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赤松混交林枯梢病不同病级针叶内部细菌多样性研究

谢宪 梁军 朱彦鹏 时良 高燕 张铭 程元 张星耀

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赤松混交林枯梢病不同病级针叶内部细菌多样性研究

    通讯作者: 梁军, liangjun@caf.ac.cn
  • 中图分类号: S763.13

Endosphere Bacterial Diversity within Mixed Forest of Pinus densiflora Infected by Different Incidences of Sphaeropsis sapinea

    Corresponding author: LIANG Jun, liangjun@caf.ac.cn ;
  • CLC number: S763.13

  • 摘要: 目的 揭示赤松枯梢病不同病级针叶的内部细菌多样性及群落结构。 方法 利用高通量测序技术和生物信息学技术,对针阔混交林(赤松 Pinus densiflora—麻栎Quercus acutissima)和针叶混交林(赤松—黑松Pinus thunbergii)两种林型中赤松无病斑和不同染病程度针叶内的细菌16s rRNA基因的v3-v4区进行测序和分析。 结果 针阔混交林的针叶中细菌有效序列388 587条,共计679个OTU,分属28个门、69个纲、205个属;在针叶混交林的赤松针叶中的细菌有效序列336 600条,共计656个OTU,分属29个门、65个纲、190个属;在针阔混交林和针叶混交林中,赤松无病斑针叶内生细菌的多样性显著高于染病针叶;无病斑针叶中相对丰度较高的内生细菌菌属为MassiliaEndobacterBryocellaSphingomonas,染病针叶中乳杆菌属(Lactobacillus)、BryocellaEndobacter、甲基杆菌属(Methylobacterium)、Singulisphaera相对丰度升高,MassiliaSphingomonas占比下降;主成分分析结果显示,枯梢病侵染较严重的针叶细菌聚在一起,与无病斑针叶以及染病程度较轻的针叶细菌相区分。 结论 枯梢病菌的侵染影响了内生细菌的群落结构和多样性,不同混交林中赤松针叶内生细菌受枯梢病菌影响变化趋势一致,细菌多样性及相对丰度随枯梢病的加重而降低。
  • 图 1  针叶内部细菌OTU稀释曲线图(a:针阔混交林;b:针叶混交林)

    Figure 1.  OTU-based rarefaction curves of bacteria in needles of P. densiflora (a: coniferous and broad-l eaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

    图 2  不同染病情况下赤松针叶内细菌操作单元(OTU)分类Venn图(a:针阔混交林;b:针叶混交林)

    Figure 2.  Venn diagram of OTU distribution of endosphere bacteria in different level of disease in the needles of P. densiflora (a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

    图 4  不同病害侵染状态下赤松针叶内部细菌纲水平组成(a:针阔混交林;b:针叶混交林)

    Figure 4.  Bacterial classes from endosphere bacteria of different level of disease in needles of P. densiflora (a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

    图 5  不同病害侵染状态下赤松针叶内部细菌属水平组成(a:针阔混交林;b:针叶混交林)

    Figure 5.  Bacterial genera from endosphere bacteria of different level of disease in needles of P. densiflora (a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

    图 3  不同病害侵染状态下赤松针叶内部细菌门水平组成(a:针阔混交林;b:针叶混交林)

    Figure 3.  Bacterial phyla from endosphere bacteria of different level of disease in the needles of P. densiflora (a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

    图 6  赤松针叶内部细菌主成分分析(a:针阔混交林;b:针叶混交林)

    Figure 6.  Principal component analysis of endosphere bacteria in needles of P. densiflora(a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

    表 1  不同染病情况的赤松针叶内细菌丰富度与多样性指数

    Table 1.  Abundance and diversity of endosphere bacteria in different level of disease in the needles of P. densiflora

    处理
    Treatment
    丰富度
    Chao1
    多样性指数
    Shannon
    覆盖率
    Coverage
    处理
    Treatment
    丰富度
    Chao1
    多样性指数
    Shannon
    覆盖率
    Coverage
    ZK1389.69 ± 43.34 a6.85 ± 0.30 a99.0%CZ1419.02 ± 49.29 a6.48 ± 0.85 a99.0%
    ZK2339.33 ± 59.58 ab6.16 ± 0.78 a99.1%CZ2328.10 ± 37.21 ab5.75 ± 0.47 a98.8%
    ZK3337.10 ± 47.61 ab5.70 ± 0.84 ab99.1%CZ3225.56 ± 27.03 b5.27 ± 0.63 ab99.3%
    ZK4218.59 ± 40.24 b4.45 ± 0.77 b99.2%CZ4192.50 ± 26.06 b4.74 ± 0.42 b99.1%
      注:测定值为均值 ± 标准差,同列中不同字母表示显著差异(P < 0.05)。
      Note: Values were mean ± standard deviation, values within the same column followed by different letters indicated significant differences (P < 0.05).
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-03-17
  • 录用日期:  2020-04-24
  • 网络出版日期:  2020-12-23
  • 刊出日期:  2021-04-20

赤松混交林枯梢病不同病级针叶内部细菌多样性研究

    通讯作者: 梁军, liangjun@caf.ac.cn
  • 1. 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 国家林业和草原局森林保护学重点实验室,北京 100091
  • 2. 昆嵛山森林生态系统国家定位观测研究站,山东 烟台 264100
  • 3. 中国环境科学研究院,北京 100012

摘要:  目的 揭示赤松枯梢病不同病级针叶的内部细菌多样性及群落结构。 方法 利用高通量测序技术和生物信息学技术,对针阔混交林(赤松 Pinus densiflora—麻栎Quercus acutissima)和针叶混交林(赤松—黑松Pinus thunbergii)两种林型中赤松无病斑和不同染病程度针叶内的细菌16s rRNA基因的v3-v4区进行测序和分析。 结果 针阔混交林的针叶中细菌有效序列388 587条,共计679个OTU,分属28个门、69个纲、205个属;在针叶混交林的赤松针叶中的细菌有效序列336 600条,共计656个OTU,分属29个门、65个纲、190个属;在针阔混交林和针叶混交林中,赤松无病斑针叶内生细菌的多样性显著高于染病针叶;无病斑针叶中相对丰度较高的内生细菌菌属为MassiliaEndobacterBryocellaSphingomonas,染病针叶中乳杆菌属(Lactobacillus)、BryocellaEndobacter、甲基杆菌属(Methylobacterium)、Singulisphaera相对丰度升高,MassiliaSphingomonas占比下降;主成分分析结果显示,枯梢病侵染较严重的针叶细菌聚在一起,与无病斑针叶以及染病程度较轻的针叶细菌相区分。 结论 枯梢病菌的侵染影响了内生细菌的群落结构和多样性,不同混交林中赤松针叶内生细菌受枯梢病菌影响变化趋势一致,细菌多样性及相对丰度随枯梢病的加重而降低。

English Abstract

  • 松枯梢病是世界范围内针叶树上最常见和分布最广的重要病害之一。枯梢病病原菌为松球壳孢菌(Sphaeropsis sapinea (Fr.) Dyko & B. Sutton.),病菌侵染主要从寄主伤口处侵入,1997年Stanosz对Pinus resinosa Loisel.和北美短叶松(Pinus banksiana Lambert.)的研究中首次发现无病斑的嫩梢上存在潜伏侵染[1]。刘艳在多个松属树种套袋隔离的实验中,发现冬季表面无病斑的梢上存在松枯梢病菌定殖的情况,来年可造成春梢发病[2]。松枯梢病已在我国10余个省份的松林中发生,对松树人工林造成了严重的危害,损失巨大,已列入我国重要的森林病害进行研究。

    植物内生细菌在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于植物的各种组织和器官内部,并与植物建立和谐联合关系。随着对植物内生细菌在促进植物生长、生物控制和缓解胁迫等方面的深入研究[3],寄主植物内生细菌与病害的研究也越来越受到关注。内生细菌通过多种机制共同作用从而减轻或防止有害致病微生物对寄主的影响[4],机制包括抗生(代谢物质生产)、生长促进、诱导宿主防御(诱导系统抗性)、寄生、竞争和信号干扰(群体感应)[5]。内生细菌通过生物固氮、加速消化、增磷和产生植物激素直接作用于植物的生长发育,从而产生对生物因子的抗性[6]。松枯梢病作为真菌病害,在其拮抗细菌方面已有相关研究,如通过对健康及染病针叶的内生细菌进行分离培养,获得具有生防潜力的内生细菌[7],但关于枯梢病菌对松树内生细菌多样性及群落结构的影响方面未见相关研究。

    昆嵛山是赤松(Pinus densiflora Sieb. et Zucc.)的原生地和天然分布中心,与黑松(Pinus thunbergii Parl.)、麻栎(Quercus acutissima Carruth.)等共组成地带性天然次生林植被。为探究混交林中枯梢病对寄主内生细菌的影响,选取典型混交林型针阔混交林(赤松-麻栎)和针叶混交林(赤松-黑松),测定两种混交林中赤松针叶内生细菌的变化,探明不同枯梢病发病状态下赤松针叶的内生细菌多样性及群落结构,分析内生细菌的多样性及群落结构差异,为松枯梢病的细菌群落结构调控提供理论依据。

    • 昆嵛山(121°41′34″~121°48′04″ N,37°11′50″~37°17′49″ E)地处山东半岛东部,属暖温带季风气候,林区土壤属森林棕壤,以沙质壤土为主。昆嵛山是我国和东北亚赤松原生地和天然分布中心,赤松在该区域与黑松、麻栎等共同组成地带性天然次生林植被。

      共选取6块30 m × 30 m样地,其中3块样地林分结构为针阔混交林,由赤松以及麻栎构成,其中赤松占比52%~59%,海拔为210 ± 70 m,地理坐标为121°43′35.0″ E,37°17′30.9″ N;121°45′08.4″ E,37°17′37.8″ N;121°43′19″ E,37°17′30.2″ N。另3块为针叶混交林,由赤松以及黑松构成,其中赤松占比46%~49%,海拔为360 ± 30 m,地理坐标为121°45′32.60″ E,37°16′3.06″ N;121°45′33.16″ E,37°15′57.94″ N;121°45′37.55″ E,37°15′52.17″ N。样地立地条件均为中坡位,坡度为23° ± 3°,坡向为东南半阳坡。

    • 于2018年9月在3块针阔混交林样地内分别采集ZK1(全株无病斑赤松的针叶)、ZK2(染病赤松上无病斑针叶)、ZK3(染病较轻针叶,病斑长度为针叶长度二分之一以下)、ZK4(染病较重针叶,病斑长度为针叶长度二分之一以上);在3块针叶混交林样地内分别采样CZ1(全株无病斑赤松的针叶)、CZ2(染病赤松上无病斑针叶)、CZ3(病斑长度为针叶长度二分之一以下)、CZ4(病斑长度为针叶长度二分之一以上)。采用五点取样法(在样地内四角及对角线中心处选树,每个样点选取一株染病赤松和一株全株无病斑赤松)采集样本,针叶取自赤松上冠层,每个样点各采集二年生针叶8束,各类针叶分别采集针叶40束,并进行表面消毒处理。无菌水冲洗并晾干后,用75%乙醇浸泡1 min,无菌水冲洗3次,0.5%次氯酸钠溶液浸泡2 min后,再用无菌水冲洗3次,将最后一次冲洗后的无菌水稀释至LB培养基上进行培养,3 d后观察结果,针叶外表无细菌残留,证实针叶表面已灭菌。

    • 使用高通量测序技术对针叶内生细菌多样性进行测定。首先利用CTAB法对样本DNA进行抽提,完成后将DNA样品在冰上融化后,离心并充分混匀,Nanodrop检测质量合格后,取30 ng进行PCR扩增[8]。PCR扩增体系:DNA样品,1.0 μL;Forward Primer(5.0 μmol·L−1),1.0 μL;Reverse Primer(5.0 μmol·L−1),1.0 μL;BSA(2.0 ng·μL−1),3.0 μL;2 × Taq Plus Master Mix,12.5 μL;ddH2O,6.5 μL。进行16S V3-V4区基因扩增,16S V3-V4区扩增引物序列为(5′-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和(5′-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。

      PCR采用TransGen AP221-02:TransStart Fastpfu DNA Polymerase,将PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测,使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物,Tris-HCl洗脱,2%琼脂糖电泳检测。扩增产物采用Illumina Miseq PE300平台,并构建Miseq文库以及Miseq上机测序。

    • OTU(operational taxonomic units)是在系统发生学或群体遗传学研究中,为了便于进行分析,为某一个分类单元(品系、属、种、分组等)设置的同一标志。用uclust(Version 1.2.22)按照97%相似性将全部序列聚类,去除singleton的OTU,同时去除注释为叶绿体、线粒体的序列,并得到代表序列和OTU表。用usearch按照97%相似性序列进行OTU聚类,得到代表序列再将其全部序列按照97%相似度比对到OTU上形成OTU列表,使用Mothur软件计算丰富度指数Chao1和多样性指数Shannon[9]。使用R软件(v2.15.3)绘制主成分分析图。测序数据已上传NCBI,编号为SUB5584140。

    • 测序结果显示,在针阔混交林ZK的12个样品中共获得细菌有效序列388 587条,共计679个OTU;在针叶混交林CZ的12个样品共获得细菌有效序列336 600条,共计656个OTU。各样品Coverage测序深度指数统计分析结果见表1,结果显示采集针叶样本中覆盖率均接近于99%,且图1稀释曲线趋势平缓,说明各样本中的细菌物种信息被充分检测,结果能够代表各类针叶中细菌的真实水平。

      表 1  不同染病情况的赤松针叶内细菌丰富度与多样性指数

      Table 1.  Abundance and diversity of endosphere bacteria in different level of disease in the needles of P. densiflora

      处理
      Treatment
      丰富度
      Chao1
      多样性指数
      Shannon
      覆盖率
      Coverage
      处理
      Treatment
      丰富度
      Chao1
      多样性指数
      Shannon
      覆盖率
      Coverage
      ZK1389.69 ± 43.34 a6.85 ± 0.30 a99.0%CZ1419.02 ± 49.29 a6.48 ± 0.85 a99.0%
      ZK2339.33 ± 59.58 ab6.16 ± 0.78 a99.1%CZ2328.10 ± 37.21 ab5.75 ± 0.47 a98.8%
      ZK3337.10 ± 47.61 ab5.70 ± 0.84 ab99.1%CZ3225.56 ± 27.03 b5.27 ± 0.63 ab99.3%
      ZK4218.59 ± 40.24 b4.45 ± 0.77 b99.2%CZ4192.50 ± 26.06 b4.74 ± 0.42 b99.1%
        注:测定值为均值 ± 标准差,同列中不同字母表示显著差异(P < 0.05)。
        Note: Values were mean ± standard deviation, values within the same column followed by different letters indicated significant differences (P < 0.05).

      图  1  针叶内部细菌OTU稀释曲线图(a:针阔混交林;b:针叶混交林)

      Figure 1.  OTU-based rarefaction curves of bacteria in needles of P. densiflora (a: coniferous and broad-l eaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

      根据内生细菌OTU数目,对样品中OTU组成进行分析,构建Venn图(图2)和群落结构柱状图(图345)。根据图2a,在针阔混交林ZK中不同染病程度的针叶中共有相同的OTU 83个,占OTU总数的12.22%,4类针叶中特有的OTU数目分别为90、69、59、25个,以ZK1中特有OTU数目最多。根据图2b,在针叶混交林CZ中不同染病程度的针叶中共有相同的OTU 69个,占OTU总数的10.51%,4类针叶中特有的OTU数目分别为120、79、66、45个,同样以CZ1中特有OTU数目最多。

      图  2  不同染病情况下赤松针叶内细菌操作单元(OTU)分类Venn图(a:针阔混交林;b:针叶混交林)

      Figure 2.  Venn diagram of OTU distribution of endosphere bacteria in different level of disease in the needles of P. densiflora (a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

      图  4  不同病害侵染状态下赤松针叶内部细菌纲水平组成(a:针阔混交林;b:针叶混交林)

      Figure 4.  Bacterial classes from endosphere bacteria of different level of disease in needles of P. densiflora (a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

      图  5  不同病害侵染状态下赤松针叶内部细菌属水平组成(a:针阔混交林;b:针叶混交林)

      Figure 5.  Bacterial genera from endosphere bacteria of different level of disease in needles of P. densiflora (a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

      样本内细菌的Chao1指数和Shannon指数统计分析结果见表1,针阔混交林与针叶混交林中的内生细菌多样性及丰度呈现相同的变化趋势。无病斑赤松针叶内生细菌的Chao1和Shannon指数最高,即测得OTU数与种类数均最高,其次分别为染病赤松上的无病斑针叶、病斑长度为针叶长度二分之一以下的赤松针叶、病斑长度为针叶长度二分之一以上的赤松针叶,随着病菌侵染的加重,内生细菌丰富度及多样性呈现出下降的趋势。

    • 在针阔混交林中,对679个OTU进行门、纲和属水平上的归类,分属28个门、69个纲、205个属。在门水平上(图3a),变形菌门(Proteobacteria)占比最高,分别在4类样品中占比55.39%、62.89%、38.53%、71.42%,变形菌门为针叶内生细菌中的优势菌群,且在样本中的相对丰度存在差异。ZK1中相对丰度较高的门还有放线菌门(Actinobacteria)(11.42%)、酸杆菌门(Acidobacteria)(8.09%)、拟杆菌门(Bacteroidetes)(5.78%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)(4.61%)。ZK2中相对丰度较高的门同ZK1一致,占比略有差异,放线菌门(9.85%)、酸杆菌门(7.84%)、拟杆菌门(4.07%)、芽单胞菌门(3.68%)。ZK3中相对丰度较高的门还有厚壁菌门(Firmicutes)(32.60%)、酸杆菌门(6.72%)、放线菌门(10.98%)。ZK4中相对丰度较高的门还有酸杆菌门(14.61%)、浮霉状菌门(Planctomycetes)(4.41%)、放线菌门(2.89%)。

      图  3  不同病害侵染状态下赤松针叶内部细菌门水平组成(a:针阔混交林;b:针叶混交林)

      Figure 3.  Bacterial phyla from endosphere bacteria of different level of disease in the needles of P. densiflora (a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

      在针叶混交林中,对656个OTU进行门、纲和属水平上的归类,分属29个门、65个纲、190个属。在门水平上(图3b),变形菌门相对丰度最高,分别为54.45%、56.24%、63.48%、74.83%。CZ1中的相对丰度较高的门还有酸杆菌门(9.03%)、拟杆菌门(8.63%)、厚壁菌门(7.43%)、放线菌门(6.11%)。CZ2中种类构成与CZ1相近,其中厚壁菌门(15.69%)相对丰度上升,酸杆菌门(6.51%)与拟杆菌门(4.58%)相对丰度降低,放线菌门(6.31%)相对稳定。CZ3中的相对丰度较高的门还有厚壁菌门(11.09%)、酸杆菌门(12.08%)、放线菌门(1.46%)。CZ4中相对丰度较高的门还有酸杆菌门(11.09%)、浮霉状菌门(4.18%)、放线菌门(2.86%)。

      两种混交林中,无病斑针叶的内生细菌门水平结构一致,变形菌门均为优势门,且其他相对丰度较高的菌门近似,包括放线菌门、酸杆菌门、拟杆菌门和芽单胞菌门。随着枯梢病的发生,在病斑较短的针叶中,均发生显著的变化,两种林分在该状态下的内生细菌差异最大,主要差异由于针阔混交林中厚壁菌门相对丰度的升高。在病斑较长的针叶内生细菌优势菌门一致,均由变形菌门、酸杆菌门、浮霉状菌门和放线菌门构成,相对丰度无显著差异。

    • 在针阔混交林中,内生细菌纲水平构成见图4a,无病斑及染病针叶内生细菌均以α-变形菌(Alphaproteobacteria)为优势菌种,分别为34.26%、42.30%、28.53%和63.68%。在ZK1中,β-变形菌纲(Betaproteobacteria)和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)的占比分别为10.05%和7.06%,ZK2中β-变形菌纲和γ-变形菌纲的占比分别为12.06%和5.20%。ZK3中特有芽孢杆菌纲Bacilli,占比为28.18%。ZK4中,α-变形菌占比增高,且酸杆菌纲(Acidobacteria)(14.07%)和浮霉菌纲(Planctomycetacia)(4.41%)占比高于其他样品(均低于1%)。

      针叶混交林中,在内生细菌纲水平上(图4b),4类样品中α-变形菌相对丰度均为最高,相对丰度分别为31.21%、39.51%%、52.66%和58.10%,呈现逐渐增高的趋势。β-变形菌纲相对丰度分别为12.55%、10.36%、6.11%和4.98%,γ-变形菌纲相对丰度分别为5.64%、3.39%、2.92%和1.73%,两个纲的相对丰度均逐渐下降。芽孢杆菌纲(Bacilli)在CZ1、CZ2和CZ3中占比较高,3.32%、14.81%、7.10%,而CZ4中低于1%。CZ4中的δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)(10.03%)、酸杆菌纲(10.56%)和浮霉菌纲(4.12%)占比较高。

      两种林分中,无病斑针叶内生细菌的优势纲为α-变形菌纲。在染病初期,内生细菌的丰度差异主要来自于芽孢杆菌纲的丰度变化。在针阔混交林中,芽孢杆菌纲在病斑较短的针叶中占比显著高于其他样本。在病斑较长的针叶中,α-变形菌纲、酸杆菌纲和浮霉菌纲在两种林分中组成优势菌群。

    • 在针阔混交林中,属水平上(图5a),unidenified的属占了较高的比例(42.40%、43.43%、32.89%、49.26%),在ZK1中,MassiliaEndobacterBryocellaSphingomonas的相对丰度均较高,4个属的占比分别达到了4.51%、3.20%、3.20%、1.68%。ZK2中,MassiliaEndobacterBryocellaSphingomonas同样占据了较高的比例(4.46%、5.73%、5.04%、2.28%),与ZK1的优势菌属一致。ZK3中,乳杆菌属(Lactobacillus)、KroppenstedtiaBryocella、魏斯氏菌(Weissella)相对丰度较高(16.5%、8.09%、5.47%、2.36%),其中乳杆菌属占比最高,MassiliaEndobacterSphingomonas相对丰度降低。在ZK4中BryocellaEndobacterSingulisphaeraSphingomonas相对丰度较高(13.82%、13.13%、4.39%、2.76%)。

      针叶混交林中(图5b),unidenified的属同样占了较高的比例(36.59%、36.92%、38.38%、51.66%)。CZ1中Bryocella(5.11%)、Massilia(4.52%)、硝化螺旋菌属(Nitrospira)(4.32%)、Clostridium_sensu_stricto_1(3.59%)、Endobacter(2.99%)、薄层菌属(Hymenobacter)(2.86%)和Sphingomonas(2.39%)占比较高,CZ2中乳杆菌属(6.97%)、Endobacter(4.91%)、Bryocella(4.78%)和Kroppenstedtia(4.12%)占比较高,与CZ1的优势菌存在差异。CZ3中,Bryocella(7.84%)、Endobacter(7.44%)、乳杆菌属(4.52%)、Sphingomonas(2.72%)、甲基杆菌属(Methylobacterium)(2.66%)和Granulicella(2.19%)占比较高,其中Granulicella明显高于其他样品。CZ4中,相对丰度较高的菌有Bryocella(8.50%)、Endobacter(8.37%)、甲基杆菌属(8.10%)、Singulisphaera(3.98%)、Sphingomonas(3.45%)和Methylocella(2.72%),其中甲基杆菌属与Singulisphaera在其他样品中相对丰度低于1.00%。

      两种林分中,无病斑针叶共有的优势属有MassiliaEndobacterBryocellaSphingomonas,其它优势属硝化螺旋菌属、Clostridium_sensu_stricto_1相对丰度有差异,但并不显著。枯梢病侵染后,在病斑较短的针叶内细菌的属中,Lactobacillus相对丰度的差异最大。在病斑较长的针叶中,BryocellaEndobacterSingulisphaeraSphingomonas在两种林分中均为优势属。

    • 基于细菌纲水平的主成分分析,分析针阔混交林ZK赤松针叶细菌的差异性(图6a),结果表明,主成分PC1与主成分PC2的贡献率分别为63.6%和26.4%,发病较重的针叶内生细菌与其余3类相聚较远,表明在枯梢病侵染较严重的情况下,内生细菌多样性的变化较大,而无病斑针叶以及染病程度较轻的距离较近。染病较轻的状态下与无病斑状态相比,针叶内生细菌的构成差异较小。针叶混交林CZ主成分分析(图6b),主成分PC1与PC2的贡献率分别为71.17%和13.5%,其聚类规律与针阔混交林ZK一致。

      图  6  赤松针叶内部细菌主成分分析(a:针阔混交林;b:针叶混交林)

      Figure 6.  Principal component analysis of endosphere bacteria in needles of P. densiflora(a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

    • 通过高通量测序技术,对针阔混交林与针叶混交林的赤松针叶内细菌多样性与群落结构进行分析,结果表明:针阔混交林的针叶中细菌有效序列388 587条,共计679个OTU,分属28个门、69个纲、205个属;在针叶混交林针叶中的细菌有效序列336 600条,共计656个OTU,分属29个门、65个纲、190个属。赤松针叶内生细菌多样性丰富,无病斑针叶与染病针叶的优势细菌为变形菌门,无病斑针叶中内生细菌菌属为MassiliaEndobacterBryocellaSphingomonas。在其他松属类的内生细菌的研究中,经分离纯化获得的内生细菌优势菌株与本研究结论一致[10]

      研究结果表明,随着病害侵染的加重,内生细菌多样性及丰度逐渐降低,与植原体对寄主根部内生细菌研究中得出的结论一致[11],病原菌的入侵不仅对寄主植物组织造成危害,还对内生细菌的多样性及群落结构产生影响。申红妙[12]探明了桉树内生细菌群落变化与桉树对青枯病抗性间的关系,结果表明桉树根部组织中内生细菌的丰度减低,但茎、叶中内生细菌的丰度未受影响,不同组织受病害的影响存在差异,该结论为不同部位的内生微生物与病害的相关研究中得出的不同结果提供理论支持。植物内生细菌长期生活在植物体内的特殊环境中并与宿主协同进化,内生细菌在植物体内的定殖是一个主动过程,可以通过自身的代谢产物或借助于信号传导对植物体产生作用,而病原菌的入侵对内生细菌的定殖及传播产生影响。

      林分对土壤微生物的影响差异显著[13-14],在林分与内生细菌的研究中,两种林分混交林的内生细菌多样性及群落结构的变化趋势相近,仅在部分优势菌的种类存在差异,推测的原因是内生细菌多样性更多地受到寄主的影响,不同于土壤微生物。无病斑针叶与染病针叶多样性、群落结构等方面均存在差异,而两种林分在枯梢病对针叶内生细菌的影响差异方面呈现一致的趋势。纲水平上,两种林分中的优势纲均为α-变形菌,并随病害的严重程度的加剧呈上升趋势。属水平上,无病斑针叶中的优势菌群种类及相对丰度差别不大,MassiliaEndobacterBryocellaSphingomonas在两种林分中均为优势属。在枯梢病菌侵染后的针叶内优势细菌相对丰度受到影响,乳杆菌、BryocellaEndobacter、甲基杆菌属MethylobacteriumSingulisphaera相对丰度升高,MassiliaSphingomonas占比下降。Massilia作为植物体内生菌,能够以甘油或葡萄糖为前体高效合成聚羟基丁酸酯[15]Endobacter常在紫花苜蓿中分离得到[16]Bryocella作为好氧化异养型细菌[17-18],本研究中侵染较重的针叶中,Bryocella相对丰度升高,也说明了该属菌的生存未受病原菌的抑制。Sphingomonas在植物研究中发现具有一定的固氮作用,常在根际作为固氮细菌[19],受病害影响呈相对丰度降低,其变化趋势与其他病害对寄主的影响一致[20]。而染病针叶中BryocellaSingulisphaera与乳杆菌属相对丰度上升。Singulisphaera常见于土壤等腐殖质中,而本研究中,其在病害较重的针叶中出现,可推测在较重针叶内,细菌群落结构已被严重破坏,腐生性细菌入侵[21]。乳杆菌属的部分种具有促生和提高发酵质量的功效[22],也曾从植物组织内分离获得[23]。此外,在针叶混交林中甲基杆菌属上升。随着病害的加重,甲基杆菌属相对丰度升高,这与茶白星病侵染时丰度的表现一致[24],但有研究表明甲基杆菌属对部分病原微生物具有抑制性[25],因此其对枯梢病病原菌是否具有抑制作用仍需进一步研究。

    • 在针阔混交林与针叶混交林中,赤松针叶内生细菌的多样性及丰度随枯梢病侵染的严重程度呈现下降的趋势,两种林分的内生细菌群落结构受枯梢病菌影响变化趋于一致。针阔混交林和针叶混交林中,无病斑针叶的相对丰度较高的内生细菌菌属均为MassiliaEndobacterBryocellaSphingomonas。枯梢病菌的侵染影响了内生细菌的群落结构和多样性,细菌多样性及相对丰度随枯梢病的加重而降低。

参考文献 (25)

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