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红桦(Betula albo-sinensis Burk.)是桦木科桦木属树种,为我国特有种,分布于陕西、甘肃、宁夏、青海、云南、四川、湖北、河北、河南、山西等地,垂直分布海拔为1000~3400 m。树高可达30 m,树皮为淡红褐色或紫红色,呈薄层状剥落,剥落树皮为纸质[1]。
红桦枝干挺拔,颜色亮丽,观赏价值高,可用于园林绿化;其独特的纸质树皮可用于工艺品制作以及包装行业,具有较高的经济价值;其木材质地坚韧,结构细密,可作优良的板材;适应能力强,亦可用做荒山造林树种,是我国北方高海拔地区重要的先锋造林树种,也是高山主要成林树种[2]。但由于20世纪70~80年代的大量砍伐,红桦原始林遭到了严重破坏,采伐后恢复起来的次生林,林分密度过大、质量不高,生产力低,各种生态和社会服务功能没有得到有效发挥,且红桦种子天然萌发对光照和昼夜温差要求较高,种子更新困难[3],因此,建立简单高效的红桦再生体系具有重要意义。
国外在桦树组织培养方面先后建立了纸桦(B.papyrifera Marshall)[4]、日本白桦(B. platyphylla var. Japonica)[5]、垂枝桦(B. pendula Roth.)[6]等桦树的组培再生体系;我国从20世纪70年代开始,亦已进行了白桦(B. platyphylla Suk.)[7]、光皮桦(B. luminifera H.Wink.)[8]、西南桦(B. alnoides Buch Ham.ex D.Don)[9]、裂叶垂枝桦[10]等桦木组织培养体系研究。
由于国内对于红桦组织培养方面的研究尚无,故本研究通过器官发生途径建立高效稳定的红桦组织培养技术体系,以期为红桦良种选育、定向培育及遗传转化等方面的研究提供理论支持,为高海拔地区荒山红桦造林提供技术支持,同时也可填补红桦无性繁殖研究方面的空白。
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高污染率、褐化死亡率及低萌发率极大地限制了植物组织培养体系的建立。由表1可以看出:灭菌剂处理时间不同,外植体接种后生长状态不同;随着0.1% HgCl2处理时间的延长,外植体的污染率呈现逐渐降低的趋势,但与此同时,由HgCl2自身引起的外植体褐化程度也逐渐加剧,当处理时间为8 min时,除去褐化及污染的影响,外植体萌发率达到所有处理中最高值,为60%。因此,综合上述3个指标,筛选出最适宜红桦外植体消毒灭菌的方法为:先用70%酒精消毒30 s,无菌水冲洗3~4次,然后用0.1% HgCl2消毒8 min,无菌水冲洗5~6次。
表 1 0.1% HgCl2灭菌时间对无菌外植体获得的影响
Table 1. Effects of 0.1% HgCl2 sterilization time on the acquisition of sterile explants
试验号
Test number灭菌时间/min
Sterilization time外植体数/个
Number of explants污染率/%
Pollution rate褐化死亡率/%
Browning mortality rate萌发率/%
Germination rateA1 4 60 51.7 ± 0.19a 6.7 ± 0.09a 41.7 ± 0.15a A2 6 60 45.0 ± 0.22b 15.0 ± 0.31ab 40.0 ± 0.18a A3 8 60 15.0 ± 0.25c 25.0 ± 0.27b 60.0 ± 0.32b A4 12 60 13.3 ± 0.17c 58.3 ± 0.19c 28.3 ± 0.44a 注:表中数据为平均值 ± 标准差,不同小写字母表示不同处理间差异显著(p < 0.05),下同。
Notes: The data in the table are the mean ± standard deviation, and different lowercase letters indicate significant differences between different treatments (p < 0.05), the same below. -
初代培养结果(表2)表明:不同激素组合对休眠芽的萌发以及生长状态影响不同;当添加一定浓度的NAA时,随着6-BA浓度的增加,外植体的萌发率总体呈先上升后下降的趋势,当NAA浓度为0.1 mg·L−1、6-BA浓度为1.5 mg·L−1时,外植体萌发率达到最高,为83.33%,且此时外植体生长状态最佳,休眠芽在培养1周左右时开始萌发,叶片全部展开后茎也逐渐开始伸长生长;而当6-BA浓度一定时,NAA浓度升高,外植体萌发率逐渐下降,外植体生长状态无明显变化,当NAA浓度为0.2 mg·L−1时,所有处理下的外植体均不产生茎,平均萌发率也较添加0.1 mg·L−1 NAA时下降了10.61%。休眠芽初代培养过程中最主要的问题是只萌发展叶而不伸长生长,这样状态的外植体无法用于增殖以及生根培养。初代培养所有试验中,只有B4和B5处理下,外植体产生了茎,但B5诱导产生的茎较细弱,且叶片出现黄化现象,综合考虑,红桦休眠芽初代培养最佳激素配比组合为1.5 mg·L−1 6-BA+0.1 mg·L−1 NAA。
表 2 植物生长调节剂对初代培养的影响
Table 2. Effects of plant growth regulators on primary culture
试验号
Test number植物生长调节剂浓度/(mg·L−1)
Concentration of plant growth regulator外植体数/个
Number of explants萌发率/%
Germination rate外植体生长状态
The growth state of the explants6-BA NAA IBA B1 0.8 0.1 0 30 53.33 ± 0.65 abc 基部无愈伤,无茎,叶皱缩 B2 1.0 0.1 0 30 56.67 ± 0.91 abc 基部无愈伤,无茎,叶破损发黄 B3 1.2 0.1 0 32 62.50 ± 0.34 abc 基部无愈伤,无茎,叶正常 B4 1.5 0.1 0 30 83.33 ± 0.55 d 基部有褐色疏松愈伤,茎健康,叶鲜绿 B5 1.8 0.1 0 28 71.43 ± 0.67 cd 基部有米黄色疏松愈伤,茎细弱,叶发黄 B6 2.0 0.1 0 28 72.41 ± 0.39 cd 基部有米黄色疏松愈伤,无茎,叶蜷曲发黄 B7 0.8 0.2 0 30 46.67 ± 0.44 abc 基部无愈伤,无茎,叶黄化 B8 1.0 0.2 0 32 56.25 ± 0.43 abc 基部无愈伤,无茎,叶破损发黄 B9 1.2 0.2 0 31 67.74 ± 0.58 bcd 基部有绿色紧实愈伤,无茎,叶黄化 B10 1.5 0.2 0 31 64.51 ± 0.71 bc 基部有绿色愈伤,无茎,叶皱缩 B11 1.8 0.2 0 29 62.07 ± 0.66 abc 基部有米黄色疏松愈伤,无茎,叶蜷曲发黄 B12 2.0 0.2 0 30 60.00 ± 0.80 abc 基部有米黄色疏松愈伤,无茎,叶黄化 B13 1.5 0.1 0.02 30 43.33 ± 0.63 a 基部产生绿色愈伤,无茎,叶正常 B14 1.5 0.1 0.05 30 50.00 ± 0.57 ab 基部产生绿色愈伤,无茎,叶正常 -
将红桦带芽茎段接种到含有不同激素配比的增殖培养基中,培养约7 d茎段基部开始分化出芽点,周围产生绿色愈伤组织。培养40 d后的统计结果(表3)表明:增殖系数以及增殖苗健康指数均随6-BA浓度的升高呈先上升后下降的趋势,当6-BA浓度为1.5 mg·L−1时,增殖系数较1.0、2.0 mg·L−1浓度分别高出66.54%、62.37%,健康指数分别高出64.18%、46.67%,增殖情况最佳;随着NAA浓度增加,增殖系数和健康指数的变化趋势也表现为先上升后下降,在浓度为0.02 mg·L−1时,平均增殖系数为3.73,平均健康指数为1.75,均达到3个浓度处理中最高值。因此,红桦增殖培养最佳植物生长调节剂配比为1.5 mg·L−1 6-BA+ 0.02 mg·L−1 NAA,此处理下红桦增殖系数达到4.77,健康指数达到2.45。
表 3 植物生长调节剂对增殖培养的影响
Table 3. Effects of plant growth regulators on the proliferation culture
试验号
Test number植物生长调节剂浓度/(mg·L−1)
Concentration of plant growth regulator增殖系数
Proliferation coefficient健康指数
Health index6-BA NAA C1 1.0 0.01 2.56 ± 0.15ab 1.28 ± 0.13a C2 1.0 0.02 3.04 ± 0.12ab 1.24 ± 0.09a C3 1.0 0.05 2.57 ± 0.32ab 1.51 ± 0.22a C4 1.5 0.01 4.45 ± 0.21ab 2.16 ± 0.32a C5 1.5 0.02 4.77 ± 0.18a 2.45 ± 0.14a C6 1.5 0.05 4.37 ± 0.22ab 1.99 ± 0.25a C7 2.0 0.01 2.67 ± 0.41ab 1.64 ± 0.23a C8 2.0 0.02 3.39 ± 0.24ab 1.55 ± 0.16a C9 2.0 0.05 2.30 ± 0.21b 1.32 ± 0.26a -
生根培养约7 d,外植体基部可见嫩根生出,生根培养过程中也伴随着壮苗效果,组培苗的长 势逐渐变好,茎变粗,叶片变大且颜色由淡绿变为翠绿。培养25 d不同基本培养基以及不同浓度IBA对生根的影响见图1,3种不同基本培养基下的平均生根率(图1A)高低次序依次为:1/2 MS >WPM > MS,1/2 MS培养下的平均生根率为84.9%, 为MS培养的2.6倍;虽然1/2 MS培养下红桦生根率最高,但其平均生根条数(图1B)、根长(图1C)、生根指数(图1D)均小于WPM培养下生根苗的相应指标,分析根健康指数(图1E),WPM培养下根健康指数平均为1.77,高于另外2种基本培养基,生根苗也更易移植成活,因此,红桦最佳生根基本培养基为WPM。
图 1 基本培养基类型及IBA浓度对红桦不定根诱导的影响
Figure 1. Effects of basic medium type and IBA concentration on the induction of adventitious roots of Betula albo-sinensis
不同浓度IBA处理的平均生根率高低次序为:0.8>1.0>0.5>0.4 mg·L−1,分别为75.8%、74.2%、73.3%、14.67%,可看出IBA浓度与生根率先呈正相关,在0.8 mg·L−1时生根率达最高值,而当浓度升至1.0 mg·L−1时,生根率则有所下降。综合考虑生根率及无根单株生根状态,即生根数、根长、健康指数及生根指数,得出以WPM为基本培养基,附加0.8 mg·L−1 IBA时生根效果最佳,此处理下生根率达到100%,健康指数也高达2.61。
蔗糖浓度对生根培养的影响见表4,生根率随蔗糖浓度的升高而逐渐增加,当浓度超过25 g·L−1时,各处理间的差异并不显著。在浓度为30、35 g·L−1时均达到了100%的生根率,但在30 g·L−1蔗糖的处理下,平均生根条数、根长、生根指数、健康指数均高于35 g·L−1的处理,表明红桦生根培养添加最适蔗糖浓度应为30 g·L−1。
表 4 蔗糖浓度对生根培养的影响
Table 4. Effects of sucrose concentration on rooting culture
试验号
Test number基本培养基
Basic medium蔗糖浓度/(g·L−1)
Concentration of Sucrose生根率/%
Rooting rate平均生根数/条
Mean rooting number根长/cm
Root length生根指数
Rooting index健康指数
Health indexE1 WPM 20 72 ± 3.09 b 3.06 ± 0.21 b 4.21 ± 0.40 a 9.28 ± 0.62 b 2.11 ± 0.15 a E2 25 96 ± 2.54 a 3.25 ± 0.19 ab 4.52 ± 0.29 a 14.10 ± 0.84 a 2.17 ± 0.09 a E3 30 100 ± 0.00 a 4.24 ± 0.35 a 5.01 ± 0.33 a 21.62 ± 0.66 a 2.44 ± 0.22 a E4 35 100 ± 0.00 a 3.84 ± 0.31 ab 4.33 ± 0.25 a 16.63 ± 0.58 a 2.20 ± 0.27 a -
组培瓶苗移植第2天开始原有叶片开始逐渐萎蔫掉落,第7天开始从侧芽处萌发新叶,第14天左右结束缓苗,植株长势逐渐恢复,叶片逐渐变大且颜色变翠绿,茎也变粗壮且逐渐木质化,21 d统计移植成活率为83.9%。
红桦组织培养体系的建立
Establishment of Tissue Culture System of Betula albo-sinensis
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摘要:
目的 探究红桦组织培养各个阶段的最佳培养基配比,建立红桦组织培养体系,为红桦良种选育、定向培育及遗传转化等研究提供理论支持。 方法 以红桦休眠芽为外植体,研究外植体最佳消毒灭菌方法,6-BA、NAA浓度对休眠芽萌发、增殖培养的影响以及基本培养基类型、IBA和蔗糖浓度对不定根诱导的影响。 结果 表明:完整的红桦组织培养体系为:(1)以红桦休眠芽为外植体,先用70%酒精消毒30 s,无菌水冲洗3~4次,再用0.1% HgCl2灭菌8 min,无菌水冲洗5~6次获得无菌材料;(2)休眠芽萌发最适宜培养基配方为WPM +1.5 mg·L−1 6-BA+0.1 mg·L−1 NAA,外植体萌发率为83.33%;(3)增殖培养所需最佳激素配比为WPM +1.5 mg·L−1 6-BA+0.02 mg·L−1 NAA,增殖系数达到4.77,健康指数达到2.45;(4)不定根诱导最佳配比为WPM +0.8 mg·L−1 IBA,生根率达100%,根健康指数为2.61;所有培养基均附加30 g·L−1蔗糖与7 g·L−1琼脂。 结论 红桦以WPM为基本培养基,添加不同浓度的6-BA、NAA、IBA,可成功进行各阶段的培养,最终建立完整的红桦器官发生途径再生体系,再生植株移植成活率在80%以上。 Abstract:Objective To explore the optimal medium ratio at each stage of the tissue culture of Betula albo-sinensis, to establish the tissue culture system of B. albo-sinensis, and provide theoretical support for the studies on species selection of superior varieties, directional cultivation and genetic transformation of B. albo-sinensis. Method Using dormant buds of B. albo-sinensis as explants to study the optimal disinfection and sterilization method of explants, the effect of 6-BA and NAA concentrations on the germination of dormant buds and proliferation culture, and the effects of basic medium types, IBA and sucrose concentrations on the induction of adventitious root. Result The optimal tissue culture system of B. albo-sinensis established in this study is as follows. (1) Using B. albo-sinensis dormant buds as explants, and sterilized with 70% alcohol for 30 seconds and washed with sterile water for 3-4 times, then sterilized with 0.1% HgCl2 for 8 minutes and washed with sterile water for 5-6 times to obtain sterile materials. (2) The optimal medium for the germination of dormant buds is WPM basic medium with 1.5 mg·L−1 6-BA and 0.1 mg·L−1 NAA, the germination rate of explants is 83.33%. (3) The best proliferation culture is WPM adding 1.5 mg·L−1 6-BA and 0.02 mg·L−1 NAA, with a proliferation coefficient of 4.77 and a health index of 2.45. (4) The most suitable medium for adventitious root induction is WPM supplemented with 0.8 mg·L−1 IBA, the rooting rate is 100%, and the root health index is 2.61. All the media are supplemented with 30 g·L−1 sucrose and 7 g·L−1 agar. Conclusion With WPM as the basic medium and different concentrations of 6-BA, NAA and IBA added, the culture of B. albo-sinensis at all stages could be successfully carried out, and a complete regeneration system of organogenesis generation pathway is established. The transplant survival rate of regenerated plants is higher than 80%. -
Key words:
- Betula albo-sinensis Burk
- / organogenesis
- / plant growth regulators
- / plant regeneration
-
表 1 0.1% HgCl2灭菌时间对无菌外植体获得的影响
Table 1. Effects of 0.1% HgCl2 sterilization time on the acquisition of sterile explants
试验号
Test number灭菌时间/min
Sterilization time外植体数/个
Number of explants污染率/%
Pollution rate褐化死亡率/%
Browning mortality rate萌发率/%
Germination rateA1 4 60 51.7 ± 0.19a 6.7 ± 0.09a 41.7 ± 0.15a A2 6 60 45.0 ± 0.22b 15.0 ± 0.31ab 40.0 ± 0.18a A3 8 60 15.0 ± 0.25c 25.0 ± 0.27b 60.0 ± 0.32b A4 12 60 13.3 ± 0.17c 58.3 ± 0.19c 28.3 ± 0.44a 注:表中数据为平均值 ± 标准差,不同小写字母表示不同处理间差异显著(p < 0.05),下同。
Notes: The data in the table are the mean ± standard deviation, and different lowercase letters indicate significant differences between different treatments (p < 0.05), the same below.表 2 植物生长调节剂对初代培养的影响
Table 2. Effects of plant growth regulators on primary culture
试验号
Test number植物生长调节剂浓度/(mg·L−1)
Concentration of plant growth regulator外植体数/个
Number of explants萌发率/%
Germination rate外植体生长状态
The growth state of the explants6-BA NAA IBA B1 0.8 0.1 0 30 53.33 ± 0.65 abc 基部无愈伤,无茎,叶皱缩 B2 1.0 0.1 0 30 56.67 ± 0.91 abc 基部无愈伤,无茎,叶破损发黄 B3 1.2 0.1 0 32 62.50 ± 0.34 abc 基部无愈伤,无茎,叶正常 B4 1.5 0.1 0 30 83.33 ± 0.55 d 基部有褐色疏松愈伤,茎健康,叶鲜绿 B5 1.8 0.1 0 28 71.43 ± 0.67 cd 基部有米黄色疏松愈伤,茎细弱,叶发黄 B6 2.0 0.1 0 28 72.41 ± 0.39 cd 基部有米黄色疏松愈伤,无茎,叶蜷曲发黄 B7 0.8 0.2 0 30 46.67 ± 0.44 abc 基部无愈伤,无茎,叶黄化 B8 1.0 0.2 0 32 56.25 ± 0.43 abc 基部无愈伤,无茎,叶破损发黄 B9 1.2 0.2 0 31 67.74 ± 0.58 bcd 基部有绿色紧实愈伤,无茎,叶黄化 B10 1.5 0.2 0 31 64.51 ± 0.71 bc 基部有绿色愈伤,无茎,叶皱缩 B11 1.8 0.2 0 29 62.07 ± 0.66 abc 基部有米黄色疏松愈伤,无茎,叶蜷曲发黄 B12 2.0 0.2 0 30 60.00 ± 0.80 abc 基部有米黄色疏松愈伤,无茎,叶黄化 B13 1.5 0.1 0.02 30 43.33 ± 0.63 a 基部产生绿色愈伤,无茎,叶正常 B14 1.5 0.1 0.05 30 50.00 ± 0.57 ab 基部产生绿色愈伤,无茎,叶正常 表 3 植物生长调节剂对增殖培养的影响
Table 3. Effects of plant growth regulators on the proliferation culture
试验号
Test number植物生长调节剂浓度/(mg·L−1)
Concentration of plant growth regulator增殖系数
Proliferation coefficient健康指数
Health index6-BA NAA C1 1.0 0.01 2.56 ± 0.15ab 1.28 ± 0.13a C2 1.0 0.02 3.04 ± 0.12ab 1.24 ± 0.09a C3 1.0 0.05 2.57 ± 0.32ab 1.51 ± 0.22a C4 1.5 0.01 4.45 ± 0.21ab 2.16 ± 0.32a C5 1.5 0.02 4.77 ± 0.18a 2.45 ± 0.14a C6 1.5 0.05 4.37 ± 0.22ab 1.99 ± 0.25a C7 2.0 0.01 2.67 ± 0.41ab 1.64 ± 0.23a C8 2.0 0.02 3.39 ± 0.24ab 1.55 ± 0.16a C9 2.0 0.05 2.30 ± 0.21b 1.32 ± 0.26a 表 4 蔗糖浓度对生根培养的影响
Table 4. Effects of sucrose concentration on rooting culture
试验号
Test number基本培养基
Basic medium蔗糖浓度/(g·L−1)
Concentration of Sucrose生根率/%
Rooting rate平均生根数/条
Mean rooting number根长/cm
Root length生根指数
Rooting index健康指数
Health indexE1 WPM 20 72 ± 3.09 b 3.06 ± 0.21 b 4.21 ± 0.40 a 9.28 ± 0.62 b 2.11 ± 0.15 a E2 25 96 ± 2.54 a 3.25 ± 0.19 ab 4.52 ± 0.29 a 14.10 ± 0.84 a 2.17 ± 0.09 a E3 30 100 ± 0.00 a 4.24 ± 0.35 a 5.01 ± 0.33 a 21.62 ± 0.66 a 2.44 ± 0.22 a E4 35 100 ± 0.00 a 3.84 ± 0.31 ab 4.33 ± 0.25 a 16.63 ± 0.58 a 2.20 ± 0.27 a -
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