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油茶（Camellia oleifera Abel.）为山茶科山茶属常绿灌木或小乔木，是一种重要的木本油料树种[1]，主要分布在我国长江流域及以南地区的湖南、安徽、广东、广西、福建等省区。茶油含有90％以上不饱和脂肪酸，具有降血脂、预防心脑血管疾病等功效，是有利于人类健康的食用油。油茶是虫媒、两性花的异花授粉植物。油茶的成花时间长。“湘林1号”油茶（Camellia oleifera ‘Xianglin1’）的花芽分化从5月下旬开始到9月上旬结束，经过生理分化期、萼片形成期、花瓣形成期、雌雄蕊形成期、子房和花药形成期、雌雄蕊成熟期等阶段[2]，然而，“长林4号”油茶（Camellia oleifera ‘Changlin4’）花芽分化的开始时间是6月上旬[3]，10月中下旬开花结果。植物成花受光周期途经、自主春化途径、赤霉素途径和糖类途经等的基因调节，也受开花整合子SOC1、FT、LFY等基因的调节，最后受同源异形基因AP1、SEP、AG等的调控完成花器官发育[4-5]。SOC1基因是MADS-box家族基因之一。MADS-box基因家族在调节植物的花器官发育、开花时间、胚珠发育、根瘤形成和对环境信号反应等方面起作用[6-7]。在真核生物中，MADS-box基因家族是一类编码转录因子的基因组成，其蛋白质具有高度保守的MADS结构域[8]，能够使本身蛋白质以二聚体的形式结合其它辅助因子和DNA，调节基因的时空表达。在被子植物中，大多数SOC1基因含有 7 个外显子和6个内含子，其编码的蛋白除了含有保守的MADS-box以外, 还含有K-box和非保守的I区、C区，因此，属于MIKC型[9]。K-box是一个半保守片段，主要由有3个α螺旋组成，其中，前面2个螺旋和第3个螺旋的作用分别是决定本身蛋白二聚化的特异性和形成高级复合物，是蛋白质相互作用部位[10]；I区的序列变化较大，主要促进蛋白二聚体本身与DNA的结合；C区由疏水性氨基酸组成的最不保守区域，是基因转录的激活区，但有些SOC1蛋白也具有一个保守的MOTIF结构域，因此，被划入SOC1/TM3亚家族[11]，SOC1的不同功能主要由不同的C区基序完成[12]。目前，在大豆（Glycine max (Linn.) Merr.）[13-14]、玉米（Zea mays L.）[15]、烟草（Nicotiana tabacum L.）[16]、芒果（Mangifera indica L.）[17]、油菜（Brassica campestris L.）[18]、拟南芥(Arabidopsis thaliana （L.） Heynh)[19-20]、茶树(Camellia sinensis (L.) O. Ktze)[21-22]、橘子(Citrus reticulata Blanco)[23]、火龙果(Hylocereus polyrhizus (Haw) Britt & Ros)[24]、牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）[25]等植物中的SOC1基因序列和作用都有报道，但关于油茶中SOC1同源基因的序列和作用的报道很少。本研究采用RT-PCR技术和RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术克隆油茶的CoSOC1-like基因，用生物信息学方法研究其序列特征，用荧光定量PCR技术研究CoSOC1-like基因的表达模式，用基因瞬时表达法研究蛋白的亚细胞定位，为进一步研究油茶CoSOC1-like基因的功能打下基础，为揭示油茶成花的分子机制和花期调控提供理论依据。
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油茶材料采摘于湖南科技学院油茶示范基地的3年生油茶‘湘林210’（Camellia oleifera ‘Xianglin210’）品种。采摘后的叶片立即放于干冰盒中冷冻保存运输，后转存入−70 ℃超低温冰箱，在48 h内提取RNA。
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采用RACE方法克隆油茶CoSOC1-like基因[26]。以油茶幼嫩叶片为材料，用RNA提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）提取叶片总RNA。使用1.0%琼脂糖凝胶电泳测定RNA的质量。以RNA完整且无蛋白质污染的RNA作为底物，按照反转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）合成cDNA第一链。扩增CoSOC1-like基因的引物序列见表1。以cDNA第一链为模板，F1和R1、F2和R2为引物和高保真的PFU酶（北京全式金生物技术有限公司）构建反应体系，进行巢式PCR扩增，获得基因的核心片段。使用3′和5′RACE cDNA扩增试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）提供的引物、F3和R3、F4和R4引物进行PCR扩增，获得基因的3′端序列片段和5′端序列片段。每个片段经过琼脂糖凝胶回收试剂盒（上海生物工程股份有限公司）回收，与pGM-T载体（北京索莱宝公司）连接并转化大肠杆菌DH5α细胞，并涂布在含有100 μg·mL−1氨苄青霉素的固体LB培养基上进行蓝白斑筛选，37 ℃培养16 h。用PCR法鉴定白色菌落的阳性克隆。用质粒提取试剂盒（上海生物工程股份有限公司）提取5～10个阳性克隆的质粒，送至北京擎科生物科技有限公司湖南分公司测序。将每个序列在DNAMAN软件中拼接，获得含有全长CoSOC1-like基因序列的片段。
表 1 CoSOC1-like基因的引物序列
Table 1. Primer sequences of CoSOC1-like
引物名称
Primer name寡聚核苷酸序列 5′–3′
Oligonucleotide sequence 5′–3′F1 ATGGTGAGNGGNAARACNCA R1 AGCTGCTCDATYTGYTCYTT F2 ACAAGCAGNCARGTNACNTT R2 TTCTCAAGYTGYTGYTCDAT F3 AGGTTGCTCTCATCATCTTCTCTC R3 TTTGAACATCTTTTGTATGCCTCT F4 CAGAGGCATACAAAAGATGTTCAA R4 TAGGAGAGAAGATGATGAGAGCAA F5 GCTCTAGAGATGGTGAGAGGGAAGACTCAGATGA R5 TCCCCCCGGGGTAACTTCTGAGGCGAAGCACGCT -
用DNAStar 5.0 软件分析油茶CoSOC1-like 基因开放阅读框，并推导氨基酸序列。用DNAMAN软件预测油茶CoSOC1-like蛋白质序列的疏水性、亲水性和跨膜结构域。采用SOPMA在线工具（
http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/ ）分析蛋白质二级结构；用Phyre2在线工具分析蛋白质三级结构；在PSORT在线工具（http://psort.hgc.jp/ ）上进行亚细胞定位预测；运用在线KinasePhos 2.0软件对CoSOC1-like蛋白作用方式预测；利用MEGA5.0软件的Clustal W法进行比对，用邻接法构建同源蛋白系统发育树(自展值Bootstrap设定为1 000, 其它参数的缺省值不变)。 -
在2020年12月20日取处于开花后期油茶的根、幼茎、叶片、营养芽、花瓣、雄蕊、柄托雌（花柄、花托和雌蕊部分的总称，因为花柄短并且花托和子房紧密结合，不易区分且很难分离）等部分提取总RNA。在2021年5月30日取处于花芽生理分化期油茶的根、幼茎、叶片、顶芽（未出现分化的芽）、营养芽、花芽和幼果等部分提取RNA。在2021年6月30日取处于雌蕊和雄蕊形成期油茶的根、茎、叶片、营养芽（0.4 cm左右）、花芽（0.8 cm左右）、果皮和种子等部分提取RNA。在2021年7月30日取处于花芽子房和花药形成期（去掉苞片的花芽中有肉眼可见的约2 mm左右分叉柱头、1 mm左右的雄蕊）油茶的根、茎、叶片、营养芽（0.5 cm左右）、花芽（1.3 cm左右）、果皮和种子等部分提取RNA。所有的RNA用反转录试剂盒合成cDNA后用于荧光定量PCR。测定基因表达量的引物为，油茶CoSOC1-like基因引物为F: 5′TCTCTGCGATGCTGAGGTTG 3′，R: 5′ TCTATCTGCTTTGCCATGTCTG 3′，片段长度195 bp。ACTIN基因引物为F: 5′ TAGACTTGCGGCATCAGTTAGA 3′，R: 5′ TTCACGGTTTTTGGACGGATT 3′，片段长度176 bp。所用仪器为BIO-RAD的CFX Connect Real-Time System，试剂是赛默飞世尔科技有限公司的Power SYBR™ Green PCR 预混液（货号: 4367659) 。反应体积为 20 μL，反应程序为：95.0 ℃ 3 min，95.0 ℃ 15 s，55.0 ℃ 20 s，72.0 ℃ 30 s，35 个循环，72.0 ℃ 5 min，4 ℃保存。每个样品设置 3 次重复， 采用 2−∆∆CT 方法计算基因的相对表达量，利用 SPSS19软件的单变量方差分析的 Duncan 多重比较法进行显著性差异和标准误分析。
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以扩增油茶CoSOC1-like基因全长的加入Xba I酶切位点的正向引物（F: 5′ GCTCTAGAG ATGGTGAGAGGGAAGACTCAGATGA 3′）、加入了Xma I酶切位点的反向引物（R: 5′ TCCCCCCGGGGTAACTTCTGAGGCGAAGCACGCT 3′）和高保真的PFU酶进行PCR扩增出基因全长。对CoSOC1-like基因全长和pBI121-EGFP质粒（湖南丰辉生物科技有限公司）分别进行Xba I和Xma I（北京NEB公司）双酶切，用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒对酶切片段进行回收，然后用T4 DNA连接酶（美国clontech公司）连接这2 个片段，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有抗生素Amp的LB培养基培养，对菌斑进行PCR鉴定和测序鉴定获得阳性克隆。将此阳性克隆用热激法转化到农杆菌EHA105菌株中。用含有0.1 mol·L−1乙酰丁香酮和25 μg·mL−1利福平的YEB培养基培养农杆菌EHA105到OD600为0.5～0.6时，转速5 000 rpm离心10 min收集农杆菌，用重悬液（10 mmol·L−1 MES，0.1 mmol·L−1 乙酰丁香酮和10 mmol·L−1 氯化镁，过滤除菌）悬浮农杆菌，用注射器将农杆菌注射到洋葱(Allium cepa L.)鳞片内表皮中，1 d后取洋葱鳞片内表皮在荧光显微镜（日本Nikon ECLIPSE Ni-U）下观察EGFP蛋白的绿色荧光。
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CoSOC1-like基因的核心片段用PCR反应扩增，其产物经凝胶电泳检测，表明扩增产物约在350 bp左右处有一条亮带，无其它杂带（图1）。用5′RACE 反应和3′RACE 反应，扩增基因的5′端序列和3′末端序列；经过测序和拼接，获得序列1 025 bp片段。经过开放阅读框分析，此DNA片段包含1个完整的654 bp CDS和150 bp 5′UTR、221 bp 3′UTR（图2）。
图 1 油茶CoSOC1-like基因片段的扩增产物电泳图
Figure 1. Electrophoresis result of CoSOC1-like fragment of Camellia oleifera from RT-PCR
图 2 CoSOC1-like基因cDNA全长序列和开放阅读框及其氨基酸序列
Figure 2. cDNA sequence and deduced amino acid sequence of CoSOCl-like
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油茶CoSOC1-like基因的CDS序列编码217个氨基酸组成的蛋白质(图2)。蛋白质分子量为24.958 kDa，等电点为6.8。带负电荷的氨基酸(Asp + Glu)数量为37个，带正电荷的氨基酸(Arg + Lys)数量为36个，平均疏水性值为–0.77，平均亲水性值为0.361，属于亲水性蛋白。该蛋白无信号肽位点, 是非分泌蛋白，也无跨膜螺旋区。
油茶CoSOC1-like蛋白质与其它物种SOC1蛋白的同源性比对结果（图3）表明：它与茶树SOC1-like（XP-028068271.1）的同源性为97.7%、与榴莲（XP_022769695.1）的SOC1-like同源性为78.4%、与核桃（XP_018851690.1）的SOC1-like同源性为75.46%、与加州白栎（XP_030930174.1）的SOC1同源性为79.1%，与猕猴桃（AKH61958.1）SOC1e同源性为82.16%、与山核桃（AHI85950.1）的SOC1同源性为75.35%，与杨梅（KAB1200892.1）的SOC1同源性为75.94%，表明所克隆到的片段为油茶SOC1同源基因，本文将该基因命名为CoSOC1-like, 并在GenBank注册，登录号为MT036382。该序列蛋白质CoSOC1-like结构包含MADS-box（1-74位的氨基酸）、I-domain（75-83位的氨基酸）、K-box（84-172位的氨基酸）、C-domain四种结构域，属于植物Ⅱ型MADS-box基因的蛋白结构，C-domain中含有SOC1 MOTIF，因此CoSOC1-like属于SOC1/TM3型。
图 3 CoSOC1-like基因编码的氨基酸与其它植物的SOC1的序列比对
Figure 3. Alignments of the CoSOC1 -like deduced amino acid sequences with other SOC1 proteins from plants
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蛋白质二级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸主要依赖于氢键而建立的有规则重复的构象，主要包括α-螺旋、β-折叠片、β-转角和无规则卷曲。油茶CoSOC1-like蛋白的二级结构（图4）表明：油茶CoSOC1-like蛋白含有α-螺旋56.68%、β-转角4.15%、折叠延伸链10.14%和无规卷曲29.0%。在蛋白质的84—172位K-box的氨基酸段有3个很明显的α-螺旋，这3个α-螺旋是MIKC型MADS-box基因的特征序列。在蛋白质的C-domain的氨基酸段主要是卷曲和折叠延伸链组成。
图 4 CoSOC1-like蛋白的二级结构预测
Figure 4. Secondary structure prediction of CoSOC1-like protein
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蛋白质的三级结构是指一条多肽链在二级结构甚至结构域的基础上，依靠氨基酸侧链基团的疏水作用、范德华力及氢键和静电作用，进一步盘旋和折叠形成特定空间结构。油茶CoSOC1-like蛋白三级结构（图5）表明：CoSOC1-like属于SRF-LIKE家族的蛋白质，预测的油茶CoSOC1-like三级结构的肽链与二级结构的预测结果较一致。在CoSOC1-like蛋白质的氨基端有2个明显的α-螺旋（红色和黄色螺旋部分），属于蛋白的MADS-box区域；中间部分有2个同向平行的折叠延伸链，还有一个较长的α-螺旋（青绿色α-螺旋部分）属于K-box域；蛋白的羧基端是无规卷曲（深蓝色部分）。整个蛋白质折叠成了一个紧密的并且有“空穴”（活性部位）的空间结构，这种结构与它结合DNA和激活基因转录功能相适应。
图 5 CoSOC1-like 蛋白质三级结构预测
Figure 5. Tertiary structure prediction of CoSOC1-like protein
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预测油茶CoSOC1-like蛋白质的亚细胞定位表明：油茶CoSOC1-like蛋白没有信号肽存在，不是外分泌蛋白；在蛋白质153位上存在亮氨酸拉链模式（LKEKEKVLTAENAKLCEKYGLL），3位上存在SRF型转录因子DNA结合和二聚化结构域(RGKTQMRRIENATSRQVTFSKRRNGLLKKAFELSVLCDAEVALIIFSPRGKLYEF)，CoSOC1-like位于细胞核的可能性最大，其次为线粒体中(表2)。
表 2 CoSOC1-like蛋白质亚细胞定位分析结果
Table 2. Subcellular localization prediction of CoSOC1-like protein
位置
Position概率
Probability/%细胞核 Nuclear 47.8 线粒体 Mitochondrial 30.4 细胞膜 Plasma membrane 4.3 包括细胞壁的细胞外部分 Extracellular, including cell wall 4.3 高尔基体 Golgi 4.3 细胞质 Cytoplasmic 4.3 过氧化物酶体 Peroxisomal 4.3 将CoSOC1-like基因与载体pBI121-EGFP融合，构建的pBI121-CoSOC1-like-EGFP融合载体转化洋葱表皮细胞，以转化空载体的洋葱表皮细胞作为对照，在荧光显微镜下观察发现，对照中整个洋葱表皮细胞（包括细胞质和细胞核）都发出绿色荧光（图6 a、c），说明该空载体是有作用的；融合载体转化的洋葱表皮细胞中只有细胞核中发出绿色荧光（图6 d、f），说明CoSOC1-like蛋白不是定位于线粒体，而是定位于细胞核中。
图 6 荧光显微镜（200X）下观察CoSOC1-like蛋白在洋葱表皮细胞中的定位
Figure 6. Localization of CoSOC1-like protein in oinion epidermal cells observed in a fluorescence microscope（200X）
对CoSOC1-like蛋白序列修饰位点分析表明：CoSOC1-like蛋白含有17 个丝氨酸磷酸化位点、10 个苏氨酸磷酸化位点、4 个酪氨酸磷酸化位点，说明该蛋白活性受磷酸化作用。油茶CoSOC1-like转录因子可能是通过蛋白质磷酸化激活，与有关基因的启动子区相互作用达到调节靶基因表达的目的。
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对油茶CoSOC1-like蛋白与茶树、地花（Monotropa hypopitys Linn.）、猕猴桃、小果咖啡（Coffea arabica L.）、鸡血藤（Spatholobus suberectus Dunn）、大豆、加州白栎、栓皮栎（Quercus suber L.）、杨梅、山核桃、核桃、拟南芥、麻疯树(Jatropha curcas L.)、烟草、河岸葡萄(Vitis riparia Mchx.)、蓖麻(Ricinus communis L.)、小麦(Triticum aestivum L.)、水稻(Oryza sativa ‘Japonica Group’)、高粱(Sorghum bicolor L.)、玉米等植物SOC1及其同源蛋白，在氨基酸水平构建系统进化树，结果(图7)表明：以小麦、水稻、高粱、玉米等单子叶植物SOC1及其同源蛋白作为外群，可以将比较的其他植物SOC1及其同源蛋白分为2个分化类群。第1个类群中包含油茶CoSOC1-like、茶树2个SOC1-like、地花SOC1、猕猴桃的SOC1e和SOC1i、小果咖啡SOC1-like、鸡血藤SOC1、大豆的SOC1、加州白栎SOC1、栓皮栎SOC1 isoform X1、杨梅SOC1、山核桃的SOC1、核桃SOC1-like、拟南芥SOC1、麻疯树SOC1 isoform X1，自展支持率为100%；油茶CoSOC1-like与茶树2个CsSOC1-like聚类在同一个进化支上，自展支持率为100%。第2个类群包括茶树SOC1-like isoform X1和X2、烟草SOC1-like、河岸葡萄SOC1、蓖麻的SOC1，自展支持率为100%。说明油茶的CoSOC1-like与茶树SOC1-like的亲缘关系最近，与猕猴桃SOC1e和SOC1i、地花SOC1的亲缘关系较近，与小果咖啡SOC1-like、鸡血藤SOC1、大豆的SOC1、加州白栎SOC1等的亲缘关系较远，与茶树的SOC1-like isoform X1和X2、烟草SOC1-like、河岸葡萄和蓖麻的SOC1的亲缘关系更远。这说明油茶CoSOC1-like具有较高种属特性，可为今后研究油茶CoSOC1-like基因的功能提供相应的参考。
图 7 油茶CoSOC1-like与其他物种SOC1同源蛋白的系统进化树分析
Figure 7. Phylogenetic evolutionary tree analysis of CoSOCl-like and homologous SOC1 proteins form other plants
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为了理解油茶CoSOC1-like基因的表达情况，分析了不同生长发育时期的油茶各个器官的基因表达量。对处于开花后期油茶植株的根、茎、叶、营养芽、花瓣、雄蕊、柄托雌（花柄、花托和雌蕊部分）等部位进行了荧光定量RT-PCR分析，结果（图8）表明：CoSOC1-like基因在所检测的各个部位都有表达，其中，在根和茎中表达水平相对较高，在叶片、营养芽、花瓣、雄蕊和柄托雌等部位表达水平相当。对处于花芽生理分化期油茶的各个器官的荧光定量RT-PCR分析结果（图9）表明：CoSOC1-like基因在花芽中的相对表达量最多，在根、茎、叶、顶芽、营养芽、幼果中都有一定的相对表达量且表达量相当。对处于雌蕊和雄蕊形成期油茶的各个器官的荧光定量RT-PCR分析结果（图10 A）表明：CoSOC1-like基因在花芽中的相对表达量最多，在根、茎、叶、营养芽、果皮和种子中的相对表达量差别不大。对花芽处于子房和花药形成期油茶的各个器官的荧光定量RT-PCR分析结果（图10 B）表明：CoSOC1-like基因在花芽中的相对表达量最多，在根、茎和叶中的相对表达量较多，在营养芽、果皮和种子中的相对表达量较少，并且在营养芽、果皮和种子中有一定的绝对表达量。这些结果说明，CoSOC1-like基因不仅可以调节生理分化期、雌蕊和雄蕊形成期、子房和花药形成期的花芽生长分化，也可以调节根、茎、叶、营养芽、果皮和种子的生长发育。
图 8 油茶开花后期的CoSOC1-like基因在不同部位的相对表达量
Figure 8. Relative expression level of CoSOC1-like gene of different parts of Camellia oleifera in the late flower stage
图 9 油茶花芽生理分化期的CoSOC1-like基因在不同部位的相对表达量
Figure 9. Relative expression level of CoSOC1-like gene of different parts of Camellia oleifera in the stage of physiological differentiation of flower bud
图 10 油茶花芽不同分化期的CoSOC1-like基因在不同部位的相对表达量
Figure 10. Relative expression level of CoSOC1-like gene of different parts of Camellia oleifera in the stages of different differentiation of flower bud
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植物从幼年期生长到成熟期以后，就进入成花阶段。这个阶段包括植物感受开花信号的刺激，诱导植物从营养生长向生殖生长转化的成花诱导阶段，花的分生组织分化成花原基和花器官原基的分化阶段以及花器官形成和生长等3个阶段[27-28]。SOC1基因是开花整合子基因，能够感受光周期途径、自主/春化途径、赤霉素途径、糖类途径和温敏途径等开花刺激途径中的信号，诱导花分生组织特征的表达和花器官的形成，促进植物开花[29-31]。
本试验根据在很多物种中存在的SOC1同源基因序列，利用RACE方法，成功地从油茶中克隆出油茶SOC1同源基因cDNA序列，命名为CoSOC1-like，基因编码区654 bp核苷酸，编码217个氨基酸, GenBank登陆号为MT036382。同源蛋白质比对结果表明，油茶CoSOC1-like蛋白具有MADS-box家族基因的typeⅡ型结构，包含MADS-box、I-domain、K-box和C-domain 4 部分,且在C结构域含有SOC1MOTIF结构，属于SOC1/TM3型亚家族基因，是一个MADS-box家族转录因子[32]。蛋白序列分析表明，油茶的CoSOC1-like蛋白没有跨膜螺旋区，不含信号肽，含有SRF型转录因子结合DNA的结构域；基因瞬时表达表明CoSOC1-like蛋白定位于细胞核，与绿竹SOC1-like[33]和小麦TaSOC1-like蛋白[34]的定位是一致的，符合转录因子的结构特点和亚细胞定位特征。油茶CoSOC1-like蛋白有31个磷酸化位点，它的二级结构和三级结构的多肽链特征与它的一级结构是一致的，该蛋白的三级结构表现出的紧密又有活性部位的空间结构，说明CoSOC1-like蛋白通过磷酸化作用结合DNA并激活基因的转录作用。
系统进化树分析表明，油茶CoSOCl-like蛋白与茶树SOC1-like蛋白聚为一枝，亲缘关系最近，其次与猕猴桃SOC1e和SOC1i、地花的SOC1的亲缘关系较近，与小果咖啡SOC1-like、鸡血藤和大豆以及拟南芥的SOC1等的亲缘关系较远，与茶树的SOC1-like isoform X1和X2、烟草SOC1-like、河岸葡萄和蓖麻的SOC1的亲缘关系更远，说明油茶CoSOC1-like具有独特的序列特征。由于茶树CsSOC1-like具有调节茶树开花时间作用[35]，因此，推测油茶CoSOCl-like也能够调节油茶的开花时间。
植物的SOC1-like基因的功能具有多样性。苜蓿的SOC1-like基因MtSOC1a不仅可以促进开花，还可以促进主茎的伸长[36]；过表达矮牵牛的SOC1-like基因能够促进烟草的花瓣和叶片的光合作用，并增强烟草对高温的耐受性[37]。基因表达分析结果表明，CoSOC1-like基因在油茶不同发育阶段的营养器官和生殖器官中都有表达，这一个特点与松树中SOC1-like基因MADS11的表达类似[38]。CoSOC1-like 基因在花芽生理分化期、雌雄蕊形成期和子房花药形成期的花芽中的相对表达量最多，在根、茎、叶、顶芽、营养芽、幼果、种子中都有一定量的相对表达量，这个特点与核桃MADS-like基因在花芽中的相对表达量最高相似，但是又不同于核桃的根、茎、叶中相对表达量很低的特点[39]；在子房和花药形成期的果皮和种子中CoSOC1-like的相对表达量低，这与梅花PmSOC1-like基因在果实和种子中相对表达量低一致[40]。在开花后期，CoSOC1-like 基因在根和茎中相对表达量较多，在叶片、营养芽、花瓣、雄蕊和柄托雌等部位表达水平相当。说明油茶CoSOC1-like基因除了参与油茶的花芽分化以外，还可能参与油茶的根、茎、叶和种子等其他器官的生长发育过程。这些研究结果为进一步研究CoSOC1-like基因在油茶中的成花机理奠定了基础。
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本研究成功克隆了油茶的CoSOC1-like基因。CoSOC1-like蛋白定位于细胞核，含有MADS-box、K-box、I区和C区，属于典型的MIKC型蛋白的转录因子；CoSOC1-like蛋白与同属植物茶树的CsSOC1-like的亲缘关系最近。CoSOC1-like基因在油茶的生理分化期、雌雄蕊形成期、子房和花药形成期的花芽中相对表达量最高，在果皮和种子中的相对表达量较低，说明CoSOC1-like基因在油茶的花芽分化中有重要的调节作用。本结果为进一步研究油茶CoSOC1-like基因的功能奠定了理论基础，为后续应用转基因技术调控CoSOC1-like基因表达水平来调节油茶花期提供了理论依据。
油茶转录因子基因CoSOC1-like的克隆和表达分析
Molecular Cloning and Expression Analysis of Transcription Factor Gene CoSOC1-like in Camellia oleifera
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摘要:
目的 克隆油茶的SOC1同源基因（CoSOC1-like），分析其序列特征和表达模式及其蛋白进化。 方法 以3年生油茶嫩叶为材料提取RNA，利用RT-PCR和RACE方法克隆油茶的CoSOC1-like基因，用生物信息学工具分析其序列特征，用荧光定量PCR分析其表达模式，用基因瞬时表达法分析其蛋白的亚细胞定位。 结果 油茶CoSOC1-like基因的CDS全长为654 bp，推测蛋白质由127个氨基酸组成，蛋白分子量为24.958 kD，等电点（pI）为6.8，基因库的登录号为MT036382。CoSOC1-like具有植物Ⅱ型MADS-box基因的蛋白结构，且C末端含有MOTIF结构域，是一个MADS-box家族转录因子。CoSOC1-like蛋白有31个磷酸化位点，建立在二级结构基础上的CoSOC1-like蛋白的三级结构具有明显活性部位；CoSOC1-like基因瞬时表达分析表明，油茶CoSOC1-like蛋白定位于细胞核，符合转录因子的细胞核定位特征。系统进化分析表明：油茶CoSOC1-like与茶树SOC1-like蛋白聚类在同一个进化支上。荧光定量PCR分析表明：CoSOC1-like基因存在于油茶所有的器官中，尤其在花芽中的相对表达量最多。 结论 CoSOC1-like基因在油茶的花芽分化中起重要作用,也可能参与根、茎、叶和种子等器官的生长发育。本结果为进一步研究油茶成花的分子机制奠定了基础。 Abstract:Objective To clone the homologous gene of SOC1 from Camellia oleifera (CoSOC1-like) and to analyze its sequence structure, expression pattern and protein evolution. Method Total RNA was extracted from the young leaves of three-years-old C. oleifera, and the CoSOC1-like gene was cloned by using RT-PCR technology and RACE (rapid amplification of cDNA ends) technology. The sequence and expression pattern of CoSOC1-like were analyzed using the bioinformatic tools and fluorescence quantitative PCR, respectively. The subcellular localization and evolution of CoSOC1-like protein were analyzed using the method of gene transient expression and MEGA7 software, respectively. Result The full length cDNA of CoSOC1-like contained 654 bases, encoding 217 amino acids, and the relative molecular weight was 24.958 kD and the isoelectric point was 6.8. The Genbank accession number of CoSOC1-like is MT036382. The CoSOC1-like protein had the structure of MADS-box family transcription factors of plant type Ⅱ, and there was a SOC1 MOTIF in C-domain. The CoSOC1-like protein had 31 phosphorylative loci in its amino acid sequence, and its tertiary structure based on secondary structure had obvious active sites, and the transient expression of CoSOC1-like gene showed the CoSOC1-like protein located in nuclear, which was consistent with the nuclear localization characteristics of transcription factors. The phylogenetic analysis showed that the CoSOC1-like protein was clustered in the same evolutionary branch with SOC1-like protein of Camellia sinensis. Fluorescence quantitative PCR analysis showed that the CoSOC1-like gene could be detected in all organs, and there was a maximal relative expression level in flower buds of C. oleifera. Conclusion The CoSOC1-like gene may play an important role in the flower bud differentiation, and participate in the growth and development of other organs such as root, stem, leaf and seed of C. oleifera. -
Key words:
- Camellia oleifera
- / SOC1-like
- / cloning
- / sequence analysis
- / expression analysis
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图 1 油茶CoSOC1-like基因片段的扩增产物电泳图
Figure 1. Electrophoresis result of CoSOC1-like fragment of Camellia oleifera from RT-PCR
图 2 CoSOC1-like基因cDNA全长序列和开放阅读框及其氨基酸序列
Figure 2. cDNA sequence and deduced amino acid sequence of CoSOCl-like
图 3 CoSOC1-like基因编码的氨基酸与其它植物的SOC1的序列比对
Figure 3. Alignments of the CoSOC1 -like deduced amino acid sequences with other SOC1 proteins from plants
图 4 CoSOC1-like蛋白的二级结构预测
Figure 4. Secondary structure prediction of CoSOC1-like protein
图 5 CoSOC1-like 蛋白质三级结构预测
Figure 5. Tertiary structure prediction of CoSOC1-like protein
图 6 荧光显微镜（200X）下观察CoSOC1-like蛋白在洋葱表皮细胞中的定位
Figure 6. Localization of CoSOC1-like protein in oinion epidermal cells observed in a fluorescence microscope（200X）
图 7 油茶CoSOC1-like与其他物种SOC1同源蛋白的系统进化树分析
Figure 7. Phylogenetic evolutionary tree analysis of CoSOCl-like and homologous SOC1 proteins form other plants
图 8 油茶开花后期的CoSOC1-like基因在不同部位的相对表达量
Figure 8. Relative expression level of CoSOC1-like gene of different parts of Camellia oleifera in the late flower stage
图 9 油茶花芽生理分化期的CoSOC1-like基因在不同部位的相对表达量
Figure 9. Relative expression level of CoSOC1-like gene of different parts of Camellia oleifera in the stage of physiological differentiation of flower bud
图 10 油茶花芽不同分化期的CoSOC1-like基因在不同部位的相对表达量
Figure 10. Relative expression level of CoSOC1-like gene of different parts of Camellia oleifera in the stages of different differentiation of flower bud
表 1 CoSOC1-like基因的引物序列
Table 1. Primer sequences of CoSOC1-like
引物名称
Primer name寡聚核苷酸序列 5′–3′
Oligonucleotide sequence 5′–3′F1 ATGGTGAGNGGNAARACNCA R1 AGCTGCTCDATYTGYTCYTT F2 ACAAGCAGNCARGTNACNTT R2 TTCTCAAGYTGYTGYTCDAT F3 AGGTTGCTCTCATCATCTTCTCTC R3 TTTGAACATCTTTTGTATGCCTCT F4 CAGAGGCATACAAAAGATGTTCAA R4 TAGGAGAGAAGATGATGAGAGCAA F5 GCTCTAGAGATGGTGAGAGGGAAGACTCAGATGA R5 TCCCCCCGGGGTAACTTCTGAGGCGAAGCACGCT 
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表 2 CoSOC1-like蛋白质亚细胞定位分析结果
Table 2. Subcellular localization prediction of CoSOC1-like protein
位置
Position概率
Probability/%细胞核 Nuclear 47.8 线粒体 Mitochondrial 30.4 细胞膜 Plasma membrane 4.3 包括细胞壁的细胞外部分 Extracellular, including cell wall 4.3 高尔基体 Golgi 4.3 细胞质 Cytoplasmic 4.3 过氧化物酶体 Peroxisomal 4.3
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