无显著差异(图2),表明洛楸3号的胚胎在授粉70 d后,细胞分裂基本完成,进入胚胎的成熟阶段,水分逐渐减少,干物质不断积累,因此体积稍有减小。
表 1 授粉后45、70、90 d各种胚形态所占比例
Table 1. Statistics on the proportion of various embryo forms at 45, 70 and 90 DAP
授粉后发育时间
Development time
after pollination/d无性系
Clone球形胚
Globular embryo/
%心形胚
Heart shaped embryo/
%鱼雷胚
Torpedo shaped embryo/
%子叶胚
Cotyledon embryo/
%不确定形状
Uncertain shape embryo/
%45 洛楸1号 6.67 ± 1.21 71.67 ± 0.70 3.33 ± 0.63 0.00 18.33 ± 1.33 洛楸3号 11.67 ± 0.87 20.00 ± 0.56 31.67 ± 0.83 33.33 ± 1.35 3.33 ± 0.79 70 洛楸1号 0.00 0.00 0.00 100.00 0.00 洛楸3号 0.00 0.00 0.00 100.00 0.00 90 洛楸1号 0.00 0.00 0.00 100.00 0.00 洛楸3号 0.00 0.00 0.00 100.00 0.00 -
本研究中,检测出IAA、iPA、GA1、GA7、ABA,而没检测出GA3,不同发育时期各类内源激素含量变化情况不同。
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2个无性系的不同发育时间种子内源IAA含量变化趋势不同(图3)。洛楸1号IAA含量呈先下降后上升的变化趋势,在授粉后90 d,含量到达最高,为0.70 ng·g−1。方差分析表明:3个时期的含量均差异显著。洛楸3号IAA含量则在授粉45 d时最高(1.37 ng·g−1),随后迅速下降,到授粉70 d时,仅为0.27 ng·g−1,此后变化较小(授粉后90 d为0.32 ng·g−1)。在种子发育过程中,洛楸3号IAA的含量只在授粉90 d时低于洛楸1号,而在授粉45、70 d时,其IAA的含量分别是洛楸1号的3.76倍和2.37倍。结果表明:洛楸3号在发育早期高水平的IAA促进了胚胎细胞迅速伸长,发育速度快,授粉后45 d即有约1/3的胚胎进入子叶胚时期。洛楸1号IAA的含量在发育过程中维持较低水平,导致其发育速度明显落后于洛楸3号。但在发育后期洛楸1号的IAA含量达到峰值,且高于洛楸3号,说明在此阶段其胚胎细胞仍在继续伸长,种子体积也有明显增大。
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图4表明:iPA含量在2个无性系中均极低。授粉70 d的洛楸1号种子iPA含量达到最大值,为0.023 ng·g−1,授粉45、90 d的种子iPA含量分别为0.018 9、0.019 2 ng·g−1;而洛楸3号种子iPA含量在3个发育时期均低于0.02 ng·g−1。方差分析表明:2个无性系的iPA含量在3个发育时期中均差异不显著。
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2个无性系中的GAs含量变化趋势一致,均随着发育进程下降(图5)。洛楸1号种子的GA1含量在授粉后45 d最高,为29.81 ng·g−1,此后就迅速下降;授粉后70 d,含量为3.74 ng·g−1;至授粉90 d时,其含量仅为1.06 ng·g−1。洛楸3号种子GA1含量同样在授粉45 d时达到最大值(9.31 ng·g−1),而授粉后70、90 d的含量分别为0.76 、0.56 ng·g−1。洛楸1号GA1的含量在各个发育时间都明显高于洛楸3号,分别是洛楸3号含量的3.20、4.92、1.89倍。2个无性系中GA7含量的变化与GA1相同,都在授粉后45 d的含量最高,并与后2个时期的含量差异显著,且同样是洛楸1号GA7含量高于洛楸3号的含量,差异倍数的最大值也出现在授粉70 d时(差异倍数分别为3.95、4.69、2.67倍)。GAs含量(GA1 + GA7)呈现与2种赤霉素相同的变化趋势,授粉后45 d的含量显著高于后2个时期,而授粉70 d与90 d的含量差异不显著。GA7的含量在整个发育过程中都远低于GA1的含量,2个无性系中GA7含量在3个发育时间均不超过GAs的20%。
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2个无性系种子的内源ABA含量在发育全程中明显高于IAA、iPA和GAs(GA1 + GA7)的含量,且在2个无性系中变化趋势基本一致(图6)。洛楸1号授粉后45 d,ABA含量高达349.78 ng·g−1,随后逐渐下降,到授粉后90 d含量最低,但仍达到96.90 ng·g−1。洛楸3号的ABA含量同样在授粉后45 d最高(189.51 ng·g−1),授粉后90 d最低(43.33 ng·g−1)。方差分析表明:洛楸1号3个发育时间的ABA含量均差异显著;洛楸3号授粉后45 d的ABA含量显著高于授粉后90 d的含量,但授粉后70 d的ABA含量与另2个时期均差异不显著。与GAs含量类似,洛楸3号的ABA含量在发育全程中均低于洛楸1号,差异倍数在授粉70 d时最低(1.76倍)。
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种子的发育是多种植物激素共同作用的结果,激素之间既相互制约又相互促进。由图7可知:洛楸1号IAA/ABA和iPA/ABA的比值呈上升趋势,授粉后90 d的比值显著高于前2个时期的比值,但授粉后45 d和70 d的比值差异并不显著;GAs/ABA和(IAA + iPA + GAs)/ABA的比值变化趋势相同,最高值均出现在授粉后45 d,与后2个时期的比值差异显著,而授粉后70 d和90 d的比值差异不显著。洛楸3号IAA/ABA的比值先下降后上升,授粉后70 d的比值最小(0.002),显著低于授粉后45 d的比值(0.007),但该比值在授粉后70 d与90 d、45 d与90 d之间的差异均不显著;洛楸3号的iPA/ABA、GAs/ABA和(IAA + iPA + GAs)/ABA比值变化趋势与洛楸1号相同。2个无性系中IAA和iPA的含量均明显低于GAs含量,GAs占促进生长类激素(生长素、细胞分裂素和赤霉素)的主体,因此,导致(IAA + iPA + GAs)/ABA的比值由GAs/ABA的比值决定,并呈现相同的变化趋势。
楸树种子发育过程中内源激素含量的动态变化
Dynamic Changes of Endogenous Hormone Content in Catalpa bungei Seeds During Their Developmental Periods
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摘要:
目的 分析楸树种子发育过程中内源激素含量的动态变化,为探明楸树自花不育机理和在体胚诱导过程中添加外源激素的评估提供参考。 方法 以2个楸树无性系(洛楸1号和洛楸3号)授粉后不同时间的种子为材料,监测楸树胚胎发育过程,并采用液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)测定种子发育过程中IAA、iPA、GAs、ABA 4种内源激素含量的变化。 结果 洛楸3号种子的发育速度比洛楸1号的快;2个无性系种子IAA含量呈先下降后上升的趋势,但洛楸3号IAA含量在发育早期(授粉后45 d)即达到顶峰,而洛楸1号则在授粉后90 d才到达最大值;2个无性系种子iPA含量在发育过程中无显著变化,GAs和ABA含量呈持续下降趋势;2个无性系种子iPA/ABA、GAs/ABA和(IAA + iPA + GAs)/ABA的比值变化趋势一致,洛楸1号IAA/ABA的比值呈上升趋势,而洛楸3号IAA/ABA的比值先下降后上升。 结论 楸树种子发育过程中内源激素的含量随着胚胎发育而发生动态变化。IAA含量和IAA/ABA比值的差异是造成2个无性系胚胎发育速度差异的主要原因;早期胚胎发育需要较高的促进生长类激素,随后抑制生长类激素比例显著上升,促进胚胎与种子的成熟。 Abstract:Objective To analyze the dynamic changes of endogenous hormone content during seed development of Catalpa bungei in order to reveal the mechanism of self-fertilization, as well as to provide evidence for adjusting the addition of exogenous hormones during somatic embryogenesis. Method The morphological changes of seeds of of two C. bungei clones (C. bungei 'Luoqiu 1', and C. bungei 'Luoqiu 3') were observed during their development after pollination. Their concentrations of IAA, iPA, GAs and ABA were analyzed using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Result The seed of clone C. bungei 'Luoqiu 3' developed faster than that of clone C. bungei 'Luoqiu 1'. The content of IAA in the two clones decreased at first and then increased, and the IAA content of clone C. bungei 'Luoqiu 3' reached its peak at the early stage of development (the 45th day after pollination), while that of clone C. bungei 'Luoqiu 1' reached its maximum value at 90th day after pollination. There was no significant change in iPA content in the seeds of the two clones, and the contents of GAs and ABA decreased continuously. The ratio of iPA/ABA, GAs/ABA and (IAA + iPA + GAs)/ABA of two clones showed the same trend, and the ratio of IAA/ABA of clone C. bungei 'Luoqiu 1' was on the rise, while this ratio of clone C. bungei 'Luoqiu 3' decreased at first and then increased. Conclusion The content of endogenous hormones of C. bungei seeds shows a dynamic change with the embryo development. The differences in IAA content and IAA/ABA ratio are the main reason for the difference of embryo development rate between the two clones. Early embryo development requires a high proportion of growth promoting hormones, followed by a significant increase in the proportion of growth inhibiting hormones, promoting embryo and seed maturation. -
Key words:
- Catalpa bungei
- / seed development
- / endogenous hormones
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表 1 授粉后45、70、90 d各种胚形态所占比例
Table 1. Statistics on the proportion of various embryo forms at 45, 70 and 90 DAP
授粉后发育时间
Development time
after pollination/d无性系
Clone球形胚
Globular embryo/
%心形胚
Heart shaped embryo/
%鱼雷胚
Torpedo shaped embryo/
%子叶胚
Cotyledon embryo/
%不确定形状
Uncertain shape embryo/
%45 洛楸1号 6.67 ± 1.21 71.67 ± 0.70 3.33 ± 0.63 0.00 18.33 ± 1.33 洛楸3号 11.67 ± 0.87 20.00 ± 0.56 31.67 ± 0.83 33.33 ± 1.35 3.33 ± 0.79 70 洛楸1号 0.00 0.00 0.00 100.00 0.00 洛楸3号 0.00 0.00 0.00 100.00 0.00 90 洛楸1号 0.00 0.00 0.00 100.00 0.00 洛楸3号 0.00 0.00 0.00 100.00 0.00 -
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