Genetic Diversity Analysis of Cotoneaster buxifolius in Yunnan Province Based on Phenotype Characters and ISSR Marker

对云南省内7个州市15个县区市的51个野生黄杨叶栒子居群进行了调查和表型性状的观测，采集各居群叶片并用硅胶干燥于自封口袋中，编号后保存于−80 ℃冰箱，用于ISSR分子标记试验。各居群的产地、代码、纬度、经度和海拔等信息见表1。

观测了51个野生黄杨叶栒子居群的枝条颜色和夹角及毛被情况、叶片的形态及毛被情况、花朵的数量、花瓣的形状和颜色，将采集的果实带回实验室后观测果实的颜色、形状及大小、萼筒毛被情况、萼裂片形状及毛被情况、每果小核数，共计观测了33个表型性状。

采用改良CTAB法提取黄杨叶栒子各样品的叶片总DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，用紫外分光光度法测定DNA浓度，达到ISSR分子标记要求的DNA保存于-20 ℃冰箱备用^[11-13]。对DNA质量检测，有27个居群达到后续分析的要求。从100条ISSR引物中筛选出24条适于黄杨叶栒子扩增的引物，用优化后的反应体系（25 μL反应体系中含2.5 mmol·L⁻¹ Mg²⁺、2U Taq DNA聚合酶、0.15 mmol·L⁻¹ dNTPs、0.48 mol·L⁻¹引物和100 ng模板DNA）对黄杨叶栒子的DNA模板进行扩增，程序如下：95 ℃预变性5 min，1个循环；94 ℃变性1 min，退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，进行38个循环；最后72 ℃延伸10 min。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并拍摄照片，根据有带为1、无带为0的原则对重复性好且清晰易辨的条带进行统计，获得27个居群的24条引物的“0，1”ISSR数据矩阵。

对表型性状中的质量性状进行赋值后参与聚类运算；对数量性状则直接用SPSS 16.0软件进行平均值、标准差、标准误的计算和方差分析，进而计算出各性状的变异系数和相对极差。依据33个表型性状的欧氏平方距离系数，用UPGMA法构建基于表型性状的树系图。

依据获得的27个居群的24条引物的ISSR数据计算各引物的总条带数、多态性条带数和多态性百分率；应用SPSS 16.0软件，根据欧氏平方距离系数，用UPGMA法构建基于ISSR标记的27个黄杨叶栒子居群的树系图。采用POPGEN 32软件计算滇西北群体（DXB）、宣威群体（XW）、嵩明群体（SM）、石林群体（SL）、昆明群体（KM）和会泽群体（HZ）等6个产区的黄杨叶栒子居群的多态性位点百分比（PPB）、观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Nei’s基因多样性指数（H）、Shannon信息指数（I）和遗传多样性指数（Ht）。

各黄杨叶栒子居群的枝条颜色全部为棕褐色；所有小枝都被糙伏毛；二级枝条与主枝之间的夹角为80.07°~37.67°，平均为42.4°，平均变异系数为16.53%；叶片长度为0.6~1.83 cm，叶片宽度为0.37~1.26 cm，二者变异系数分别为23.19%和28.78%；叶片质地纸质占100%；叶片形状为卵形；叶基形状98.04%为近圆形，还有1.96%为宽楔形；叶尖形状有98.04%为锐尖，有1.96%为钝尖；叶片正面98.04%有毛，有1.96%为幼时有毛；叶片正面都疏被白色绒毛；叶片背面都疏被灰白色绒毛；100%花序具有1朵以上的花；花朵颜色全部为白色；果实均为红色钟状果；萼筒全部密疏绒毛；果实纵径为5.48~8.29 mm，果实的横径为5.37~7.76 mm，变异系数分别为18.00%和17.34%；果实萼裂片形状变异相对较大，变异系数为69.02%，其中，尖三角形占54.90%，宽三角形间隔缝大占33.33%，宽三角形占9.8%，几乎不开裂占1.96%；果实萼裂片中94.12%被毛，其中，66.67%是被密绒毛，而33.33%被疏绒毛，其变异系数达35.17%；26.56%的果实包含1个小核，39.06%的果实包含2个小核，28.91%的果实包含3小核，4.69%的果实包含4小核，只有0.78%的果实含5小核。

依据33个表型性状的51个野生黄杨叶栒子居群的UPGMA树系图见图1。各居群之间的距离在25阈值内，51个样本在遗传距离系数25处可以划分为2个类群，其中，类群II包括了3个居群，二级枝条与主枝之间的夹角为78°~80°，叶片长度为0.9~1.0 cm，叶片宽度为0.5~ 0.55 cm，属于所有居群中夹角最大的一组；类群I中，在遗传距离系数为10处可以分为I-1和I-2两个分支，其中，I-2分支中包括了21个居群，二级枝条与主枝之间的夹角多数为62°~68°，居群分布海拔在1 900~2 500 m；I-1类群中，在遗传距离系数8处分为I-1-1和I-1-2两个分支，分别包括了26个和1个居群。I-1-1分支中，一个小分支夹角基本为53°~57°，另一小分支则保持在42°~49°；I-1-2分支中仅有1个来自昆明居群的栒子，其夹角最小（37°）。从图1可看出：51个黄杨叶栒子居群间的亲缘关系，多数地理位置或者海拔相近的居群能够聚在同一分支，但有些同一产地的不同居群却分布在不同的分支中。

Figure 1.  UPGMA dendrogram of 51 C. buxifolius resources based on the phenotypic traits

24条ISSR引物对27个黄杨叶栒子居群共扩增出228条带，其中，多态性条带有153条，每条引物扩增得到的总条带数为5~14，平均9.50条；多态性条带数为3~13，平均6.38条；多态百分率为58.33%~100.00%，多态百分率达81.56%（表2）。

将采自滇西北、宣威、嵩明、石林、昆明、会泽地区的27个居群按产区进行归类后用PopGene 32 软件分析，得表3。6个产区平均扩增出151.67多态性位点，多态性位点比率达到66.52%，其中，嵩明产区多态性位点最多，达170，多态性位点比率达74.56%；会泽产区的多态性位点最少，只有122，比率53.51%。群体间平均Nei`s遗传多样性指数为0.413 2，Shannon多样性指数为0.595 9，群体内多态性位点比率为53.51~74.56%。Nei`s遗传多样性指数（H）为0.156 2~0.432 5，平均为0.352 0；Shannon多样性指数（I）为0.216 6~0.621 2，平均0.505 9。6个产地中，HZ群体（H=0.156 2，I=0.216 6）的遗传多样性水平最低，KM群体（H=0.432 5，I=0.621 2）的遗传多样性水平最高。Nei`s遗传多样性指数、Shannon多样性指数和多态性位点比率3个指标所表现的多样性趋势基本一致，6个群体遗传多样性由高到低依次为:KM群体 >XW群体 > SL群体 >SM群体>DXB群体>HZ群体。经计算可知，遗传多样性指数（Ht）为0.413 2±0.011 0。XW群体与KM群体的遗传距离最大（0.980 8），XW群体与DXB群体遗传距离相对较近（0.330 2）；XW群体与KM群体遗传一致度最低（0.375 0），XW群体与DXB群体遗传一致度最高（0.718 8）。其余遗传一致度基本在0.48左右，4个群体间的遗传一致度变幅为0.375 0~0.718 8。

用SPSS 16.0软件计算27个黄杨叶栒子居群间的欧氏平方距离系数，采用 UPGMA 聚类方法，得到27个黄杨叶栒子居群的聚类树系图（图2）。从图2可以看出：以距离系数23为界，可以将27个居群划分为3大分支：分支I包含13个居群，又可进一步细分为昆明、嵩明组（I－1），5个居群基本分布在海拔2 050 m左右，石林等组（I－2）6个居群分布在海拔1 950~2 100 m；分支II包含3个居群，包括了全部来自滇西北的居群；分支III包含11个居群，可进一步细分为昆明、宣威等组（III－1），包括了9个居群，昆明与会泽（III－2、III-3）2个分支，各自包括1个居群，其均分布在海拔2 400 m的地区。

Figure 2.  UPGMA dendrogram of 27 C. buxifolius resources based on the ISSR marker

表型性状是种质资源遗传多样性的一种表现方式，与分子标记有着同等重要的作用，同时也是育种和种质保护研究的基础工作^[14-15]。本研究选取33个表型性状，对51个野生黄杨叶栒子居群的遗传多样性进行了分析，发现有22个性状均表现出不同程度的变异，且变异主要存在于居群之间，变异系数较大的性状有萼裂片形状（69.02%）、萼裂片毛被情况（35.71%）、叶片宽度（28.78%）、叶片长度（23.19%）等，说明黄杨叶栒子居群间在果实萼裂片和叶片形态上存在较大的差异，大于野生玫瑰（18.48%）^[16]、假俭草（25.59%）^[17]、垂珠花（22.64%）^[18]，但这些差异均没有准噶尔山楂（86.10%）^[19]的大。

ISSR分子标记可以产生丰富的多态位点，从而揭示种间、种内遗传变异情况^[4]。本文利用ISSR分子标记对27个野生黄杨叶栒子居群进行遗传多样性分析，发现多态百分率达81.56%，说明云南的黄杨叶栒子资源存在较丰富的遗传多样性，其丰富程度与枣庄石榴（82.86%）^[7]相近，但不如大别山区的白檀（92.62%）^[20]和杜鹃花（98.94%）^[21]高。

本文用33个表型性状构建了51个黄杨叶栒子居群的树系图（图1），用24个ISSR引物的228条条带构建了27个黄杨叶栒子居群的树系图（图2）。2张图对比分析可知：在ISSR聚类图中I-1分支中的5个居群，有3个居群（SM1、SM2、KM8）在表型性状聚类图中都属于I-1-1这个分支，表型性状和ISSR分子标记所得结果都表明这3个居群的亲缘关系近；而其中的KM3居群在表型性状图中属于I-2分支，2种聚类方法结果不一致。分析此现象出现的原因：一是黄杨叶栒子居群间的亲缘关系与地理位置密切相关，分布在同一地区的各个居群多数能聚在一起，如昆明群体、滇西北群体、石林群体和会泽群体的部分材料可分别聚为一类，说明分布位置的隔离促进了黄杨叶栒子居群间的遗传分化^[22-23]；二是个别居群未能与同一产区的其他居群聚在一起，而聚进了其他产区的居群之中，其原因可能是同一产区内各居群的小生境不完全相同，在不同产区内也有相似的小生境，生境的不同导致不同居群间发生遗传分化和趋同进化。在材料采集时发现，虽然有些居群采集自同一产地，但它们的生境(土壤、水分、坡度、坡向、光照、海拔高度、伴生植物等)各不相同；但有些居群虽然采自不同的产地，但却拥有极为相似的生境，导致黄杨叶栒子呈现地域性趋同进化^[24]。

正如沙棘，由于其分布区广泛,分布区内气候、土壤和海拔等生态因子的差异，地理隔离促进其高度种群遗传分化，形成11亚种^{[1, 25]}。地理隔离是物种间基因交流的天然屏障，也是影响居群间遗传分化的重要因素^[26]。在聚类分析中，昆明群体（I-1分支中3个居群和III-1亚分支中3个居群）、石林群体（I-2亚分支中6个居群）、滇西北群体（II分支中3个居群）可分别聚为一类。昆明群体和石林群体的栒子分布于滇中盆地区域，但2个地区相距70 km，受虫媒和鸟媒飞行距离的影响，依靠其在居群间传播花粉的能力必定受到地理距离的限制^[27]，空间隔离是居群间遗传分化的因素；而滇西北群体则分布在三江并流区域，群体间在地理分布上有横断山脉阻隔，使得物种区域分布的山脉阻隔特点突出，对黄杨叶栒子不同的居群具有天然的隔离作用，山脉阻隔严重影响了居群间花粉及种子散布，也使居群之间的基因交流受到了一定程度的阻碍^[28]，是引起居群间遗传分化的重要因素。

表型性状是植物的外部特征，标记数量少，且受到生境、生长状况和时期等方面因素的影响，利用受限。表型性状与ISSR分子标记所提供的DNA片段信息相结合，可以揭示黄杨叶栒子遗传的本质特征。同时通过遗传聚类了解栒子遗传变异在地理上的分布格局，对于制定科学的保护策略起着极为重要的作用。上述黄杨叶栒子遗传多样性分析将为今后黄杨叶栒子种质资源分类、起源、保存和利用奠定基础。

本研究表明：滇产黄杨叶栒子表型性状和分子遗传多样性丰富。根据分子标记聚类结果可以将27个居群分为3个分支。黄杨叶栒子居群间的亲缘关系及分布与地理位置、海拔位置有密切关系。