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杨树是林木遗传研究的模式树种[1],是北半球种植面积最广,适应性最强的落叶阔叶树种[2],在我国生态建设中发挥着巨大的作用。近年来,我国杨树转基因已取得重大进展,主要集中在其重要的经济及生态价值的基因功能研究上。小黑杨(Populus simonii×P. nigra)是小叶杨(Populus simonii Carr)与欧洲黑杨(Populus nigra L.)的杂交品种,其生长迅速、抗寒、抗旱性强,生态潜力巨大,在中国北方得到了广泛种植[3]。近年来,对于小黑杨的研究主要集中在利用转基因技术来增强抗病性[4]、抗虫性[5]、耐盐性[6-7]以及基因功能的研究[8-9]等方面,利用蛋白质组学对小黑杨进行研究的报道相对较少。然而,蛋白质作为生命活动的主要承担者[10],执行大多数的生物功能,通过蛋白质组学的研究可以获取在遗传层面无法获得的信息,因此,进行蛋白质组学的研究具有很高的价值。
蛋白质组学的概念最初是由澳大利亚科学家Wilkins等[11]提出的,蛋白质组学研究中最常用的技术之一是双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)[12],双向电泳技术与质谱技术相结合,已成为蛋白质组学中分离蛋白质的有效方法[13]。双向电泳技术已经被广泛应用于植物的蛋白质组学研究中,如Romeo等[14]通过双向电泳技术分析意大利杨根部响应锌胁迫的关键因素,Liu等[15]利用双向电泳技术分析了毛果杨早期茎从初生生长到次生生长的蛋白质组学的变化。尽管双向电泳体系优化已有广泛研究,但由于植物的生物学特性、生理生化特性不尽相同,对于不同植物物种,最适的电泳条件不同[16]。因此,必须针对植物的不同特点进行双向电泳体系的优化以进行蛋白质组学的研究。杨树叶片富含色素、多酚、多糖、有机酸等次生代谢物质,对电泳过程干扰很大,导致双向电泳图谱背景高、蛋白质不清晰,从而使杨树叶片双向电泳技术和蛋白质组学的研究受到很大的限制。因此,在进行杨树叶片蛋白质组学的研究之前,对杨树叶片蛋白质的双向电泳体系进行优化是十分重要的。
目前,关于杨树叶片蛋白质双向电泳体系优化相关的研究尚未见报道。本研究以小黑杨叶片为材料,对双向电泳技术中的主要影响因素进行探讨,探究出了适用于小黑杨叶片蛋白质组学研究的双向电泳体系;该体系同样适用于大青杨与84 K杨叶片的蛋白质双向电泳,因此,该双向电泳体系可用于杨树叶片蛋白质组学的分析,并为其他木本植物叶片的蛋白质组学的研究提供参考资料。
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本实验以东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室温室内种植的小黑杨、大青杨和84 K杨为材料。从植株上剪下长20.0 cm,径0.5~1.0 cm的枝条,并将枝条插入装有草炭土、蛭石和珍珠岩(体积比为5:3:2)的塑料盆中。培养条件:温度25~30℃,湿度70%~80%,光照16 h·d−1。扦插苗培养3个月后,采集自茎尖起的第3~5片叶片,将采摘下来的叶片立刻放入液氮中速冻处理,装入样品袋,将叶片碾碎后混合,存放于-80 ℃冰箱备用。
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使用的主要药品有二硫苏糖醇、碘乙酰胺、硫脲、尿素、十二烷基硫酸钠、Tris base、甘氨酸均购自Sigma公司;IPG buffer、固相pH梯度IPG干胶条、矿物油均购于美国GE Helthcare公司;乙二胺四乙酸、氯化钠、丙三醇、苯甲咪盐酸水合物、β-甘油磷酸二钠水合物、三氯乙酸、β-巯基乙醇、四甲基乙二胺、无水乙醇、冰乙酸、硝酸银、无水乙酸钠、硫代硫酸钠、无水碳酸钠、甲醛、戊二醛、考马斯亮蓝R250均购自国药集团化学试剂有限公司;TritonX-100、溴酚蓝、过硫酸铵、丙烯酰胺、N,N’一甲叉双丙烯酰胺均购自Biotopped公司;标准分子量蛋白Marker购自Thermo公司;Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自上海生工生物工程有限公司;其他常规试验试剂均为国产分析级试剂。
使用的主要仪器有冷冻离心机(Eppendorf,德国),超声波细胞粉碎机(兰仪,上海),万分之一天平(Sartorius,德国),高速冷冻离心机离心机(Eppendorf,德国),漩涡混合器(Crystaln,美国),制冰机(Scotaman,意大利),酶标仪(永创,上海),水浴锅(中兴伟业,北京),Ettan IPGphor3 (GE Helthcare,美国),EttanDALTsix (GE Helthcare,美国),ImageScanner Ш (GE Helthcare,美国),ImageMasterTM 2D Platinum 7.0 (GE Helthcare,美国)。
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本研究以小黑杨叶片为材料,对小黑杨叶片蛋白质双向电泳体系的2D裂解液、蛋白的纯化、IPG胶条的pH范围、蛋白上样量、等电聚焦时间和SDS平衡时间进行优化。
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蛋白样品提取后需要用2D裂解液重新溶解再进行双向电泳实验。本实验选择了2种2D裂解液溶解小黑杨叶片蛋白质,即:2D裂解液Ⅰ(9.8 mol·L−1Urea,4% CHAPS,10% DTT)和2D裂解液Ⅱ(7 mol·L−1 Urea,2 mol·L−1Thiourea,4% CHAPS,10% DTT),比较2种2D裂解液对小黑杨叶片蛋白质分离的影响。
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小黑杨叶片蛋白质提取后含有较多的多糖、多酚等非蛋白类物质,影响双向电泳图谱的分辨率。为了获得高纯度的蛋白质样品,提高蛋白质的分离效果,笔者对小黑杨叶片蛋白质样品进行纯化。本实验采用TCA-丙酮法和2D clean-up kit法对小黑杨叶片蛋白质进行纯化,采用纯化后的蛋白样品进行双向电泳实验,比较2种方法对小黑杨叶片蛋白质的纯化效果。
三氯乙酸—丙酮(TCA-丙酮)法:取280 μL蛋白上清液于1.5 mL离心管中,加入1.4 mL −20℃保存的蛋白提取液I(含0.07% β-巯基乙醇,10% 三氯乙酸),上下颠倒混匀,−80℃存放2 h。12 000 g,4℃,离心20 min。弃除上清,用蛋白提取液II(含0.07% β-巯基乙醇)洗涤沉淀3次,直至沉淀呈白色。将沉淀真空干燥3~5 min,取适量2D裂解液(7 mol·L−1尿素,2 mol·L−1硫脲,1%DTT,4%CHAPS)溶解蛋白样品。将样品进行液氮冷冻处理,–80℃冰箱保存。
2D clean-upkit(GE,美国)法:取100 μL蛋白上清液加入300 μL沉淀剂,混匀,冰上培育15 min;再加入300 μL共沉淀剂,混匀;4℃,12 000 g离心5 min;离心后弃去上清液,在离心管中加入40 μL共沉淀剂,冰浴5 min;4℃,12 000 g离心5 min;弃上清,加入25 μL去离子水,振荡5~10秒;加入1 mL预冷的洗涤缓冲液和5 μL洗涤添加剂,振荡直至沉淀完全散开,置于−20℃冰箱保存30 min;4℃,12 000 g离心5 min,将上清液移走弃去,用适量的2D裂解液溶解沉淀,4℃,12 000 g离心5 min,留取上清,将蛋白样品液氮冷冻,放−80℃冰箱中保存以备日后分析。
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进行等电聚焦前需要选择合适的pH范围的IPG胶条,使用不同pH范围的IPG胶条分离小黑杨叶片蛋白质得到的双向电泳图谱的分辨率不同。为了找到适用于小黑杨叶片蛋白质分离的IPG胶条的pH范围,本实验分别采用24 cm、pH 3~10和pH 4~7的线性IPG胶条进行双向电泳实验,比较2种不同范围的IPG胶条对小黑杨叶片蛋白质的分离效果。
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进行等电聚焦前笔者对蛋白上样量进行选择。为了获得能够呈现更多的蛋白质信息且分辨率较高的双向电泳图谱,本实验分别取600 μg和1 mg蛋白样品进行双向电泳实验,比较2种蛋白上样量可检测到的蛋白质的数目和蛋白质的分离效果。
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在等电聚焦程序的设定中,10 000 V的等电聚焦时间会影响蛋白质的分离效果。为了获得背景清晰,分辨率较高的双向电泳图谱,本实验对10 000 V的等电聚焦时间进行优化,比较6、11、13 h对小黑杨叶片蛋白质的分离效果。
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等电聚焦结束后需要对胶条进行平衡,平衡时间的长短会影响双向电泳图谱的分辨率。为了找到合适的平衡时间,本实验设定了3个平衡时间,分别为:40、50、60 min,将平衡好的胶条进行SDS-PAGE(Sodium Dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis)电泳,分析不同平衡时间对双向电泳图谱分辨率的影响。
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参考索慧英等[17]方法。分别取小黑杨、大青杨和84 K杨叶片,每种叶片取3份,每份 1 g,分别加入液氮研磨至细粉。将样品分别转移至15 mL离心管中,每份加入1.5 mL蛋白裂解液(2 mmol·L−1 EDTA,137 mmol·L−1 NaCl,40 mmol·L−1 Tris-HCl (pH 6.8),1 mol·L−1 DTT,1%TritonX-100,10%Glycerol,0.5 mmol·L−1 benzamidine,50 mmol·L−1 β-glycerophosphate),充分混匀,冰浴条件下超声破碎处理6 min(φ2,26℃,3/9sec);12 000 g,4℃,离心20 min;留取上清,分别将每种叶片提取出的蛋白上清液转移至一个离心管中,充分混合均匀后进行液氮冷冻处理,存放于−80℃冰箱保存备用。
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采用2D clean-upkit法对小黑杨、大青杨和84 K杨叶片总蛋白质进行纯化,操作步骤见1.3.1.2,其中,获得的蛋白沉淀用2D裂解液Ⅱ进行溶解。将蛋白样品液氮冷冻,放−80℃冰箱中保存。
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本实验采用改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒(生工,上海)测定蛋白浓度,使用牛血清蛋白(BSA)作为标准样品,分别取浓度为1 mg·mL−1的BSA标准溶液0、4、8、12 μL于0.5 mL的离心管中,用去离子水分别添加至终体积为40 μL,旋涡振荡混合均匀。分别从每管中取出20 μL溶液加入到酶标板中,在每个孔中分别加入200 μL的Bradford工作液,吸打混匀,室温反应5 min。使用酶标仪读取波长为595 nm的吸光值,以不同BSA含量(mg)为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。
将待测蛋白样品稀释至合适浓度,按照上述操作步骤测定蛋白样品的吸光值,记录吸光值。根据所测样品的吸光值,在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量,除以样品稀释液的总体积,乘以样品稀释倍数即为样品的实际浓度。每个样品重复测定3次,取平均值做为该样品的浓度值。
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第一向等电聚焦(Isoelectric focusing,IEF),取1 mg蛋白样品加入水化液(9.8 mol·L−1 Urea,0.002%BPB,2%IPG buffer,2%CHAPS)至总体积为450 μL,充分混匀,将样品自左而右线性加入到水化槽中,将24 cm、pH 4~7线性IPG胶条保护膜去除,胶面朝下缓慢的置于样品溶液上并覆盖矿物油,将水化槽置于等电聚焦仪中。在20℃条件下进行等电聚焦,等电聚焦参数设置见表1。
步骤Steps 电压Voltage/V 升压模式Boosting mode 时间Time/h Step1 50 快速Rapid 24 Step2 500 快速Rapid 5 Step3 1 000 线性Linear 1 Step4 8 000 线性Linear 3 Step5 8 000 快速Rapid 3.75 Step6 10 000 线性Linear 3 Step7 10 000 快速Rapid 13 Table 1. The program of isoelectric focusing electrophoresis
等电聚焦结束后将胶条进行两步平衡。第一步:将胶条置于平衡缓冲液I(75 mmol·L−1 Tris-HCl (pH 8.8),6 mol·L−1 Urea,30% Glycerol,2% SDS,1% DTT)中平衡40 min。第二步:将胶条转移到平衡缓冲液II(75 mmol·L−1 Tris-HCl (pH 8.8),6 mol·L−1 Urea,30% Glycerol,2% SDS,2.5%碘乙酰胺)中平衡40 min。平衡结束后进行第二向SDS-PAGE电泳,分离胶的浓度为13%,电泳条件为1 W·gel−1,电泳30 min后调整为13 W·gel−1,至溴酚蓝指示剂到达距凝胶底部1 cm处停止电泳,将凝胶取出,进行银染染色。
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参考严冬等[18]方法。固定30 min,致敏30 min,漂洗3次,每次10 min;染色20 min后立即水洗2次,每次1 min;显色至蛋白质点清晰后终止5 min。染色后的凝胶利用ImageScanner Ш扫描仪与ImageMasterTM 2D Platinum 7.0分析软件进行图像的采集与分析,分辨率为300 dpi。