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石斛（Dendrobium Sw.）为兰科多年生附生植物，是世界重要的濒危植物，也是我国中药的宝贵资源。石斛花多含有具食用、药用价值的多种生物活性物质，常用来泡茶和美容，具有滋阴补虚和生津解郁的保健功效。石斛花为虫媒花，花香在蜂蝶类授粉和石斛繁殖中发挥着重要的作用[1-2]。
中国有80种以上的石斛属原种，主要分布于我国云南、广西、贵州、台湾、海南等省份[3]。石斛属有12个组，最大的组为石斛组，有超过40种以上的原种[2]，许多种开花有香味，或淡或浓。吕素华等[4]发现，壬醛、α蒎烯是铁皮石斛（D. officinale Kimura et Migo.）鲜花的主要香气成分；李崇晖等[5]发现，鼓槌石斛（D. chrysotoxum Rchb. f.）花朵的主要赋香成分为3-蒈烯，罗河石斛（D. lohohense Tang et Wang）鲜花香气成分为水杨酸甲酯和D-柠檬烯，密花石斛为α-法尼烯；黄昕蕾等[6]分析了鼓槌石斛鲜花香气，影响鼓槌石斛香气的主要物质为β-罗勒烯、α-蒎烯和苯乙醛；仇硕等[7]分析了细茎石斛（D. moniliforme (L.) Sw.）鲜花香气成分是α-蒎烯，相对含量达27%以上；袁明焱等[8]分析美花石斛（D. loddigesii Rolfe）花主成分（相对质量分数）为乙酸- 2 -乙基己酯（35.29%）、1,3,6-辛三烯（20.51%）、L-芳樟醇（4.31%）、L-柠檬烯（3.00%）。目前，已对石斛花朵香气成分进行分析的石斛原种有11个，如檀香石斛（D. anosmum Lindl.）、紫瓣石斛（D. parishii Rchb. f.）、铁皮石斛、金钗石斛（D. nobile Lindl.）和球花石斛（D. thyrsiflorum Rchb. f.）等[4-12]。另外，花期极长的秋石斛类，多个品种的挥发性成分也有学者进行了研究[13-14]。
石斛花朵的挥发性成分分析，许多研究以干燥花为试验材料，提取方法为水蒸气蒸馏法，该种试验方法分析的花朵挥发性成分中，脂肪族类挥发性成分偏多[12]。近年来，部分学者在美花石斛、细茎石斛、鼓槌石斛中，采用固相微萃取结合GC-MS法进行花成分分析，发现赋香成分的种类明显含较多的萜烯类成分[6-8]。李崇晖等[5]研究了细叶石斛（D. hancockii Rolfe）花的挥发性成分，鉴定出16个化合物，以3-蒈烯（71.25%）为主。在前人研究的基础上，本试验选取了细叶石斛和翅梗石斛（D. trigonopus Rchb. f.），进行花朵挥发性赋香成分的测定。这2个种石斛花香味浓郁醇厚，穿透力强，花期长。通过SPME结合GC-MS联合分析，进一步挖掘特异香气成分，明确石斛花香利用价值。
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试验仪器选用美国Agilent公司7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪，全自动进样装置，50/30 μm DVB/CAR/PDMS和65 μm PDMS/DVB SPME萃取头（美国Supelco公司），20 mL白色顶空进样瓶。
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2018年采自3年生细叶石斛、翅梗石斛盛花期花朵，翅梗石斛花瓣厚蜡质，细叶石斛花大，2种石斛皆为黄花，花期长（图1）。采样地点为中国林业科学研究院科研联栋温室。材料引种自中国云南省西双版纳，由中国林科院林业所李振坚副研究员鉴定。
Figure 1. Morphological characteristics in florescence of two fragrant Dendrobium species
选3株长势良好的植株作为采集对象，于晴天10：00—10：30采集盛花期花朵置于20 mL顶空瓶内，静置30 min，采用固相微萃取法进样。在40℃下顶空瓶的密闭环境中，使用萃取头萃取30 min进样。萃取完成后，将吸附在纤维上的化合物在250℃下解吸附5 min。萃取纤维头使用前，需在250℃下老化30 min。重复采样3次，以空白顶空瓶为对照。
1.1. 试验仪器
1.2. 试验材料
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色谱柱为HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）石英毛细管柱。电离方式EI，电子能量70 eV。进样口温度250℃，四级杆温度150℃，离子源温度230℃，接口温度280℃，扫描质量数范围30~500 amu。升温程序为初始柱温度50℃保持2 min，以3℃·min−1升温至80℃保持2 min，再以5℃·min−1升温至180℃保持5 min，再以15℃·min−1升至250℃。
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利用Amdis质谱数据解卷积处理数据减少本底干扰，拆分共流出峰。计算机谱库检索采集到的花朵成分质谱图，使用MassHunter软件通过检索NIST 11标准谱库质谱图库，并结合相关文献，确定细叶石斛和翅梗石斛鲜花挥发性物质的化学成分。确定花朵中挥发性成分后，再根据离子流峰面积归一化法，计算各成分的相对含量。
2.1. GC-MS分析条件
2.2. 成分分析
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采用GC-MS方法分析，得到细叶石斛和翅梗石斛花挥发性成分的总离子流图（图2）。细叶石斛花的挥发性物质分离出78个色谱峰，共鉴定出52个化学成分，占总挥发性含量的80.97%；翅梗石斛花中的挥发性物质分离出42个色谱峰，共鉴定出35个化学成分，占总挥发性含量的85.36%。最终确定2种石斛的挥发性化合物，共有72个（表1）。
序号
No.保留时间
Retain time/min化合物
Constituents相对百分含量
Relative content/%细叶石斛 翅梗石斛 1 3.612 正戊醇 Pentanol — 0.04 2 3.793 异戊酸甲酯 Methyl isovalerate — 0.10 3 4.610 六甲基环三硅氧烷 Hexamethylcyclotrisiloxane 0.29 0.64 4 5.909 惕各酸甲酯 Methyl tiglate — 0.37 5 6.025 正己醇 Hexanol — 0.06 6 6.670 2-庚酮 2-Heptanone 0.15 — 7 6.863 甲氧基苯基肟 2-Oxime-2-methoxy-phenyl — 0.22 8 7.092 庚醛 Heptanal — 0.04 9 7.885 己酸甲酯 Methyl hexoate — 0.04 10 8.008 α-侧柏烯 2-Methyl-5-(1-methylethyl)-bicyclo[0.3.0]hex-2-ene 0.57 — 11 8.287 α-蒎烯 α-Pinene 0.06 — 12 9.688 正庚醇 Heptan-1-ol — 0.09 13 9.819 桧烯 Sabinene 0.51 — 14 10.004 β-蒎烯 β-Pinene 0.25 — 15 10.276 6-甲基-5-庚烯-2-酮 6-Methylhept-5-en-2-one — 0.05 16 10.324 3-辛酮 3-Octanone 0.15 0.18 17 10.386 八甲基环四硅氧烷 Octamethylcyclotetrasiloxane 0.32 1.79 18 10.536 月桂烯 β-Myrcene 2.33 2.92 19 11.153 (-)-β-蒎烯 (-)-β-Pinene 0.08 — 20 11.273 异戊酸异丁酯 Isobutyl isovalerate — 0.05 21 11.504 对二氯苯 1,4-Dichlorobenzene 0.04 — 22 12.240 d-柠檬烯 (+)-Limonene 2.26 4.82 23 12.346 桉叶油醇 Cineole 0.18 — 24 12.591 (E)-B-罗勒烯 (E)-3,7-Dimethylocta-1,3,6-triene — 2.79 25 12.595 (3E)-3,7-二甲基辛-1,3,6-三烯 1,3,6-Octatriene,3,7-dimethyl-,(3E)- 1.34 — 26 13.316 罗勒烯 (Z)-β-Ocimene 27.60 43.67 27 13.525 3-异丙烯基-5,5-二甲基-环戊烯 3-Isopropenyl-5,5-dimethylcyclopentene 0.11 — 28 13.606 γ-松油烯 γ-Terpinene 0.03 0.42 29 14.144 正辛醇 1-Octanol 0.36 0.04 30 14.684 2-乙基-1,6-二噁螺[4.4]-壬烷 2-Ethyl-1,6-dioxaspiro[4.4]-nonane 0.05 — 31 14.776 萜品油烯 Terpinolene 0.12 — 32 15.111 苯甲酸甲酯 Methyl benzoate 0.69 — 33 15.393 紫苏烯 Perillene 2.00 0.31 34 15.600 芳樟醇 Linalool 6.73 — 35 15.797 异戊酸异戊酯 Isoamyl isovalerate — 0.42 36 16.110 3-亚甲基-1,1-二甲基-2-乙烯基环己烷2-Ethenyl-1,1-dimethyl-3-methylenecyclohexane — 1.46 37 16.257 (-)-α-侧柏酮 (-)-α-Thujone 0.02 — 38 16.453 对薄荷-1,3,8-三烯 1,3,8-p-Menthatriene 0.03 — 39 16.829 (3E,5E)-2,6-二甲基-1,3,5,7-辛四烯(3E,5E)-2,6-Dimethyl-1,3,5,7-octatetraene 0.51 — 40 17.304 别罗勒烯 Allo-ocimene — 0.39 41 17.334 2,6-二甲基-2,4,6-辛三烯 2,6-Dimethyl-2,4,6-octatriene 0.19 — 42 17.420 环五聚二甲基硅氧烷 Decamethylcyclopentasiloxane 1.74 4.08 43 17.490 烟酮 3,5,5-Trimethylcyclohexane-1,2-dione — 0.10 44 17.768 甲基-2-烯基-3-甲基丁酸酯 3-Methylbut-2-enyl 3-methylbutanoate — 0.55 45 19.121 4-萜烯醇 4-Terpineol — 0.18 46 19.592 水杨酸甲酯 Methyl salicylate 0.43 0.02 47 19.805 α-松油醇 α-Terpineo 0.04 — 48 20.296 (-)-马鞭草烯酮 (-)-Verbenone 0.09 — 49 20.466 2,6-二甲基-3(E),5(E),7-辛三烯-2-醇E,E-2,6-Dimethyl-3,5,7-octatriene-2-ol 0.03 — 50 21.190 橙花醇 Nerol 0.13 — 51 21.789 顺式-柠檬醛 Neral 0.14 — 52 23.141 (E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛 Geranial 0.56 — 53 25.101 十二甲基环六硅氧烷 Dodecamethylcyclohexasiloxane 2.51 1.39 54 25.628 惕各酸叶醇酯 (Z)-3-Hexenyl tiglate 0.33 — 55 25.590 甲基(2E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯酸酯Methyl (2E)-3,7-dimethyl-2,6-octadienoate — 3.01 56 26.790 甲苯-2,4-二异氰酸酯 Toluene 2,4-diisocyanate 0.37 — 57 28.508 β-榄香烯 (5S,7R,10S)-(-)-1-methyl-1-vinyl-2,4-diisopropenyl-cyclohexane 0.87 — 58 28.864 5-甲基-1,3-二氢苯并咪唑-2-酮 5-Methylbenzoimidazol-2(3H)-one 0.10 — 59 29.118 石竹烯 (4Z)-4,11,11-trimethyl-8-methylidenebicyclo[7.2.0]undec-4-ene 0.14 — 60 29.321 1,3,5-三甲氧基苯 1,3,5-Trimethoxybenzene 0.07 — 61 29.850 β-石竹烯 β-Caryophyllene 22.4 14.35 62 30.565 香树烯 (-)-allo-Aromadendrene 0.34 — 63 30.965 2-亚甲基-4,8,8-三甲基-4-乙烯双环[5.2.0]壬烷2-Methylene-4,8,8-trimethyl-4-vinylbicyclo[5.2.0]nonane 0.10 — 64 31.186 α-石竹烯 α-Caryophyllene 0.98 0.21 65 32.136 十四甲基环七硅氧烷 Tetradecamethyl cycloheptasiloxane — 0.15 66 33.230 α-法呢烯 Farnesene — 0.16 67 35.517 橙花叔醇 Nerolidol 0.06 — 68 35.824 顺式-3-己烯醇苯甲酸酯 cis-3-Hexenyl benzoate 0.20 — 69 36.176 石竹素 Caryophyllene oxide 0.56 0.25 70 43.735 苯甲酸正辛酯 Octyl benzoate 1.20 — 71 46.227 邻苯二甲酸二异丁酯Bis(2-methylpropyl) 3,4,5,6-tetradeuteriobenzene-1,2-dicarboxylate 0.23 — 72 50.245 酞酸丁酯 Dibutyl phthalate 0.10 — Table 1. Volatile constituents in D. hancockii and D. trigonopus flower
Figure 2. Ion chromatogram of volatile constituents in two Dendrobium species flower
2种石斛花朵的挥发性成分组成丰富。细叶石斛花获得52个挥发性化合物（表1），相对含量1%以上的有10个，分别为：罗勒烯（27.60%）、β-石竹烯（22.40%）、芳樟醇（6.73%）、十二甲基环六硅氧烷（2.51%）、月桂烯（2.33%）、d-柠檬烯（2.26%）、紫苏烯（2.00%）、环五聚二甲基硅氧烷（1.74%）、(3E)-3,7-二甲基辛-1,3,6-三烯（1.34%）和苯甲酸正辛酯（1.20%）。罗勒烯、β-石竹烯、芳樟醇3个成分含量皆高于4%，皆是常见的香味化合物。衡量各个成分对整体花香的贡献大小，除相对含量外，还要结合嗅觉气味存在的最小浓度值（嗅感阈值）来判断。细叶石斛获得的挥发性成分主要为烯烃类，烯烃类嗅感阈值相对较低，有利于香味的感知[15-19]。据此得出细叶石斛的特征香气成分为罗勒烯、β-石竹烯、芳樟醇；花中还含月桂烯、d-柠檬烯、紫苏烯等成分，共同构成细叶石斛的赋香成分，形成了细叶石斛的独特的香气。其他含量较低的呈香成分还有α-律草烯、β-榄香烯、α-侧柏烯、香树烯、β-蒎烯、苯甲酸甲酯、水杨酸甲酯等。
翅梗石斛花中获得35个挥发性物质（表1），相对含量1%以上的有10个，分别为：罗勒烯（43.67%）、β-石竹烯（14.35%）、d-柠檬烯（4.82%）、环五聚二甲基硅氧烷（4.08%）、甲基(2E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯酸酯（3.01%）、月桂烯（2.92%）、(E)-B-罗勒烯（2.79%）、八甲基环四硅氧烷（1.79%）、3-亚甲基-1,1-二甲基-2-乙烯基环己烷（1.46%）、十二甲基环六硅氧烷（1.39%）。罗勒烯、β-石竹烯和d-柠檬烯3个成分含量皆高于4%，皆是常见的香气化合物。据此得出翅梗石斛的特征香气成分为罗勒烯、β-石竹烯和d-柠檬烯；花中还含月桂烯（2.92%）、(E)-B-罗勒烯（2.79%）是罗勒烯的异构体。其他含量较低的呈香成分还有γ-松油烯、别罗勒烯、紫苏烯、α-律草烯、异戊酸异戊酯等。
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72个香气化合物，可分为7类，分别为烷烃类、醛类、酮类、酯类、醇类、烯烃类和其他类（表2）。2种石斛中，烯烃类化合物的相对含量均最高。萜烯类化合物通常具有提神、抗菌消炎和镇痛作用[20]。细叶石斛中烯烃类含量为63.28%，翅梗石斛中烯烃类化合物的相对含量为70.04%。
化合物类型
Component type总组分Component number 相对含量Relative content/% 含量在1%以上的成分No. (≥1%) 细叶石斛 翅梗石斛 细叶石斛 翅梗石斛 细叶石斛 翅梗石斛 烯烃类 22 10 63.28 70.04 6 5 醇类 7 5 7.53 0.41 1 — 烷烃类 6 6 4.99 9.51 2 4 酯类 8 8 3.85 4.55 1 1 醛类 2 1 0.70 0.04 — — 酮类 5 3 0.51 0.33 — — 其他类 2 2 0.11 0.47 — — 合计 52 35 80.97 85.36 10 10 Table 2. Classification to the scent compositions of D. hancockii and D. trigonopus flowers
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2种石斛分析共得到72个化合物，其中，共有成分15个。2种石斛花香味皆浓，单花开3~5周，香味散发范围广。2个石斛种，特征赋香成分、含量存在差异。翅梗石斛香味较浓郁，细叶石斛清香宜人。细叶石斛、翅梗石斛皆含有的罗勒烯，前者为27.60%，后者含量高达43.67%。细叶石斛中β-石竹烯含量高于翅梗石斛。细叶石斛含有芳樟醇(6.73%），翅梗石斛中并未检测到。细叶石斛(52个）含有的呈香成分多，挥发性成分比翅梗石斛（35个）多17个，香味构成丰富、含量较为均衡。
细叶石斛和翅梗石斛所含有的主要赋香成分中，有罗勒烯、β-石竹烯、d-柠檬烯、月桂烯，为当前植物中常见的天然香味化合物。这4种香气成分，在2种石斛中相对含量高，香气丰富，功能各异。除提供香味外，多数香气有抗炎活性。
2种石斛罗勒烯含量皆为最高，罗勒烯有花香、草香并伴有橙花油气息，有很强的甜香味[21]，对人体免疫系统提供辅助功能，并参与调节工蜂的采粉行为；(E)-B-罗勒烯是罗勒斯的同分异构体，是蜜蜂族群社会规则中的一个信息素，可部分抑制工蜂卵巢的发育。
β-石竹烯为双环倍半萜型化合物，在2种石斛花中相对含量皆超过10%，具有淡的丁香香气，为食用香料[22]，具有平喘、祛痰、抗炎作用[23-25]。β-石竹烯具有抗广泛性焦虑、抑郁的作用[26-27]；α-石竹烯也是β-石竹烯的同分异构体，具有温和的丁香香气[28]；石竹素为β-石竹烯的氧化物。
细叶石斛中含有芳樟醇，是天然的萜烯香料，常作为香水或香料使用，为使用频率最高的家用香料。芳樟醇具有铃兰类鲜爽型花香特征，香气阈值为10 bpm[29-30]；同时，芳樟醇还具有镇痛、抗炎，抗菌等药理活性[31]，可由α-蒎烯或β-蒎烯经过月桂烯合成，可作食用香精及工业生产中的重要中间体，罗勒烯由芳樟醇为原料制备而来。α-蒎烯经过高温（160℃）裂解合成月桂烯，进一步合成芳樟醇。
在2种石斛中，d-柠檬烯和月桂烯含量都较高。d-柠檬烯是单环单萜烯，自然界中广泛存在，2种石斛中以翅梗石斛含量较高，呈橙皮愉悦香味，柠檬烯香气阈值为10 bpm[30]，具有消炎、抗菌、修复酒精造成的肝损伤[32-34]。月桂烯又称香菜烯，是合成香料的重要原料。具有清淡的香脂香气，香气阈值为13~15 bpm[30]，可改善人体信息素分泌，增加异性好感；月桂烯有镇痛、显著的抗炎和抗分解代谢作用[35-36]。月桂烯可由芳樟醇脱水形成，也可由β-蒎烯高温合成。
72个成分中，含有16种酯类物质，苯甲酸甲酯有令人陶醉的甜香而闻名[37]；水杨酸甲酯具有特殊草药气味，在吸引昆虫传粉中起到重要作用，且有抗广泛性焦虑、抑郁的作用[27]。成分中含有5种硅氧烷，3种硅氧烷含量高于1%以上，其中，以环五聚二甲基硅氧烷含量较高，可广泛使用于化妆品和人体护理产品中，与大部分的醇和其他化妆品溶剂有很好的相容性。硅氧烷有良好的铺展性，可用于皮肤护理。
3.1. 2种石斛花的挥发性成分
3.2. 挥发性化合物的分类
3.3. 两种石斛花香气的主要赋香成分
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中国是石斛属内石斛组的主要分布地区，中药石斛主要来源于石斛组。细叶石斛是石斛组花香纯正的种。石斛属花开浓香型的种类较少，除石斛组外，黑毛组花香较为典型的种为翅梗石斛。细叶石斛和翅梗石斛花瓣蜡质，花期长，花香浓，穿透力强。
植物花香化合物是植物花朵释放的次生代谢产物，由许多低分子量、易挥发的化合物混合而成。花香是由植物花朵内所有挥发性香味组分共同作用形成的，具有吸引昆虫传粉和防御功能[2]。李崇晖等[8]测定25℃下萃取出细叶石斛花的挥发性成分，鉴定出16种成分，其主要成分是3-蒈烯（71.25%），该实验获得挥发性成分种类少（16种），而不同萃取温度，对萃取效率、萃取量及萃取成分影响较大，因此，与本文结果差异的主要原因推测是固相萃取温度的不同[38-39]。本实验通过不同实验条件（萃取温度40℃），拆出共流峰减少本底干扰，再对细叶石斛的挥发性成分测定，发现其呈香成分丰富（52个），其特征香气成分为罗勒烯、石竹烯、芳樟烯。本研究实验结果与细叶石斛的香味类型更接近。郝瑞杰[30]发现，上千种花香化合物中，主要花香化合物有12种，有柠檬烯、罗勒烯、月桂烯、芳樟烯、β-蒎烯、α-蒎烯、石竹烯等。细叶石斛含有的此类香气成分达8种，香气成分丰富，含量高，是典型的花香味。
鲜花的香气成分常用萃取法或水蒸气蒸馏法来提取[40-41]。利用有机溶剂萃取以及水蒸汽蒸馏法，高温会破坏植物结构，导致挥发物的分解或流失，同时pH条件会改变花朵中原有的挥发物成分[42]。采集新鲜花朵，通过固相微萃取技术，结果将更有利于分析花朵的挥发性成分。新鲜花朵的顶空固相微萃取方法，测得香味化合物含量偏多，并能减少成分损失，使结果接近于植株的真实状态[43]。固相微萃取结合GC-MS分析石斛盛花期鲜花，得到的成分以烯烃类居多，同时香味成分明显。
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本研究运用了SPME和GC-MS技术，分析2种香花型石斛盛花期花朵的挥发性成分。细叶石斛共鉴定分离挥发性组分52个，含烯烃类22个、酯类8个、醇类7个、烷烃类6个、酮类5个、醛类2个。翅梗石斛共鉴定得到挥发性组分35个，含烯烃类10个、酯类8个、醇类5个、烷烃类6个、酮类3个、醛类1个。细叶石斛的特征香气成分是罗勒烯、β-石竹烯和芳樟醇；翅梗石斛的特征香气成分是罗勒烯、β-石竹烯和d-柠檬烯。本试验研究明确了翅梗石斛中罗勒烯香气含量高，远高于其它成分，香味浓郁；细叶石斛中罗勒烯和石竹烯含量均衡，呈香成分丰富，香气宜人。
致谢 感谢中国林业科学研究院林木遗传育种国家重点实验室的试验支持。
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