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竹子是我国最具价值的森林资源之一,在保障生态安全、木材安全等方面均发挥着重要作用。竹材优良的材性,是由竹子生长遗传和环境共同决定的,不同竹种及同一竹种不同产地的竹材材性存在着较大差异[1-3]。虽然竹材材性不同程度地受到不同抚育垦复措施[4]、施肥[5-6]、钩稍[7]等栽培措施的影响,但遗传差异是决定材性的主要内在因素。木质素含量是影响木材材性的重要因素,木质素生物合成涉及多种结构基因、调节基因和miRNA[8-10]。人们已经从遗传角度来研究竹子的材性特征,并开始借助分子生物学手段研究竹材材性的生物合成调控,如参与竹子木质素生物合成的基因CoCOMT[11]、PePAL1[12]、C4H[13]和PeLAC[14]等,参与纤维素合成的PeCesA1~7[15],参与木聚糖合成的PeIRX9和PeIRX10[16]等。虽然对这些基因仅是初步研究,但对认识竹子木质素的生物合成以及竹材材性的遗传调控分子机制具有重要意义。
肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)是木质素合成的特异途径中的关键酶之一,该酶以3种羟基桂酸的辅酶A酯(香豆酰辅酶A、阿魏酰辅酶A、芥子酰辅酶A)作为底物,催化生成相应的肉桂醛,在木质素生物合成中起主导作用[17]。关于CCR基因及其编码蛋白的研究,已在拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)、水稻(Oryza sativa L.)、小麦(Triticum aestivum L.)和玉米(Zea mays L.)等多种植物中开展[18];而对竹子CCR基因的研究仅有2例报道,即从七彩红竹(Indosasa hispida M. cv. Rainbow)克隆了IhCCR-1[19]和从巴拉圭瓜多竹(Guadua paraguayanan)中得到了GpCCR基因,并研究了GpCCR在不同组织中的表达模式[20]。然而,对于竹子CCR基因功能研究尚未得到深入开展。本研究以毛竹(Phyllostachys edulis (Carrière) J. Houz.)为研究对象,克隆PeCCR基因,利用实时定量PCR技术对其在不同组织中以及不同高度笋中的表达情况进行了分析,并利用在拟南芥异位表达的方法对其功能进行了初步研究,以期为揭示CCR基因在竹子木质素生物合成中的功能以及对竹材材性形成的影响提供理论依据。
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本研究以毛竹为对象,分别以实生苗(0.5 a)和野外毛竹为材料,其中,前者是用购买自广西桂林的毛竹种子在实验室条件下播种培养(培养基质为腐殖土∶蛭石=6∶4,温度≈25℃,光照强度≈300 μmol·m−2·s−1)的毛竹,取不同组织样品用于基因表达组织特异性分析;后者是直接采取江西南昌(28°45'58'' N,115°45'39'' E,海拔399.0 m)野外生长的毛竹,选取不同发育阶段的竹笋(0.2、1.0、3.0、6.7 m),取笋基部(生根节的上部约1 cm处切取竹壁,约1 cm×1 cm)为样品,一部分用FAA固定液固定,用于切片观察;另一部分用液氮淬冻处理后用干冰运回实验室,存放于-80℃冰箱,用于RNA提取。
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取上述经FAA固定液固定的毛竹笋样品,按照文献[21]方法,用聚乙二醇( PEG)将材料固定,制作切片(厚度10~15 μm),用0.05%的甲苯胺蓝O (TBO)染液染色后镜检观察,拍照记录。
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将上述所取毛竹实生苗不同组织样品和野外毛竹笋的样品,在液氮中研磨成粉末,采用Trizol试剂,按照文献[22]方法提取各样品的总RNA,按照反转录试剂盒操作说明书(Promega公司)合成cDNA,存−20℃用于基因表达模式分析和克隆。
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根据毛竹CCR基因(PH01001334G0240)序列设计定量引物qPeCCR-F和qPeCCR-R(表1)。以毛竹PeNTB作为内参基因[23],分别以毛竹实生苗不同组织样品和野外毛竹笋不同样品的cDNA为模板,进行PeCCR基因表达的定量分析。采用Roche Light Cycler®480 SYBR Green I Master试剂盒在耶拿公司QTower仪器上进行qRT-PCR实验,反应体系(10 μL)为:5.0 μL的2×SYBR Green I Mastermix,0.8 μL cDNA,正向引物和反向引物各0.2 μL(10 μmol·L−1),加ddH2O至反应总体积为10.0 μL。qPCR程序:95℃10 min;95℃ 10 s;60℃10 s;共40个循环。并应用2−△△Ct算法[24]分析实验结果。另外,利用前期本实验室毛竹叶、早花期花序、晚花期花序、地下茎、根、笋20 cm及笋50 cm等7个不同组织的转录组数据[25],分析PeCCR在不同组织中的表达情况。
引物名称 Primer name 引物序列 (5′~3′) Primer sequence (5′~3′) 用途 Application qPeCCR-F TCGTCCATCGGCACAGTGTAC PeCCR定量表达分析 qPeCCR-R CCGTCTTAGCGTAGCAGTACCAG PeCCR quantitative analysis PeNTB-F TCTTGTTTGACACCGAAGAGGAG 毛竹内参基因扩增 PeNTB-R AATAGCTGTCCCTGGAGGAGTTT Amplification of internal reference gene in moso bamboo PeCCR-F ATGCCGATCGAGACAGCCGT 编码区克隆、半定量分析 PeCCR-R TCACGAGGTGATGAGATTGTCGTG Coding region cloning and semi-quantitative analysis PeCCR-F1 CGGGATCCATGCCGATCGAGACAGCCGT 表达载体构建 PeCCR-R1 GCTCTAGATTACGAGGTGATGAGAATGTCGTG Expression vector construction AtUbiquitin-F ATGGCTGAAGAGGATATCCAGC 拟南芥内参基因扩增 AtUbiquitin-R GAAACACTTCATATGGACGATGG Amplification of internal reference gene in Arabidopsis Table 1. Primers used in PCR
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根据PeCCR序列(PH01001334G0240)的编码区序列和植物表达载体pC1301-35S-OCS [26]的多克隆位点,设计基因克隆引物(PeCCR-F和PeCCR-R)和添加酶切位点(BamHⅠ和XbaⅠ)的载体构建引物(PeCCR-F1和PeCCR-R1)(表1)。以毛竹笋cDNA为模板,用PeCCR-F和PeCCR-R扩增,获得编码区的片段。经测序验证正确后,以测序正确的质粒为模板用PeCCR-F1和PeCCR-R1扩增,采用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切将PeCCR1连接到植物表达载体pC1301-35S-OCS的多克隆位点,形成植物过量表达载体。
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将过量表达载体pC1301-35S-PeCCR-OCS质粒转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens Smith & Townsend)菌株GV3101中,培养并获得阳性克隆菌株。经菌液PCR验证正确后,对单克隆阳性菌株进行培养,按照蘸花法[27]转化模式植物拟南芥(Col-0),并收获种子(T0代)。用潮霉素(Hyg, 50 µg·mL−1)对T0代种子进行筛选,获得抗性植株并用PCR进行检测验证,继续用潮霉素筛选至纯合的转基因植株作为后续实验的材料。采用半定量RT-PCR方法验证在转基因拟南芥中的表达情况,同时以拟南AtUbiquitin (NM180850)为内参基因[28]。
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播种纯合的转基因拟南芥株系,直接观察植株生长的表型变化。取生长6周的植株基部莲座叶以上2 cm的拟南芥茎,用7%琼脂固定后,进行切片制作(厚度约40 μm),经用0.05%的TBO染色后制作临时切片,观察拟南芥茎中木质素的情况。
另外,取基部莲座叶以上3 cm的拟南芥茎,用溴乙酰法测定其中木质素的含量,参照齐一生物科技(上海)有限公司的木质素含量检测试剂盒(货号:QYS-237008)说明书进行,同时以同期的野生型拟南芥作为对照。按照以下公式计算木质素含量(mg·g-1):
式中:ΔA为测定管OD280值−空白管OD280值;V反总为反应总体积2.04 mL;W为样本质量;T为稀释倍数。