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丛枝菌根真菌(AMF)作为陆地生态系统中重要的微生物，能与陆地上80%的植物形成互惠共生体[1]。前人研究发现，AMF在生态环境中不仅能提高植株对养分的吸收，促进植株生长[2]，而且对植株根际土壤中的养分循环和土壤肥力起着重要作用[3]。有研究发现，AMF通过提高根际土壤酸性磷酸酶(AP)、脲酶(URE)和蛋白酶(PRO)的活性来提高土壤中的N、P养分含量[4]。然而，对于AMF主要调节了土壤中可利用N、P含量，还是对总量也有影响以及AMF对N和P的调节程度是否一致仍还有很多争议。有研究表明，AMF可以提高根际土壤有效N、P含量，降低了土壤总N、P含量[4-5]；但也有研究发现，AMF提高了土壤中总N含量，降低了土壤有效N含量[6-7]。还有一些研究认为，AMF对N、P的调节程度存在差异，导致土壤N:P比在接种AMF后出现较大改变。如AMF接种降低了狗尾草(Setaria viridis (L.) Beauv.)根际土壤的N:P比[8]，而AMF接种提高了桑苗(Morus alba L.)根际土壤的N:P比[9]。由此可见，AMF接种对土壤有效N、P含量及N、P总量、土壤N:P比存在怎样的影响？这种影响是否与N、P相关转化酶活性或其化学计量比有关仍不清楚。
N素是陆地生态系统中三大营养元素之一，对植物的生长起着至关重要的作用。有研究发现，施N能提高土壤酸性磷酸酶(AP)活性[10]。也有研究发现，施N提高了土壤中总N、有效N含量，但降低了总P、有效P含量，提高土壤N:P化学计量比，加剧土壤P限制[11]；但植株接种AMF后，N肥的添加能够促进其对N、P养分的吸收，从而降低土壤总N含量和N:P化学计量比，缓解土壤P限制[8]。部分研究发现，N添加显著提高了AMF接种植物根际土壤有效N、P含量及土壤AP和N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶(NAG)活性[12]；但是不同形态氮对土壤氮磷转化酶的影响存在差异。有研究发现，植株添加NH4+-N后，对根际微生物酶活性产生一定的毒害，导致各种N相关酶活性降低[13]；而也有研究发现，相对于NO3−-N添加，NH4+-N添加更容易导致土壤酸化，从而提高了土壤AP活性[14]。虽然关于N添加对土壤N、P含量以及相关酶活性的化学计量比研究较多，但主要集中在施加单一形态N和N施加量上[15]，关于AMF接种与不同形态N共同作用下会对土壤N、P含量和N、P相关酶活性及其化学计量比产生怎样的影响？何种氮肥添加下更有利于AMF提高土壤N、P有效性有待进一步研究。
杉木(Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook.)是我国亚热带地区主要的人工树种之一，面积达1 096 万hm2，约占人工林面积的21.35%[16]。杉木不仅面积范围广，还是AMF重要的宿主植物[17]。前人研究表明，在亚热带地区N仍是杉木生长的主要限制性因素之一[18]。目前，已有大量研究报道AMF与N添加对杉木生长与养分吸收的影响[19-20]，但鲜有关于AMF与不同形态N添加对杉木根际土壤N、P养分含量、相关酶活性及化学计量比的研究报道。
鉴于此，本研究以1年生杉木幼苗为对象，通过向杉木接种AMF并添加不同形态N(NH4+-N、NO3−-N)来研究AMF与不同形态N对杉木根际土壤N、P含量和N、P相关酶活性以及化学计量比的影响。其研究结果有利于明确AMF接种与不同形态氮共同作用下对杉木根际土壤N、P的调节作用，为杉木人工林的可持续经营管理提供理论依据与数据支持。
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土壤取自福建农林大学南平校区西芹教学林场杉木人工林0～20 cm的表层土。将土壤过2 mm筛后放到121 ℃高压灭菌锅中灭菌2 h备用。灭菌土壤铵态氮含量4.1 mg·kg−1，硝态氮含量12.21 mg·kg−1，总碳含量13.75 g·kg−1，总氮含量1.09 g·kg−1，全磷含量0.42 g·kg−1，有效磷含量12.68 mg·kg−1，pH值4.5[21]。
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本试验以摩西球囊霉(G. mosseae, Gm)为供试菌种，购买自北京农林科学院植物营养与资源研究所。选用玉米(Zea mays L.)为此次实验的扩繁宿主植物，玉米种子经10%NaClO消毒15 min，用无菌水(冷水经高温杀菌后冷却)冲洗5次。用上述灭菌土壤种植玉米并接种AMF。90 d后收获玉米，去除玉米的地上部分，将盆中的所有混合物作为接种剂。
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杉木种子灭菌处理同玉米种子，备用。
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本试验共设置6种处理，为2种AMF菌种处理（接种AMF(简称 + M)与未接种AMF(简称-M)）分别与3种不同形态氮添加处理（不施肥(简称CK)、施NH4+-N(简称NH4)、施NO3−-N(简称NO3)，每个处理4个重复。2020年5月给每个花盆(花盆底直径30 cm，高20 cm)中装入灭菌土壤6 kg，在每个花盆距离土壤表层10 cm的地方放置500 g的接种剂，对照为加入等量的灭菌处理土壤。在每个花盆中随机播种3粒杉木种子，出苗后进行疏苗，每盆留1株长势相当的幼苗。杉木出苗4个月后(2020年9月)开始添加N肥（(NH4)2SO4和KNO3），N的添加量为6 mg·盆−1。之后在2020年11月又进行了1次N肥添加，添加量与前一次相当。在整个试验期间将土壤水分含量保持在田间持水量的60%。
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培养结束后，去除土壤表层，采用抖落法收集杉木根际土[22]，并在实验室中将根际土中的根系去除，过2 mm筛，分2份保存。一份存于4 ℃冰箱，用于土壤铵态氮、硝态氮、可溶性有机氮含量及酸性磷酸酶(AP)、脲酶(URE)、酸性蛋白酶(PRO)、N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(NAG)活性的测定；一份进行风干研磨，用于土壤全磷、有效磷、全氮的测定。收集一部分植株根系，存于4 ℃的冰箱中，用于植株根系丛枝菌根真菌侵染率的测定。随后将植株的剩下部分先用105 ℃的烘箱杀青，再烘干至恒质量并研磨，用于植株氮磷的测定。
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根系侵染率采用醋酸墨水染色法检测[23]；植株磷采用快速消煮-钼锑抗显色法[24]，随后在分光光度计上进行测定；植株氮用元素分析仪(Elementarvario, 德国)进行测定。
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全氮用元素分析仪(Elementarvario, 德国)进行测试；全磷测定以行业标准LY/T. 1999-11-01为准，采用酸溶-钼锑抗比色法，最后用分光光度计检测；有效磷以行业标准LY/T 1233-1999为准，采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法，最后用分光光度计检测；铵态氮与硝态氮取鲜土于2 mol·L−1 KCl溶液中浸提，随后过滤，取过滤液于全自动间断化学分析仪(SmartChem, 意大利)中测定。AP、URE、PRO、NAG活性的测定用双抗体夹心法[25]，在酶标仪(Labsystems Mulitiskab MS，芬兰)352型进行测定。
可溶性有机氮=可溶性总氮−矿质氮[26]。
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利用Excel2010对数据进行数据处理，用orgin2019建库作图。利用SPSS25.0统计软件的独立样本T检验对接种AMF与未接种AMF处理下的测试指标平均值进行统计分析。同一接种且不同施肥处理的统计分析用单因素方差分析中的邓肯检验比较样品间的差异显著性，显著性水平=0.05。
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表1显示：AMF接种对杉木根系侵染率、植株氮与磷吸收存在明显的影响，而不同形态氮及其与AMF之间的交互作用对上述3个指标无明显影响。杉木接种AMF后的侵染率在60%左右，说明杉木与AMF形成良好的菌根共生体。此外，在未接种AMF的杉木根系中发现5%左右的侵染率，这是可接受的菌根侵染污染范围[27]。杉木接种AMF后显著提高了植株对N、P的吸收(CK处理下P除外)(p<0.05)，其中，植物N吸收量在CK、NH4+-N和NO3−-N处理下分别增加59% ± 13%、116% ± 46%、23% ± 19%；植株P吸收量在添加NH4+-N和NO3−-N处理下分别增加40% ± 20%、28% ± 14%。
氮处理
Nitrogen treatment接种处理
Inoculation treatment根系侵染率/%
Root colonization rate植株氮含量/(g·株−1)
Plant nitrogen content植株磷含量/(mg·株−1)
Plant phosphorus contentCK + M 59 ± 5Aa 0.27 ± 0.03ABa 11.61 ± 1.69Aa −M 5 ± 0.3Ab 0.17 ± 0.03Ab 9.17 ± 0.77Aa NH4 + M 73 ± 2Aa 0.34 ± 0.1Aa 14.00 ± 1.02Aa −M 5 ± 0.2Ab 0.16 ± 0.1Ab 10.02 ± 0.17Ab NO3 + M 77 ± 7Aa 0.27 ± 0.02Ba 13.34 ± 0.75Aa −M 6 ± 0.2Ab 0.22 ± 0.02Ab 10.43 ± 1.93Ab M *** *** ** N NS NS NS M × N NS NS NS 注：表中数据为平均值 ± 标准误(n=4)，表1部分来自文献[21]。CK：空白对照；NH4：铵态氮；NO3：硝态氮；M：丛枝菌根真菌，N：氮，不同大写字母表示同一接种处理下不同氮处理间差异显著(p<0.05)，不同小写字母表示同一氮处理下不同接种处理间差异显著（p<0.05）；***、**和*分别表示p < 0.001、p < 0.01、p < 0.05上差异显著，NS表示影响不显著。下表同。
Notes: The data are means ± standard error(n=4), Part of data in Table 1 derived from our published data[21]. CK: Blank control; NH4: Ammonium nitrogen; NO3: Nitrate nitrogen; M: AMF; N: Nitrogen, Different uppercase letters indicate significant difference among different nitrogen treatments for the same inoculation treatment(p<0.05), Different lowercase letters indicate significant difference between different inoculations for the same nitrogen addition treatment(p<0.05). ***, p<0.001; **, p<0.01; *, p<0.05; NS, not significant. The same below.Table 1. Effects of AMF inoculation and different forms of N addition on root colonization and nitrogen and phosphorus uptake of Chinese fir
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图1显示：不同形态氮添加与AMF之间的交互作用对土壤全磷和有效磷没有显著影响。对土壤全P而言，接种AMF在一定程度上都降低了各处理下土壤全P的含量(p<0.05)，且NO3−-N添加下土壤全P下降27% ± 1%，NH4+-N处理下降10% ± 1%(图1a)。对土壤有效P而言，接种AMF显著提高了各处理下土壤有效P的含量(图1b) (p<0.05)，其中，CK、NH4+-N以及NO3−-N处理下有效P含量分别增加53% ± 40%、39% ± 10%和69% ± 25%，NO3−-N处理下有效P的提升幅度显著高于NH4+-N处理。
Figure 1. Effects of AMF inoculation and different forms of N addition on soil total P and available P
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表2显示：接种AMF、不同形态氮添加及二者的交互作用对土壤硝态氮、铵态氮均有显著影响，而不同形态氮添加对全N有影响，但对可溶性有机氮（DON）没有影响。与对照相比，氮添加显著提高了接种与未接种AMF杉木土壤中铵态氮和硝态氮的含量，而且NH4+-N的添加对土壤铵态氮含量的提升作用强于硝态氮，而NO3−-N添加对土壤硝态氮含量的提升作用明显强于铵态氮(表2)(p<0.05)。与未接种AMF相比，杉木接种AMF使CK处理中全N含量下降了7% ± 2%；NO3−-N处理下，硝态氮、铵态氮和DON的含量分别下降36% ± 3%、36% ± 3%、68% ± 11%；NH4+-N处理下，铵态氮和DON含量下降幅度为29% ± 5%与52% ± 10%；土壤铵态氮在NO3−-N处理下的降幅显著高于NH4+-N处理(表2)。
氮处理
Nitrogen
treatment接种处理
Inoculation
treatment硝态氮
Nitrate nitrogen/
(mg·kg−1)铵态氮
Ammonium nitrogen/
(mg·kg−1)全氮
Total nitrogen/
(mg·kg−1)可溶性有机氮
Dissolved
organic nitrogen/
(mg·kg−1)CK + M 1.40 ± 0.38Ca 3.06 ± 0.54Ca 895.89 ± 27.02Bb 24.06 ± 1.92Aa −M 2.36 ± 0.47Ca 3.83 ± 1.22Ca 967.49 ± 6.41Aa 13.18 ± 4.69Ba NH4 + M 6.48 ± 1.23Ba 17.73 ± 0.75Ab 966.40 ± 31.52Aa 22.18 ± 1.53Ab −M 10.33 ± 1.08Ba 25.31 ± 1.57Aa 972.71 ± 23.13Aa 50.81 ± 9.40ABa NO3 + M 14.58 ± 0.58Ab 11.64 ± 0.65Bb 1012.36 ± 27.34Aa 13.69 ± 0.25Bb −M 22.74 ± 1.03Aa 18.23 ± 0.6Ba 1016.57 ± 47.54Aa 53.04 ± 16.03Aa M *** *** NS ** N *** *** ** NS M × N ** *** NS ** Table 2. Effects of AMF inoculation and different forms of N addition on soil of nitrate nitrogen, ammonium nitrogen, total nitrogen and dissolved organic nitrogen
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图2显示：接种AMF与不同形态氮添加及二者的交互作用对AP、URE、PRO和NAG有显著影响(AMF接种与不同形态氮添加对AP、NAG的交互作用除外)。与对照相比，氮添加显著提高了土壤PRO活性，但添加NH4+-N处理显著降低了土壤NAG的活性(p<0.05)。接种AMF显著提高了各处理下AP、URE(CK除外)和NAG的活性(图2)，其中，NO3−-N处理对NAG活性的促进作用(22% ± 6%)高于NH4+-N处理(10% ± 2%)，而NH4+-N处理对URE的促进作用(23% ± 23%)高于NO3−-N处理(8% ± 12%)。
Figure 2. Effects of AMF inoculation and different forms of N addition on the activities of soil acid phosphatase, urease, acid protease and N-acetyl-β-D glucosidase
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图3表明：接种AMF与不同形态氮添加对URE:AP、PRO:AP、NAG:AP存在显著影响，且二者的交互作用对URE:AP和NAG:AP存在显著影响。不同接种处理和不同氮添加处理对根际土壤N:P比虽没有显著影响，但略微提高了土壤的N:P比。与未接种AMF相比，杉木接种AMF后普遍降低了土壤URE:AP、PRO:AP及NAG:AP的比值，其下降幅度分别为−2%～16%、17%～24%、2%～15%(图3)；但不同形态氮添加对于不同土壤酶的化学计量比的下降幅度具有差异性，NO3−-N处理下URE:AP和PRO:AP的下降幅度（分别为10% ± 3%和21% ± 4%）均高于NH4+-N处理(−2% ± 0.2%、17% ± 2%)，而NH4+-N处理下NAG:AP下降幅度(9% ± 5%)高于NO3−-N处理(2% ± 2%)。
Figure 3. Effects of AMF inoculation and different forms of N addition on soil nitrogen and phosphorus ratio and related enzyme stoichiometry
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本研究发现，杉木接种AMF后土壤有效P在根际富集，根际土壤AP活性显著提高，而土壤全P含量则降低(图1)，这一研究结果与宰学明等[4]的研究结果一致。本研究中，杉木接种AMF后提高了根际土壤中AP活性，可能是因为供试土壤来自亚热带地区，该地区土壤通常被认为受P限制，接种AMF促进土壤微生物分泌AP以缓解P限制[28-29]。土壤AP可以促进有机P矿化，从而提高土壤有效P含量[30]，土壤总P降低可能是AMF扩大植株根系，促进植物对P的吸收(表1)，导致土壤中部分P向植物体内转移[31]。此外，AMF菌丝与植株根系能分泌有机酸酸化根际环境，从而促进土壤中难溶性磷酸盐(Ca10-P和O-P)的活化，并向有效态P转化[32]。
Yang等[33]研究认为，N添加会引起土壤酸化，从而加速P素的矿化以弥补无机P的不足，且磷酸酶是一种含N量很高的酶，N输入刺激了微生物获取更多的N元素并转给磷酸酶，从而促进有效P的增加[34]。前人研究发现，在施肥初期相对于NO3−-N，NH4+-N处理更有利于提高土壤有效P含量[35]，而在本研究中，杉木接种AMF后添加NO3−-N下土壤有效P上升幅度高于NH4+-N处理。这可能是由于杉木幼苗接种AMF后根际土壤中的微生物对NO3−-N具有吸收偏好，土壤中NO3−-N的增加为土壤微生物合成高N含量的磷酸酶提供了丰富的N源，使得土壤酸性磷酸酶活性也随之增加。因此，NO3−-N处理下有效P的上升幅度高于NH4+-N处理。
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本研究发现，NH4+-N和NO3−-N的施加提高了接种与未接种AMF杉木根际土壤全N含量，表明N肥的添加有利于根际土壤全N的积累[36]。然而，与未接种AMF相比，接种AMF在一定程度下降低了不同处理下杉木根际土壤中的NH4+-N和NO3−-N含量(其中NH4+-N处理下铵态氮含量以及NO3−-N处理下硝态氮和铵态氮含量显著下降)(表2)。前人也有类似的研究结果[7]，这是因为AMF能促进杉木对N的吸收(表1)，且杉木主要吸收土壤中的NH4+-N和NO3−-N[37]，故AMF降低杉木根际土壤中无机N的累积。本研究中，杉木接种AMF并施N肥后，根际土壤中的DON相对于未接种显著下降，这可能是因为AMF能提高土壤中N相关转化酶的活性(图2)，而N相关转化酶能促进有机N的矿化[38]，从而减少土壤中DON的含量。
在本研究中，接种AMF提高了杉木根际土壤URE和NAG活性(图2)。这是因为AMF的菌丝体以及根渗出液对土壤微生物产生积极影响，从而对养分代谢产生促进作用，并增强了土壤酶活性[30]；但接种AMF后不同形态氮添加对不同土壤酶活性的影响具有差异性，添加NH4+-N和NO3−-N后PRO活性显著高于CK(图2)，这与张雪等[39]和马宗斌等[40]结果相似。张艺等[15]认为，N肥的添加缓解土壤有效N的限制，植物获取N素增加，提高了土壤中PRO的活性。本研究中，杉木接种AMF后，NO3−-N处理下NAG活性增幅最大，NH4+-N处理下URE活性增幅最大(图2)。说明NH4+-N更有利于提高URE活性，NO3−-N更有利于提高NAG活性。NH4+-N和NO3−-N对不同酶活性具有不同影响的原因可能是不同N形态对分泌不同氮转化酶微生物的影响不同所致[41-42]，因为微生物对不同形态N也存在吸收偏好[43]。
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本研究中，与未接种AMF相比，杉木接种AMF后适度的提高了杉木根际土壤的N:P比，这是因为接种AMF对土壤全N影响不明显，但却显著降低了土壤全P含量，从而导致土壤中N:P比提高。这表明AMF对土壤全P的调节作用明显强于土壤全N。从土壤N、P元素相关酶活性的化学计量比看，虽然接种AMF显著提高了土壤AP、URE、NAG活性(图2)，但接种AMF普遍降低了URE:AP、PRO:AP和NAG:AP的化学计量比(图3)，这表明AMF对土壤AP的促进作用明显强于氮相关转化酶。出现这一现象的原因可能在于供试土壤取自亚热带红壤地区，该地区土壤脱硅富铝铁化严重，导致土壤受P的限制明显强于N限制[44]，而接种AMF有利于缓解土壤P的限制，维持土壤N、P平衡。此外，NO3−-N处理下URE:AP、PRO:AP的下降幅度均高于NH4+-N处理。这表明，相对于添加NH4+-N，NO3−-N更有利于通过调节土壤氮磷转化酶的活性及其化学计量比来维持土壤N、P平衡。
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接种AMF有利于提高土壤有效P含量，降低土壤硝态氮、铵态氮、DON、全P含量，NO3−-N处理下有效P含量增加幅度高于NH4+-N处理，但土壤硝态氮、铵态氮含量在NO3−-N处理下的下降幅度高于NH4+-N处理；接种AMF与不同形态N添加提高了土壤中URE、AP和NAG活性，但降低了土壤中URE:AP、PRO:AP和NAG:AP的化学计量比，其中，在NO3−-N处理下土壤中URE:AP、PRO:AP的化学计量比的下降幅度高于NH4+-N处理，说明AMF对土壤AP的促进作用明显强于氮相关转化酶。本研究表明，在亚热带地区特殊的生态环境中，杉木接种AMF有利于通过提高土壤氮磷转化酶活性和改变氮磷转化酶化学计量比来调节土壤氮磷含量，维持土壤氮磷平衡，且NO3−-N处理下的调节效果强于NH4+-N处理。为了促进该地区土壤环境的氮磷良性循环，既要保护当地杉木中已存在的AMF，且NO3−-N肥的施用效果更优。
Effects of Arbuscular Mycorrhizal Fungi Inoculation and Different Forms of Nitrogen Addition on Soil Nitrogen and Phosphorus Contents and Enzyme Stoichiometry in the Rhizosphere of Chinese Fir Seedlings
- Received Date: 2022-06-06
- Accepted Date: 2022-08-01
- Available Online: 2023-02-20
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