Effects of Manganese Ion and Cobalt Ion Stress on Nutrition and Antioxidant Capacity of Gypsy Moth Larvae

舞毒蛾虫卵及饲料购自中国林业科学研究院。总抗氧化力试剂盒购于南京建成生物研究所。六水氯化钴（分析纯），购自天津市巴斯夫化工有限公司；四水氯化锰（分析纯），购自天津市东丽；牛血清白蛋白（生物纯），购自Biotopped Science &Technology Co.Ltd；总抗氧化力试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。

舞毒蛾虫卵用10%甲醛溶液浸泡1 h消毒，流水冲洗30 min，晾干后置于(25±1)℃、光照周期16 L:8 D、相对湿度75±1%条件下孵化，用人工饲料饲养，每两天更换饲料，清理养虫盒^[9]。

先进行毒力测定，取浓度为0.2 、0.4、0.8 mmol·g⁻¹Mn²⁺的四水氯化锰混合饲料和0.42、0.83、1.66 mmol·g⁻¹ Co²⁺的氯化钴溶液分为6组，每组10只虫，观察舞毒蛾4龄幼虫的死亡率，发现0.40 mmol·g⁻¹ Mn²⁺的四水氯化锰混合饲料和0.83 mmol·g⁻¹ Co²⁺的六水氯化钴混合饲料处理的舞毒蛾4龄幼虫84 h时死亡率同为30%。因此取配制好的四水氯化锰溶液和六水氯化钴溶液各40 mL煮沸，然后分别加入干饲料11 g、琼脂0.8 g煮沸后倒入饲料盒中配制成两种混合饲料。选取大小一致的舞毒蛾4龄幼虫，采用两种混合饲料分别进行饲喂处理。以蒸馏水配制饲料作为对照。观察84 h后测定舞毒蛾幼虫的死亡率、取食量、虫粪量、体质量增长量，然后取存活幼虫液氮研磨后，放置于-80℃冰箱保存。每组处理幼虫30头，水平重复为3次。

取研磨样品100 mg，加入0.9%的NaCl溶液900 μL，漩涡振荡抽提2 min，4 ℃、2 500 r ·min⁻¹离心10 min，取上清液作为蛋白质、碳水化合物及海藻糖含量测定的样品溶液^[10]。蛋白质含量采用Bradford考马斯亮蓝G-250染色法进行测定^[11]，碳水化合物含量测定参考J.H. Roe^[12]的方法进行测定，海藻糖含量参照雷芳等蒽酮法^[13]测定，脂质含量参照P. Simek等的方法^[14]测定。

总抗氧化力采用南京建成生物工程研究所总抗氧化力试剂盒，按说明书进行测定计算，测定时用双蒸水调零，波长520 nm，每个测定管设一个对照管。

采用SPSS 21.0软件和Excel软件进行数据统计分析。数据以“平均值±标准误”表示。采用配对样本T检验分析处理组与对照组之间的差异显著性。柱形图绘制均采用Origin Pro 9. 0软件。

重金属处理的舞毒蛾幼虫死亡率均为30%（表1）。

重金属处理的舞毒蛾幼虫取食量、虫粪量、体质量增长量均显著低于对照组。相比对照组，Mn²⁺处理组取食量降低80.06%，虫粪量降低95.64%，体质量增长量降低203.94%；Co²⁺处理组取食量降低95.29%，虫粪量降低90.26%，体质量增长量降低140.86%。表明Mn²⁺和Co²⁺对舞毒蛾幼虫取食量、虫粪量、体质量增长量均有显著的抑制作用（图1）。

Figure 1.  The effect of Mn²⁺ and Co²⁺ on body weight and nutritional intake of gypsy moth larvae

重金属处理的舞毒蛾幼虫可溶性蛋白含量、碳水化合物含量、海藻糖含量、脂质含量均显著低于对照组。与对照组相比，Mn²⁺处理组可溶性蛋白含量降低33.76%，碳水化合物含量降低57.56%，海藻糖含量降低64.05%，脂质含量降低27.77%；Co²⁺处理组可溶性蛋白含量降低47.46%，碳水化合物含量降低59.45%，海藻糖含量降低59.16%，脂质含量降低33.71%。表明Mn²⁺和Co²⁺对舞毒蛾幼虫可溶性蛋白含量、碳水化合物含量、海藻糖含量、脂质含量均有显著的抑制作用（图2）。

Figure 2.  The effect of Mn²⁺ and Co²⁺ on nutritional composition of gypsy moth larvae

重金属处理的舞毒蛾幼虫总抗氧化力均显著高于对照组。与对照组相比，Mn²⁺处理组总抗氧化力增加28.25%，Co²⁺处理组总抗氧化力增加82.54%。表明Mn²⁺和Co²⁺对舞毒蛾幼虫总抗氧化力有显著的促进作用（图3）。

Figure 3.  The effect of Mn²⁺ and Co²⁺ on the total antioxidant capacity of gypsy moth larvae

环境中重金属会对植物的生长发育产生不同程度的影响，可直接影响植物生长，也可通过影响土壤的生理特性进一步影响植物的生长发育^[15]。舞毒蛾幼虫作为杂食性昆虫，主要以植物的叶片为食，但由于不同树种叶片营养成分、吸收存储重金属离子能力存在差异^[16]，同时舞毒蛾幼虫对不同树叶存在取食偏好性等原因^[17]，采取不同树叶进行研究容易摄入过多变量，导致难以分析食物中重金属的含量对舞毒蛾幼虫的影响。因此本实验采用重金属离子溶液配置的混合饲料饲喂舞毒蛾4龄幼虫进行实验。有研究表明在饲料中添加Cd²⁺显著延长了舞毒蛾幼虫的发育时间，并且显著降低了其取食量和体质量增长量^[18]，可能是因为舞毒蛾幼虫的取食偏好性，对含重金属的食物不喜欢所致。本研究发现舞毒蛾幼虫的肠道受到严重的破坏，甚至溶解，说明很大的可能性是由于舞毒蛾幼虫的肠道遭到了重金属的破坏。Malakar C等人的研究也发现在Cd²⁺的胁迫作用下，短角稻蝗（Dnopherula brevicornis）幼虫的日增重、生长速率和寿命会明显降低^[19]；与本实验结果相吻合；表明很可能是因为重金属本身对舞毒蛾幼虫具有刺激作用。可溶性蛋白是重要的渗透调节物质和营养物质，其变化可以反映细胞内蛋白质的合成、变性和降解等重要信息^[20]。有研究表明，重金属如Pb等可通过与蛋白质的-SH或其它基团的相互作用，改变其结构或功能，进而影响其合成代谢^[21]，这结果与本实验结果相吻合，这可能是因为重金属胁迫对蛋白质的合成具有一定的抑制作用，抑制了蛋白合成酶的活性。碳水化合物是昆虫重要的能源物质，是维持其生命活动所需能量的主要来源^[22]，研究表明，当舞毒蛾受到阿维·杀铃脲复合剂胁迫时，体内碳水化合物含量会有所下降^[23]；与本研究结果一致，说明重金属胁迫可以抑制碳水化合物的转化，使昆虫正常的生命活动受到影响。海藻糖是昆虫体内主要的糖类，脂质是其主要的储能物质，研究表明，用添加了Cd²⁺的人工饲料饲养舞毒蛾幼虫后，其组织和淋巴中的储能物质海藻糖、糖原和脂质含量显著下降^[24]；与本实验结果相一致，因此我们可以推测出舞毒蛾幼虫为了缓解重金属胁迫带来的不良影响，可能会激发海藻糖酶和脂肪酶的活性，促使海藻糖分解为葡萄糖，脂质转化为脂肪酸和甘油，为维持其正常的生长发育提供更多能量。总抗氧化力是用于评价机体抗氧化系统功能状况的综合性指标。它的大小可以从总体上反映机体防御体系抗氧化能力的高低^[25]。研究表明，高浓度的Cd²⁺和Po²⁺胁迫会导致果蝇体内的总抗氧化力T-AOC，以及SOD和CAT的活性表现为抑制现象，且与胁迫的重金属浓度相关^[26]。本研究中发现舞毒蛾幼虫在重金属Mn²⁺和Co²⁺的胁迫作用下总抗氧化力显著提高。其可能的原因是试验浓度下Mn²⁺和Co²⁺毒力并未超过舞毒蛾4龄幼虫抗氧化系统的承受能力，促使舞毒蛾幼虫分泌各种抗氧化物质和抗氧化酶，从而提高它总抗氧力，以维持其正常生长发育。而高浓度的Cd²⁺和Po²⁺会导致果蝇的抗氧化系统破坏。说明昆虫抗氧化系统抵御氧化胁迫的能力是有限的，低剂量的重金属可以诱导虫体抗氧化基因的表达，高剂量重金属的持续胁迫则会造成抗氧化系统的破坏^[27]。

重金属Mn²⁺和Co²⁺对舞毒蛾幼虫体质量、营养取食量、排便量、可溶性蛋白含量、碳水化合物含量、海藻糖含量、脂质含量均有显著的抑制作用，但对总抗氧化力有显著的促进作用。说明舞毒蛾幼虫主要通过提高自身抗氧化力的来应对重金属的胁迫，同时也提高自身对重金属的抗性。