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微管是由α、β-微管蛋白以异二聚体的形式组装而成的中空管状结构[1]。植物细胞中,微管可以快速的聚合或者解聚、迅速转变微管列阵,对细胞的正常扩张和分化具有重要作用。微管结合蛋白(MAP)是一类对微管的组装和功能具有调控作用的蛋白[2]。Changjie等最早从烟草(Nicotiana tabacum L.) BY-2 (‘Bright Yellow-2’)悬浮培养细胞中分离得到一类与微管紧密结合且分子量约为65 kD的蛋白,即MAP65[3]。MAP65蛋白通常定位于一种或几种微管列阵上,是一类可与微管交联并促进微管成束的微管结合蛋白[4]。
从烟草BY-2悬浮培养细胞中分离出小原生质体,制备胞质提取物,之后加入紫杉醇协助组装微管,再将微管和MAP低温高速离心以去组装,经过数次组装-去组装循环,分离得到3个烟草MAP65蛋白[5]。后用同样的方法在胡萝卜(Daucus carota L.)悬浮细胞中分离得到3个胡萝卜MAP65蛋白[6]。随着拟南芥(Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.)与水稻(Oryza sativa L.)基因组测序的完成,拟南芥和水稻中分别鉴定出了9和11个MAP65蛋白家族成员[7-8]。小立碗藓 (Physcomitrella patens (Hedw.) Bruch & Schimp.)中克隆得到了5个MAP65基因[9]。对拟南芥MAP65蛋白家族的研究表明,9个成员之间氨基酸相似性为28%~79%,C端序列同源性尤其低,C端包含与微管特定结合的结构域,决定了微管聚合的速率,不同基因的C端微管结合结构域不同,故以不同的效率促进微管聚合[10]。ATMAP65-1和ATMAP65-2促进扩增细胞的轴向生长,但不是维持细胞营养生长和生殖生长所必需[11]。ATMAP65-3的缺失导致成膜体异常,胞质分裂不完全及植株发育异常[12]。ATMAP65-4和ATMAP65-3具有高度同源性,功能相似,交联成膜体中的相邻反向平行的微管,这2个基因的同时缺失会导致植株生长受到严重影响[13]。ATMAP65-5在整个细胞周期中均有表达,且对微管解聚药具有更强的耐受力[14]。ATMAP65-6对微管聚合没有促进作用,但可诱导微管形成网状结构,该蛋白定位于线粒体,可能参与线粒体相关功能的实现[15]。植物中MAP65基因家族的成员数量较多,且在细胞周期的不同微管列阵中具有不完全相同的定位模式,在不同组织中的表达量亦存在差异,这预示该基因家族在植物中具有功能的分化[10,16-17]。
毛果杨(Populus trichocarpa Torr. & Gray)作为第一个完成基因组测序的木本植物,为鉴定木本植物MAP65基因家族成员和分析其进化及功能提供了可能[18]。本研究在毛果杨中鉴定出9个MAP65,通过其理化性质分析、亚细胞定位的预测、系统进化分析、基因结构和保守结构域分析、共线性分析及同义突变频率 (Ks)、非同义突变频率(Ka)分析、组织表达量以及启动子顺式作用元件分析,探究了PtMAP65基因家族的进化扩张模式,以期揭示PtMAP65基因家族的进化生物学意义,并为进一步研究PtMAP65基因家族成员的潜在功能提供新的线索。
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通过在线BLASTP比对,从毛果杨中鉴定出14个候选的MAP65s。SMART和NCBI-CDD 分析结果显示:14条蛋白序列都具有完整或不完整的MAP65_ASE1 结构域 (PF03999);经过比对建树分析,删除影响树形的序列,最后得到9个MAP65s。根据其在染色体上的分布情况,将其命名为PtMAP65-1到PtMAP65-9(表1)。PtMAP65蛋白家族成员的氨基酸长度变化范围为570~730 aa,分子量变化范围为64.65~83.00 kDa,等电点变化范围为5.17~8.45。综合考虑PtMAP65蛋白家族成员用3种方法预测的亚细胞定位,最终预测:PtMAP65-1、PtMAP65-3和PtMAP65-9位于细胞核,PtMAP65-8位于叶绿体,其余成员位于细胞质。
表 1 PtMAP65基因家族及其理化性质
Table 1. The information of the PtMAP65 gene family
基因名称
Gene name基因登陆号
ID (Phytozome v12.1)DNA长度
DNA length/bpCDS长度
CDS length/bp氨基酸长度
amino acid length/aa分子量
Molecular weight/kDa等电点
pI预测的亚细胞定位
Predicted subcellular localizationPtMAP65-1 Potri.001G055100 4 089 1 809 602 68.73 5.70 细胞核 PtMAP65-2 Potri.001G356500 5 285 1 746 581 65.05 5.17 细胞质 PtMAP65-3 Potri.003G173300 4 551 1 779 592 67.62 5.87 细胞核 PtMAP65-4 Potri.003G192400 6 668 1 713 570 64.65 7.25 细胞质 PtMAP65-5 Potri.008G139700 7 530 1 803 600 68.12 7.14 细胞质 PtMAP65-6 Potri.011G092500 4 939 1 749 582 65.37 5.21 细胞质 PtMAP65-7 Potri.012G129600 4 717 1 755 584 67.08 5.41 细胞质 PtMAP65-8 Potri.014G070100 4 294 2 163 720 81.53 8.45 叶绿体 PtMAP65-9 Potri.015G131400 4 795 2 193 730 83.00 5.65 细胞核 -
为研究植物MAP65-Likes的系统进化关系,采用邻接法对毛果杨、拟南芥、烟草、水稻、巨桉、挪威云杉等物种的MAP65-Like蛋白构建系统进化树,校验参数(Bootstrap)分别为1 000次和5 000次重复,结果差异很小,图1中系统进化树的Bootstrap为1 000。从图1可以看出:该植物基因家族分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ5个亚组,裸子植物的MAP65-Likes仅分布于Ⅰ亚组和Ⅴ亚组中,且独立地聚为一簇;被子植物的MAP65-Likes在5个亚组中均有分布,且单子叶和双子叶植物MAP65s均匀地分布于各个亚组,这说明5个亚组的分化发生于裸子植物和被子植物分化之后、单子叶植物和双子叶植物分化之前。在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ4个亚组中,单子叶植物和双子叶植物的MAP65-Likes各自聚为一簇,在Ⅴ亚组中,双子叶植物毛果杨、拟南芥和烟草的4个MAP65-Likes聚为一簇,其他8个MAP65-Likes与单子叶植物水稻的3个MAP65s聚为一簇。在Ⅰ亚组中,PtMAP65-2/PtMAP65-6组成旁系同源基因对,并与ATMAP65-1/ATMAP65-2这一对旁系同源基因聚为一支;在Ⅱ亚组中,PtMAP65-4/Eucgr.J00083.1组成直系同源基因对,并与ATMAP65-5聚为一支;在Ⅲ亚组中,PtMAP65-1/PtMAP65-3组成旁系同源基因对,并与Eucgr.B03489.1聚为一支;在Ⅴ亚组中,PtMAP65-7/PtMAP65-9组成旁系同源基因对,并与旁系同源基因对Eucgr.K00145.1/Eucgr.A02875.1聚为一支,另外,PtMAP65-8/ATMAP65-4组成直系同源基因对;在Ⅳ亚组中,PtMAP65-5/Eucgr.G02071.1组成直系同源基因对,这表明MAP65家族中毛果杨与巨桉的亲缘关系最近,这也与二者是多年生木本植物相一致。
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为分析MAP65家族成员的基因结构特征,利用GSDS绘制了毛果杨、拟南芥、烟草和水稻MAP65家族成员的基因结构图。图2A表明:在Ⅰ亚组中,9个MAP65s有9个外显子、8个内含子,仅ATMAP65-1有8个外显子、7个内含子;在Ⅱ亚组中,MAP65有11个外显子、10个内含子;在Ⅲ亚组中,3个MAP65有11个外显子、10个内含子,LOC_Os08g41890.1有10个外显子、9个内含子;在Ⅳ亚组中,5个MAP65有11个外显子、10个内含子,仅LOC_Os03g50970.1有13个外显子、12个内含子;在Ⅴ亚组中,MAP65的外显子个数为9~12、内含子个数为8~11。另外,在各个亚组中,外显子的长度相似,内含子的长度差异较大,而同一物种的MAP65之间的内含子长度更相似。
图 2 MAP65家族的基因结构和保守结构域分析
Figure 2. Gene structures and protein domains analysis of MAP65 gene family
利用MEME分析了MAP65蛋白家族的保守结构域。图2B表明:各个MAP65蛋白家族成员具有11~15个不等的结构域,第1、2、3、4、6、7、8、9、11、12和15个结构域较保守,在32条MAP65蛋白序列中均有分布。另外,植物MAP65蛋白序列的C端结构域较多变,各个亚组的MAP65蛋白具有相似的结构域分布。
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根据毛果杨基因组序列文件和注释文件,分析了9个PtMAP65基因在染色体的定位情况。PtMAP65-1和PtMAP65-2位于Chr01,PtMAP65-3和PtMAP65-4位于Chr03,PtMAP65-5到PtMAP65-9分别位于Chr08、Chr11、Chr12、Chr14和Chr15。毛果杨基因组内共线性分析结果显示:MAP65基因家族中共有6对复制基因,且均为片段复制,其中PtMAP65-7、PtMAP65-8和PtMAP65-9互为复制基因(图3)。利用DnaSP5计算复制基因对的Ka和Ks,算得的Ks值为0.2341~1.9338,表明复制时间最早发生于106.25百万年前,最晚发生于12.86百万年前;除复制基因对PtMAP65-4/Potri.001G032566的Ka/Ks为0.617 3外,其余复制基因对的Ka/Ks < 0.25,表明PtMAP65基因家族在进化过程中受到强纯化选择的作用(表2)。
图 3 PtMAP65基因家族染色体分布与复制基因对
Figure 3. Chromosomal locations and duplicated gene pairs of PtMAP65 gene family
表 2 复制基因对的Ks、Ka分析
Table 2. Ks and Ka analysis of duplicated gene pairs
复制基因对
Pair of duplication gene同义突变频率
Ks非同义突变频率
Ka非同义突变率与同义突变率的比值
Ka/Ks复制时间/(百万年前)
Duplication time/(Million years ago)PtMAP65-1 PtMAP65-3 0.242 3 0.047 6 0.196 5 13.31 PtMAP65-2 PtMAP65-6 0.276 7 0.044 3 0.160 1 15.20 PtMAP65-4 Potri.001G032566 0.234 1 0.144 5 0.617 3 12.86 PtMAP65-7 PtMAP65-8 1.933 8 0.307 3 0.158 9 106.25 PtMAP65-7 PtMAP65-9 0.242 2 0.056 7 0.234 1 13.31 PtMAP65-8 PtMAP65-9 1.761 2 0.300 0 0.170 3 96.77 -
为了解转录调控机制,利用PlantCARE数据库分析PtMAP65基因家族启动子的顺式作用元件。根据顺式作用元件的功能,将其分为光响应元件、激素响应元件、逆境胁迫响应元件和植物生长发育元件。图4表明:在PtMAP65基因家族中,光响应元件和激素响应元件的个数较多,逆境胁迫响应元件和植物生长发育元件的个数较少;PtMAP65-3中的激素响应元件远多于其他基因,PtMAP65-4、PtMAP65-7和PtMAP65-8中未预测到植物生长发育元件。
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从Populus eFP browser数据库下载得到PtMAP65基因家族成员在成熟叶、幼叶、根、雌花、雄花和木质部中的表达数据,绘制热图。图5表明:复制基因对PtMAP65-2/PtMAP65-6在幼叶、根和木质部均有高度表达;复制基因对PtMAP65-7/PtMAP65-8在雌花和雄花中高度表达;PtMAP65-3在木质部中表达量最高;PtMAP65-1和PtMAP65-4主要在幼叶和雌花中表达;PtMAP65-5在幼叶和根中表达水平较高;PtMAP65-9在各个组织表达水平较低。
毛果杨MAP65基因家族的扩张与表达分析
Expansion and Expression Analysis of PtMAP65 Gene Family in Populus trichocarpa
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摘要:
目的 以林木模式植物毛果杨为研究材料,旨在研究毛果杨MAP65基因家族成员的扩张与表达情况,为MAP65的功能研究提供参考。 方法 利用BLASTP基于Phytozome数据库鉴定毛果杨的MAP65基因家族成员,采用Prot-Param、Plant-mPLoc、LocTree3、Wolfpsort、MAGA7.0、GSDS、MEME、MCScanX、TBtools、BioEdit Sequence Alignment Editor、DnaSP5、plantCARE等工具分析其理化性质,预测其亚细胞定位,构建系统进化树,绘制基因结构图,分析保守结构域、基因复制事件、启动子元件,并基于基因芯片数据分析PtMAP65基因家族成员在不同组织中的表达量。 结果 利用BLASTP比对方法鉴定得到了9个MAP65基因。系统进化分析结果显示:植物MAP65基因家族分为5个亚组,且每个亚组都具有相似的基因结构和保守结构域。毛果杨基因组内共线性分析及同义突变频率 (Ks)、非同义突变频率(Ka)分析结果表明:PtMAP65基因家族中有6对片段复制基因,且复制基因在进化过程中受到强纯化选择的作用。PtMAP65基因家族成员的表达数据分析显示:该基因家族成员在不同组织中有不同的表达模式,暗示其功能的分化。启动子的顺式作用元件分析表明:PtMAP65s的启动子中有较多的光响应元件和激素响应元件。 结论 片段复制是PtMAP65基因家族进化扩张的主要动力,推测基因家族成员之间存在功能分化。 Abstract:Objective To study the expansion and expression of the MAP65 gene family members by using Populus trichocarpa, a model forest plant, as research material. Method Using BLASTP to identify the members of PtMAP65 gene family based on Phytozome database, and using tools such as Prot-Param, Plant-mPLoc, LocTree3, Wolfsort, MAGA7.0, GSDS, MEME, MCScanX, TBtools, BioEdit Sequence Alignment Editor, DnaSP5 and plantCARE to analyze the physical and chemical properties, predict subcellular locations, construct a phylogenetic tree, draw a gene structure diagram, analyze conserved domains, gene duplication events and promoter elements; and analyze the expression of PtMAP65 gene family members in different tissues based on gene chip data. Result Nine MAP65 genes were identified by BLASTP comparison. Phylogenetic analysis showed that the plant MAP65 gene family can be divided into 5 groups, and each group had a similar gene structure and conserved domain. The results of collinearity analysis and Ka and Ks analysis of the P. trichocarpa genome indicated that there were six pairs of segmental duplication genes in the PtMAP65 gene family, and the duplication genes were subject to strong purification selection in the evolutionary process. Analysis of the expression data showed that PtMAP65 gene family members had different expression patterns in different tissues, suggesting their functional divergence. Cis-acting element analysis of the promoter showed that PtMAP65s promoter had more light response and hormone response elements than stress response, growth and development elements. Conclusion Segmental duplication is a main force driving the evolution and expansion of PtMAP65 gene family, and it is speculated that there has been functional divergence among the PtMAP65 gene family members. -
Key words:
- Populus trichocarpa
- / PtMAP65
- / phylogenetic analysis
- / gene structure
-
表 1 PtMAP65基因家族及其理化性质
Table 1. The information of the PtMAP65 gene family
基因名称
Gene name基因登陆号
ID (Phytozome v12.1)DNA长度
DNA length/bpCDS长度
CDS length/bp氨基酸长度
amino acid length/aa分子量
Molecular weight/kDa等电点
pI预测的亚细胞定位
Predicted subcellular localizationPtMAP65-1 Potri.001G055100 4 089 1 809 602 68.73 5.70 细胞核 PtMAP65-2 Potri.001G356500 5 285 1 746 581 65.05 5.17 细胞质 PtMAP65-3 Potri.003G173300 4 551 1 779 592 67.62 5.87 细胞核 PtMAP65-4 Potri.003G192400 6 668 1 713 570 64.65 7.25 细胞质 PtMAP65-5 Potri.008G139700 7 530 1 803 600 68.12 7.14 细胞质 PtMAP65-6 Potri.011G092500 4 939 1 749 582 65.37 5.21 细胞质 PtMAP65-7 Potri.012G129600 4 717 1 755 584 67.08 5.41 细胞质 PtMAP65-8 Potri.014G070100 4 294 2 163 720 81.53 8.45 叶绿体 PtMAP65-9 Potri.015G131400 4 795 2 193 730 83.00 5.65 细胞核 表 2 复制基因对的Ks、Ka分析
Table 2. Ks and Ka analysis of duplicated gene pairs
复制基因对
Pair of duplication gene同义突变频率
Ks非同义突变频率
Ka非同义突变率与同义突变率的比值
Ka/Ks复制时间/(百万年前)
Duplication time/(Million years ago)PtMAP65-1 PtMAP65-3 0.242 3 0.047 6 0.196 5 13.31 PtMAP65-2 PtMAP65-6 0.276 7 0.044 3 0.160 1 15.20 PtMAP65-4 Potri.001G032566 0.234 1 0.144 5 0.617 3 12.86 PtMAP65-7 PtMAP65-8 1.933 8 0.307 3 0.158 9 106.25 PtMAP65-7 PtMAP65-9 0.242 2 0.056 7 0.234 1 13.31 PtMAP65-8 PtMAP65-9 1.761 2 0.300 0 0.170 3 96.77 -
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