Variation in Leaf Structure of Camellia oleifera Under Drought Stress

试验区位于江西省分宜县中国林业科学研究院亚热带林业实验中心油茶优良无性系示范林内。该区地处江西省中西部(27°33′~28°08′N，114°29′~114°51′E)，属于亚热带季风性湿润气候，年降水量1 600 mm，年平均气温17.6℃，极端最高气温40.1℃，全年无霜期270 d。

在林分内选取生长正常、生长状况基本一致的‘长林4号’油茶优良无性系作为试验材料，供试材料的树龄为7年生，地径6.5 ~9.0 cm，树高1.5 ~2.5 m，冠辐1.8 ~2.3 m。

试验于2016年7月20日开始实施。首先选定试验样地，选择地形平缓、土壤状况基本一致的区域，样地面积为8 m×15 m，用钢架在样地的四周搭起3.5 m高的大棚，棚顶用透明材料封顶，达到防雨透光的效果，大棚的四周用透明的塑料薄膜围起，防止雨水溅入棚内，棚顶与大棚四周薄膜留出0.5 m的空隙，使内外空气能够相互流通，尽量使棚内外的温湿差异降到最低，同时在每个处理样地的四周挖1.2 m深沟并铺设塑料薄膜，防止水分在各个处理间相互渗入，影响试验条件。

试验设置4个处理：土壤含水率分别为15%~20%(重度干旱胁迫)、20%~25%(中度干旱胁迫)、25%~30%(轻度干旱胁迫)和自然状况(对照)。土壤水分由TNL-GK5型土壤水分智能灌溉控制系统(锦州天诺环能仪器有限公司)自动控制，土壤水分传感器埋设深度为30 cm，当水分低于设定值时，灌溉自动开启，灌溉方式为滴灌；同时每个处理下埋设L99-TWS-4土壤温湿度记录仪(上海巴玖实业有限公司)，每0.5 h自动观测并记录1次。埋设方式为：在以树体为中心，树冠线为半径的圆柱体的外围埋设温湿度传感器探头，埋设土壤深度分别为10、20、40、60 cm。每天10:00及18:00进行水分监控，以保证试验期间水分含量始终保持在设定的水分范围之内。图 1是自然状况下20、40 cm深度土壤含水率随时间的变化，自然状况下的土壤含水率在9月10日至11月9日时间段长期处于30%~40%之间，此时间段水分充足，以此作为对照。

Figure 1.  Changes of soil moisture content with time in 20 cm and 40 cm depth under natural condition

干旱胁迫处理20 d后，每隔5 d摘取油茶春梢顶端往下第3~5片叶片，共测定10次。每次取样后将叶片表面擦拭干净，立即称叶片的鲜质量(W_f)，后将叶片浸入蒸馏水中24 h，取出用吸水纸吸干叶片表面水分，称饱和质量(W_t)，最后将叶片置于105℃烘箱中杀青15 min，于80℃下烘干至恒量，称干质量(W_d)，计算叶片相对含水量(RWC)，所有指标均称取10次，结果取平均值。

干旱胁迫处理第50天，摘取油茶春梢顶端往下第3~5片叶片，用游标卡尺测量叶片长度、宽度，采用方格纸计数法计算叶面积，每个处理测量30片，结果取平均值。

在干旱胁迫处理第60天时，摘取油茶春梢顶端往下第3~5片叶片，将叶片表面擦拭干净，采用指甲油印迹法，选择叶片下表皮靠近叶脉部位均匀涂上无色指甲油，晾干，然后用透明胶带快速粘下指甲油薄膜层，剪成1 cm×1 cm方块，置于载玻片上展平，盖好盖玻片做上标记，用YYS-110E光学显微镜(上海仪圆光学仪器有限公司)分别在100倍和400倍下观察并照相，在100倍镜视野下统计气孔数目，在400倍镜视野下随机抽取完整清晰的气孔，测量气孔内、外纵径和横径及气孔面积、气孔周长，每个处理观测30个视野，结果取平均值。

气孔密度=气孔数目/视野面积

在干旱胁迫处理第50天，摘取油茶春梢顶端往下第3~5片叶片，从叶片中部主脉两侧剪取2 mm×2 mm的方块，置于FAA(70%乙醇90 mL+甲醛5 mL+乙酸5 mL)中固定，于4℃冰箱中保存，用于做常规石蜡切片，材料经FAA固定24 h以上，乙醇和二甲苯系列脱水透明，浸蜡，包埋，切片(切片厚度为8 μm)，番红-固绿染色，中性树胶封片后制成永久装片，YYS-110E光学显微镜下观察照相，每个处理观测30个视野，测定叶片叶表皮、叶肉、叶脉等结构参数，结果取平均值。

采用Artcam Measure 2.0软件观察分析图像，并进行叶片结构参数测定。利用SPSS 17.0软件对数据进行方差分析和Duncan多重比较，Origin 9.0软件作图，Photoshop软件进行图像处理。

油茶叶片形态结构为宽卵形，革质，先端渐尖，边缘有明显的锯齿，中脉突起，表面中脉有细毛，叶表面显光泽，与一般双子叶植物的叶相同，油茶叶片解剖结构可分为叶表皮、叶肉、叶脉。叶表皮外覆有角质层与蜡质，上表皮较厚，由长形细胞排成一层，细胞外壁具角化的角质层，下表皮较上表皮薄，细胞体积较小，气孔主要分布在叶的下表皮，是调节蒸腾与外界气体交换的通道，气孔近圆形，由两个保卫细胞组成(图 2A、B)。叶肉有栅栏组织和海绵组织2部分，栅栏组织紧靠上表皮，细胞呈圆柱形，排列2~3层，内含大量叶绿体，是光合作用的主要场所。海绵组织靠近下表皮，细胞较大，近圆形，排列疏松，胞间隙较大，便于气孔与叶肉之间的联系(图 2C)。叶脉横切面呈束状，主脉由薄壁组织、维管束、维管束鞘组成，薄壁组织发达，有晶体分布，晶体呈簇状，维管束鞘包括木质部与韧皮部，维管束包括木质部、韧皮部和形成层三部分，木质部含有大量导管(图 2D)。

Figure 2.  Leaf anatomical structure of C. oleifera

由表 1可看出：随着干旱程度的增加，油茶叶片厚度呈下降趋势，T3、CK处理的叶片厚度较T1、T2的大，分别为392.67、387.60 μm，T1处理的最小，仅为373.22 μm，与CK相比，T1、T2处理的叶片厚度差异显著；叶片长度、叶片宽度、叶面积随着干旱程度的增加呈降低趋势，且不同处理间差异性显著。从表 2可看出：油茶单叶鲜质量、单叶干质量和单叶饱和质量均随土壤水分的增加呈上升趋势，即T1＜T2＜T3＜CK，且T1、T2、T3处理与CK差异显著。叶片相对含水量T1处理的最小，为75.25%；T2、T3与CK处理差异不显著，3个处理的叶片相对含水量分别为79.38%、78.86%、77.19%。

图 3是不同干旱处理下油茶叶片下表皮气孔分布(图 3A，100倍镜下观察)与气孔特征(图 3B，400倍镜下观察)。图 4表明：随着干旱程度的加剧，油茶叶片气孔密度呈先降低后上升的变化，其中，重度干旱胁迫T1与CK的气孔密度均较大，分别为227.91、220.38个·mm^-2，中度干旱胁迫T2的气孔密度最小，为191.62个·mm^-2；与CK相比，T1处理对气孔密度的影响差异不显著，T2、T3处理对气孔密度的影响差异显著。气孔面积随着土壤含水率的减少呈下降趋势，T1、T2、T3分别比CK降低了23.09%、9.58%、7.80%，且T1、T2、T3与CK相比差异显著。气孔周长、气孔器大小、气孔开度均与气孔面积变化趋势相同，即随着干旱程度的增强，气孔周长、气孔器长与气孔器宽、气孔开度长与气孔开度宽均有不同程度的下降，且差异显著。

Figure 3.  Stomatal structure of lower epidermis of C. oleifera under drought stress

Figure 4.  Stomatal parameters of leaf epidermis of C. oleifera under drought stress

不同干旱程度胁迫下，油茶叶片内部结构差异较大(图 5A，表 3)，随着干旱程度的增强，叶片上表皮厚度、下表皮厚度呈下降的趋势，且上表皮厚度大于下表皮厚度，T1处理的叶片上表皮厚度、下表皮厚度均最小，分别为18.69、16.19 μm，CK处理的叶片上表皮厚度最大，为23.38 μm，T3处理的下表皮厚度最大，为18.12 μm，且与CK处理相比，T1处理的叶片上表皮厚度、下表皮厚度均差异显著。因此，当油茶受到重度干旱胁迫时，叶片上表皮、下表皮均显著变薄。

Figure 5.  Leaf anatomy structure of C. oleifera under drought stress

随着干旱程度的加剧，叶片上角质层厚度、下角质层厚度在整体上表现为增加，且上角质层厚度大于下角质层厚度，尤其是遭受重度干旱胁迫时，叶片上角质层厚度、下角质层厚度显著增大，分别为5.73、3.62 μm，与CK相比，T1处理的上角质层厚度、下角质层厚度均差异显著，T3处理的差异均不显著。

从CK至T1处理，随着干旱胁迫的加强，叶片栅栏组织厚度和栅海比均逐渐减小，海绵组织厚度变化不显著，栅栏组织厚度和栅海比CK处理的均最大，分别为141.89、0.72，T1处理的均最小，分别为128.05、0.65，T1、T2处理的栅栏组织厚度显著低于CK。由此可见，油茶叶片结构变化同干旱胁迫程度密切相关，轻度干旱胁迫下影响较小，中度干旱胁迫、重度干旱胁迫对叶片影响较大。

根据干旱胁迫下油茶叶片主脉结构特征(图 5B)，对各组织结构进行测量并对各参数进行多重比较分析(表 4)可见：不同程度干旱胁迫对叶片主脉解剖结构影响显著。随着干旱程度的增强，主脉厚度逐渐增加，T1处理的主脉厚度达到682.39 μm，T1、T2、T3处理的主脉厚度分别比CK增加了17.6%、7.8%、2.4%，T1、T2处理与CK相比差异显著，T3处理与CK相比差异不显著，原因可能是T3、CK处理的土壤含水率较接近；T2处理的木质部厚度显著低于T1、T3、CK；T1、T2处理的维管束短径显著低于T3和CK；韧皮部厚度在不同干旱处理间差异不显著，厚度均在72~75 μm之间；随干旱胁迫的加剧，T1、T2、T3处理的主脉突起度显著高于CK，重度干旱胁迫下主脉突起度最大(1.71)，CK处理的最小(1.54)，且T1、T2、T3处理与CK相比，均差异显著。

叶片是植物对环境变化比较敏感和可塑性较大的器官，叶片形态特征尤其是叶片解剖结构、外表皮微形态结构与其抗旱性密切相关，干旱状况下，叶片结构主要向降低蒸腾、增强保水能力和提高光合作用等几个方面发展。

叶片外部形态特征对干旱胁迫的响应是最直观的体现，叶片相对含水量在一定程度上反映了植物水分亏缺程度，更为敏感地反映植物水分状况的改变。本研究结果表明，随着干旱胁迫程度的增加，油茶叶片厚度、叶片长度、叶片宽度、叶面积变小，原因可能是干旱胁迫使油茶水分代谢受到影响，叶片水分亏缺影响叶片细胞正常的生长和分裂，从而导致叶片生长受阻；本研究中，中度干旱胁迫、重度干旱胁迫下的栅栏组织厚度显著降低，这也可能是造成叶片厚度变小的主要原因之一。随着干旱胁迫程度的加剧，油茶叶片单叶鲜质量、单叶干质量、单叶饱和质量均有不同程度的降低，中度干旱胁迫、重度干旱胁迫与自然状况相比差异显著。由此可见，油茶叶片外部形态特征对干旱胁迫的适应进一步证实了叶片外部形态特征与水分亏缺程度的密切相关性。

气孔是植物叶片与自然环境进行水分及气体交换的主要通道，植物的蒸腾作用和光合作用很大程度上是通过叶片气孔运动调控的^[19]，植物通过气孔蒸腾散失水分，因此，叶片的气孔形状、气孔开度及气孔密度的大小等与植物的抗旱性密切相关，气孔调节也是植物应对干旱胁迫作出调控的机制之一^[20]。本研究结果显示，油茶叶片气孔面积、气孔周长、气孔大小及气孔开度均随着干旱程度的加剧呈下降趋势，与大多数研究结果一致^{[5, 21]}；然而，气孔密度却先减小后增大。有些研究认为，随着干旱程度增强，气孔密度增大^{[5, 7]}；也有研究认为，气孔密度随干旱胁迫程度的增强先上升后降低^[22-23]，出现这些结果的可能原因是叶片气孔密度对环境条件的响应与适应具有多样性和复杂性的特点。一种观点认为，气孔密度与气体交换阻力成反比，气孔密度越小，气体交换阻力越大，蒸腾减少，叶片散失到外界环境的水分会减少；另一种观点认为，气孔密度越大，对植物的光合作用越有利，而且能够快速地将热量散掉，从而叶片可以避免因温度过高使叶绿体及原生质变性^[20]。因此，气孔密度使植物对干旱逆境的适应可能具有不确定性，应通过更多深入的研究，来探讨干旱胁迫对气孔密度造成的影响。

表皮和角质层是保护叶片免受外界破坏的基本结构，干旱胁迫下油茶叶片表皮细胞和角质层受到显著影响，随着干旱程度的增强，叶片上表皮、下表皮细胞厚度均变小，且上表皮细胞厚度大于下表皮细胞；叶片上角质层、下角质层厚度均有不同程度的增加，角质层增厚可以有效防止水分蒸腾，从而具有保水作用。

叶肉是植物进行光合作用的主要场所，叶肉各组织厚度的变化对植物生长及水分利用有较大的影响。本研究结果显示，当干旱程度不断增加，油茶叶片的栅栏组织厚度显著降低，但海绵组织厚度却几乎不受影响，从而导致栅海比随之降低，这与张诚诚等^[6]在油茶容器苗应对水分胁迫、陈昕等^[24]在石灰花楸(Sorbus folgneri (Schneid.) Rehd.)幼苗应对干旱胁迫、吴丽君等^[7]在赤皮青冈(Cyclobalanopsis gilva (Blume) Oerst.)幼苗对干旱胁迫的响应的研究结果基本一致(海绵组织厚度除外)，这些特征都是油茶应对干旱胁迫自身转变出的一系列适应对策。然而，成熟叶片的器官已经完成，短期干旱下植物很难通过弹性调节来实现抗旱性的提高，只能被动地改变组织结构来完成适应。

随着干旱程度的加剧，油茶叶片主脉厚度逐渐增加，中度干旱胁迫处理的木质部厚度显著低于轻度、重度干旱胁迫及对照，而中度、重度干旱胁迫的维管束短径显著低于轻度胁迫和对照；不同干旱处理对韧皮部厚度的影响差异不显著，厚度均在72~75 μm之间；随干旱胁迫的加剧，主脉突起度逐渐增大，主脉突起度与水分运输有关，重度干旱胁迫下通过增大主脉突起度，以更好的运输水分来适应干旱逆境，从而维持生存。

当油茶植株处于干旱逆境下，尤其是达到中度干旱、重度干旱程度，油茶成熟叶片出现了明显的叶片变薄，叶片变小，栅栏组织和栅海比变小，气孔面积、气孔周长、气孔大小、气孔开度减小，主脉厚度增加等解剖结构的变化。叶片结构的这些改变正是油茶植株对干旱逆境的适应特征，这些结构特征的变化进而影响叶片生理功能的变化，根据叶片水分亏缺程度，调节水分分配，以维持生存及生长。在今后的研究中，可结合叶片显微结构、细胞器结构及生理生化指标等对干旱逆境的响应，更深入地了解油茶的抗旱机理。