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弗吉尼亚栎(Quercus virginiana Mill)原产美国,为壳斗科(Fagaceae)栎属(Quercus L.)常绿高大乔木,分布于美国东南沿海。弗吉尼亚栎是沿海森林植被群落中的优势树种,其根系深而发达,具有很强的抗风能力,能抵御飓风和暴雨的袭击,耐短期水涝;还耐干旱、高浓度盐雾和土壤盐分,病虫害较少,是难得的沿海防护林优良树种[1-2]。又因其四季常青,树冠开阔,也可作为良好的行道遮阴树种和园林绿化树种。
弗吉尼亚栎于2001年首次引入我国,在浙江富阳、上虞、慈溪、海宁和上海、江苏等地海涂试种,都表现出良好的适应性[3-4]。目前,国内弗吉尼亚栎苗木大多依靠种子繁殖,由于种子变异大[5],实生苗在生长速度、株形、叶形等方面具有很大差异,导致苗木质量参差不齐,严重制约生产推广。同时,弗吉尼亚栎种子没有休眠期,只要条件合适即可萌发,不耐储存,且存在象甲及动物取食的影响,种子产量极不稳定。无性繁殖对控制弗吉尼亚栎苗木质量及苗木快繁具有重要意义。研究报道,弗吉尼亚栎通过扦插繁殖,可达70%~80%的生根率[6-7],但依然存在生根率不稳定、难以规模化生产等问题。因此,有必要进一步探索、完善弗吉尼亚栎无性繁殖技术,尤其组织培养研究。
栎类树种组织培养研究始于20世纪80年代末,随着组织培养技术的发展,通过体细胞胚发生和芽再生的方法已实现多种栎树植株再生,培养成功的栎树已近30个种[8],包括欧洲夏栎(Q. robur L.)[9-10]、欧洲栓皮栎(Q. suber L.)[11-12]、冬青栎(Q. ilex L.)[13]、北美红栎(Q. rubra L.)[14]、麻栎(Q. acutissima Carruth.)[15]以及高山栎(Q. semecarpifolia Sm.)[8]等。近年来,国内在大叶栎(Castanopsis fissa (Champ. ex Benth.) Rehd. et Wils.) [16]、辽东栎(Q. liaotungensis Koidz.)[17]、蒙古栎(Q. mongolica Fisch. ex Ledeb)[18]等栎树组织培养上也取得一些突破。弗吉尼亚栎引种以来,国内针对育苗技术、繁殖技术以及对生态因子的响应等方面展开了大量研究[19-22]。培育弗吉尼亚栎无性系苗是当前该树种生产过程中的一大难题,虽然已有试验以扦插繁殖进行无性系选育[6-7],但至今没有应用到生产实践中。本研究以弗吉尼亚栎茎段为外植体,通过不定芽增殖途径,探索弗吉尼亚栎组织培养过程中外植体防褐化措施、不同种类激素及激素配比对不定芽增殖和生根的影响,以期建立弗吉尼亚栎试管苗再生体系,为弗吉尼亚栎无性系选育提供技术支撑。
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由表1可以看出:3.00、5.00 g·L−1活性炭处理对防止弗吉尼亚栎外植体褐化效果最好,但5.00 g·L−1的活性炭中芽生长的启动时间延长,因此,在培养基中添加3.00 g·L−1的活性炭可有效防止褐化。另外,发现多次反复接种也可以有效防止褐化。外植体第一次接种后,培养3 d,转接到相同培养基,如此转接3次,褐化基本不会发生。
处理
Treatments质量浓度Mass
concentration/
(g·L−1)芽启动时间
Initial time
for buds/d目测褐化发生
半径Browning
diameter/cm对照CK 0.00 14.25±0.96 d 1.83±0.24 a 抗坏血酸
Ascorbic acid2.50 16.75±0.96 bc 1.15±0.24 b 5.00 16.00±0.82 bcd 0.58±0.10 c 硫代硫酸钠
Sodium thiosulfate1.00 17.50±1.29 b 1.08±0.10 b 2.00 16.00±0.82 bcd 0.58±0.10 c 活性炭
Activated carbon1.00 15.25±0.50 cd 0.65±0.13 c 3.00 16.25±0.50 bcd 0.20±0.14 d 5.00 20.00±0.82 a 0.13±0.10 d 注:表中数据为平均值±标准差,不同小写字母表示不同处理间差异显著(p<0.05)。下同。
Note: Data were presented as means±SD, Different lowercase letters in the same column represent significant difference at 0. 05 level. The same as below.Table 1. Effects of anti-browning agents with different concentration on browning of explants and the initial time for buds
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试验发现:在添加不同质量浓度激素的MS、1/4MS和WPM培养基中,弗吉尼亚栎茎段均能生长,但在MS培养基中,外植体褐化较严重,在低盐的1/4MS和WPM培养基中,褐化较轻(表2)。
基本培养基
Medium平均芽长
Average bud
length/cm平均芽数
Average bud number /
(个·外植体−1)褐化状况
BrowningMS 2.79±0.16 c 3.10±0.99 b +++ 1/4MS 3.49±0.27 b 4.30±0.82 a + WPM 4.17±0.31 a 4.20±0.79 a + Table 2. Growth difference of stem segments of Q. virginiana on different primary media
从表3可以看出:在供试的33种培养基中,5号、20号、21号培养基对弗吉尼亚栎丛芽发生具有促进作用,特别是5号配方,茎段在该培养基中丛芽发生最多,增殖倍数达6.60,且丛芽生长状态良好。21号培养基虽然增殖倍数也较高,但增殖的芽纤弱,且部分叶片没有展开。
编号
Number基本培养基
Basal medium质量浓度 Mass concentration/(mg·L−1) 增殖倍数
Proliferation rate生长状况
Growth description6-BA NAA IAA 1 MS 1.00 0 0 0.16±0.05 k 茎段维持绿色,基部褐变Green stem, but basal browning 2 1.20 0 0 0.64±0.05 k 茎段维持绿色,基部褐变,部分腋芽增殖
Green stem, but basal browning, partially proliferation of axillary buds3 1.50 0 0 0.34±0.07 k 茎段维持绿色,基部褐变,部分腋芽增殖
Green stem, but basal browning, partially proliferation of axillary buds4 1/4MS 1.00 0 0 0.30±0.10 k 茎段绿色,无明显变化Green stem, no obvious change 5 1.20 0 0 6.60±1.39 a 茎段绿色,丛芽较多,芽健壮Green stem, more multiple shoots, strong shoots 6 1.50 0 0 0.22±0.11 k 茎段绿色,无明显变化,部分腋芽增殖
Green stem, partially proliferation of axillary buds7 1.00 0.10 0 0.28±0.07 k 茎段绿色,腋芽伸长Green stem, elongation in axillary buds 8 1.20 0.10 0 3.75±0.46 cd 基部膨大,有丛芽发生,芽健壮
Basal expanding, multiple shoots occur, strong shoots9 1.50 0.10 0 0.76±0.28 jk 茎段绿色,腋芽生长不明显Green stem, no obvious growth of axillary buds 10 1.00 0.20 0 2.27±1.00 fgh 基部膨大,部分有丛芽发生,芽健壮Basal expanding, multiple shoots occur, strong shoots 11 1.20 0.20 0 1.70±0.55 hij 基部膨大,部分有丛芽发生Basal expanding, multiple shoots occur partially 12 1.50 0.20 0 4.18±0.90 bc 基部膨大,有丛芽发生Basal expanding, multiple shoots occur 13 1.00 0 0.30 2.60±0.54 efgh 茎段维持绿色,丛芽少Green stem, less multiple shoots 14 1.20 0 0.30 1.74±1.08 hij 茎段维持绿色,丛芽少Green stem, less multiple shoots 15 1.50 0 0.30 3.34±0.58 cde 茎段有生长,有丛芽发生Growth in stem, multiple shoots occur 16 1.00 0 0.50 1.96±0.33 ghi 有丛芽发生,但叶片卷曲Multiple shoots occur, curl leaves 17 1.20 0 0.50 3.16±0.70 def 丛芽较多,叶片纤细More shoots, long and thin leaves 18 1.50 0 0.50 2.91±0.34 defg 丛芽较多,叶片纤细More shoots, long and thin leaves 19 WPM 1.00 0 0 3.42±1.78 cde 基部膨大,丛芽较少Basal expanding, less multiple shoots 20 1.20 0 0 5.03±0.18 b 丛芽较多,叶片展开More shoots, expanding leaves 21 1.50 0 0 6.10±0.77 a 丛芽增殖多,但芽纤细More shoots proliferation, long and thin shoots 22 1.00 0.10 0 0.42±0.10 k 丛芽较少,基部有愈伤Less shoots, basal callus 23 1.20 0.10 0 2.95±0.28 defg 丛芽较少,基部有愈伤组织发生Less multiple shoots, basal callus 24 1.50 0.10 0 2.23±0.19 fgh 丛芽发生,较少Less multiple shoots 25 1.00 0.20 0 1.82±0.34 hi 部分有丛芽,但基部愈伤组织较多Multiple shoots occur, more basal callus 26 1.20 0.20 0 1.69±0.34 hij 部分有丛芽,但基部愈伤组织较多Multiple shoots occur, more basal callus 27 1.50 0.20 0 4.17±0.17 bc 丛芽较多,但叶未展开More multiple shoots, non-expanding leaves 28 1.00 0 0.30 2.85±0.44 defg 有丛芽,芽细长Multiple shoots occur, long and thin shoots 29 1.20 0 0.30 0.36±0.14 k 丛芽少,芽细长Multiple shoots occur, long and thin shoots 30 1.50 0 0.30 1.06±0.13 ijk 丛芽少,芽细长,叶片未展开
Multiple shoots occur, long and thin shoots, nonexpandingleaves31 1.00 0 0.50 4.15±0.36 bc 丛芽较多,叶片纤细More shoots, long and thin leaves 32 1.20 0 0.50 3.61±0.54 cd 丛芽较多,芽健壮More shoots, strong shoots 33 1.50 0 0.50 2.53±0.61 efgh 丛芽较多,芽较健壮,但基部有愈伤More shoots, strong shoots, but basal callus occur Table 3. Effects of different types and proportion of hormones combination on the development and growth of cluster buds of Q. virginana stem segments
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由表4可以看出:生根培养20 d 时,单独添加IBA或NAA均导致弗吉尼亚栎丛芽基部愈伤化,虽然部分丛芽也有根的发生,但生根率极低,最高也仅3.33%。在本试验中,生根率最高的激素配比是0.50 mg·L−1IBA+0.50 mg·L−1NAA,该培养基中丛芽的生根率可达53.33%,且每株芽的平均根数达到6条,同时在该培养基中发生的根系状态也与其它不同,该培养基中的根较粗壮,且木质化程度较高。另外,发现在IBA质量浓度不变情况下,提高NAA质量浓度不利于弗吉尼亚栎的生根。
编号
Number基本培养基
Basal
medium质量浓度Mass
concentration/
(mg·L−1)生根率
Rooting rate/%平均根数
Average root
number/(条
·株 −1)平均根长
Average root
length/cm生长状况
Growth descriptionIBA NAA 1 1/4 MS 0.50 0.67 d 0.67 g 0.57 cde 基部愈伤化,偶有根发生Basal callus, occasional roots 2 0.80 1.33 d 1.33 ef 0.37 de 基部愈伤化,偶有根发生Basal callus, occasional roots 3 1.00 1.33 d 0.67 g 0.37 基部愈伤化,偶有根发生Basal callus, occasional roots 4 0.50 3.33 d 1.00 fg 0.57 cd 基部愈伤化,偶有根发生Basal callus, occasional roots 5 1.00 0.00 d 0.00 g 0.00 e 基部愈伤化,无根发生Basal callus, no root 6 1.50 1.33 d 1.00 fg 0.10 e 基部愈伤化,偶有根发生Basal callus, occasional roots 7 0.50 0.50 53.33 a 6.00 a 2.53 a 基部愈伤不明显,根系健壮,木质化程度高,有根毛
No obvious callus in the base, strong roots, high lignification,
root hair occurring8 0.50 1.00 38.00 b 4.00 bc 1.67 ab 基部有愈伤,根细长Basal callus and fine roots 9 0.50 1.50 40.67 ab 2.33 def 1.40 bcd 基部愈伤少,根细长,轻微木质化,根毛少
Less callus, less lignification, fine roots, less root hair10 1.00 0.50 28.67 bc 4.33 b 1.63 ab 根部愈伤组织少,根细长Less callus, fine roots 11 1.00 1.00 8.67 d 3.67 bcd 0.70 bcd 基部有愈伤,根粗短,无根毛
Basal callus, short and thick roots, no root hair12 1.00 1.50 22.00 c 2.67 cde 1.43 bc 基部愈伤组织少,根细长Less callus, fine roots 注:表中数据为2016年5月、7月和10月共3次试验生根情况的平均值。
Note: Data were presented as means for three repeated experiments conducted in May, July, and October, 2016.Table 4. Effects of different proportions of hormone combination on root development of cluster buds in Q. virginiana
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对形成木质化根的弗吉尼亚栎试管苗进行炼苗移植。首先将培养容器盖打开,放在培养室中进行3~5 d炼苗,然后将试管苗取出,以灭菌河沙为介质进行移植,放于大棚中培养。2016—2018年,共计移苗61株,平均成活率57.78%,其中,2017年5月移植的试管苗成活率达83.33%以上。通过对试管苗移植的观察,其成活率与叶片的数量和大小有关,叶片较多的试管苗更易成活,推测可能是由于叶片数量多,使光合产物增多,从而提高了试管苗的活力。
弗吉尼亚栎试管苗移植的成功说明通过不定芽增殖途径获得试管苗的技术体系是可行的,因此,基于组织培养中外植体防褐化措施、不定芽增殖和丛芽生根等过程影响因子的选择和优化,建立弗吉尼亚栎试管苗再生体系,具体流程见图1。
Study on the Factors Affecting Adventitious Shoots Proliferation and in vitro Regeneration of Quercus virginiana
- Received Date: 2019-05-08
- Accepted Date: 2019-12-16
- Available Online: 2020-03-01
Abstract: