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土壤中过量的盐分会抑制植物光合作用、诱导产生氧化胁迫、渗透胁迫及离子胁迫等,阻碍植物的正常生长发育进程[1-2]。植物通过合成积累游离脯氨酸、氨基酸和可溶性蛋白质等渗透调节物质,并诱导增强植物体内抗氧化酶如过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)等的活性,从而增强了植物的耐盐能力[3-4]。
水分是植物在盐胁迫下维持正常生长的重要条件。液泡膜内在蛋白(TIPs)和质膜内在蛋白(PIPs)作为植物水通道蛋白(AQPs)家族的重要成员[5],通过调节植物水分运输,影响植物逆境应答,促进盐胁迫下植物生长发育[4]。盐胁迫下,转 TsTIP1;1及TsPIP1;1 基因水稻(Oryza sativa L.)的光合能力显著增强、细胞持水能力明显提高[5];过表达PIP2;1增强了拟南芥(Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.)细胞的持水能力[6]。位于液泡膜上的Na+/H+ 逆向转运蛋白NHX1参与调控植物液泡渗透势,可以把细胞质内过量的Na+ 隔离到液泡内,减轻了拟南芥受到的盐胁迫,从而减弱了盐胁迫对其生长的抑制[7]。
刺槐(Robinia pseudoacacia L.)生长迅速、适应性强,具有耐干旱、耐瘠薄、繁殖快等特点,是盐碱地区造林的先锋树种,具有良好的经济和环境效益[8-9]。近年从逆境生理、品种选育等方面对刺槐的耐盐机理进行了一定研究,然而,盐胁迫下各生理指标对刺槐耐盐能力的影响及刺槐体内相关基因转录表达情况的研究较少。本研究以1年生刺槐幼苗为试验材料,综合分析NaCl胁迫对刺槐幼苗生长、生理、离子含量及相关基因表达的影响,初步解析刺槐耐盐机制,从而为建立刺槐抗逆性生态生理指标体系提供理论依据。
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以1年生刺槐播种苗为试验材料,在中国林业科学研究院科研温室中进行盆栽(花盆规格:盆高×盆口直径=22 cm×20 cm)培养,基质为V珍珠岩∶V蛭石=3∶1。培养条件为:自然光照;昼夜温度:25/20°C;相对湿度:50%~60%。试验开始前,每株幼苗每2 d浇灌1/2 Hoagland 营养液(pH值5.5)100 mL,待苗高约20 cm时,选取生长一致且健壮的幼苗进行试验。
试验分3个处理组,每个处理组10株幼苗,处理浓度分别为0、50、100 mmol·L−1 NaCl溶液。NaCl处理期间,为保证NaCl浓度的一致性,每3 d用含同等浓度NaCl溶液的1/2 Hoagland营养液淋洗花盆基质,处理27 d后,每个处理组选取6株长势基本一致的幼苗进行收获。
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收获前,每个处理组随机选取3株幼苗,每株选取3片成熟的叶片,在晴天上午 9: 00—11: 00 用 Li 6400光合作用测量系统 ( LI-Cor, Lincoln, Nebraska, USA) 测定刺槐幼苗叶片的光合作用参数;同时,计算刺槐叶片水分利用效率(WUE) = 净光合速率(A)/蒸腾速率(E)[10]和气孔限制值(Ls) = 1− Ci/Ca (Ci为胞间CO2浓度;Ca为空气中CO2浓度,本试验中该值为400 μmol·mol−1) [11]。
光合测定结束后,收获植株。收获时,根、茎、叶分别收获并记录各部分的生物量。所有材料保存在液氮中,并在液氮中使用球磨仪(NM400,Retsch, Haan, Germany)将其研成粉末,于−80°C保存备用。称取各处理组刺槐根、茎和叶片鲜样60 mg,于65°C烘干,计算样品干湿比及干质量。
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采用烘干称重法测定各处理组刺槐幼苗叶片相对含水量(RWC)。参照Wellburn[12]提出的方法测定刺槐幼苗叶片中叶绿素含量。
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根据 Hodges等[13]提出的方法测定刺槐样品中丙二醛(MDA)的含量。
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根据Tamás等[14]的方法测定样品游离脯氨酸含量。使用氨基酸(AA)含量检测试剂盒(索莱宝,北京)测定样品中氨基酸含量。样品中可溶性蛋白含量参照Luo等[15]的方法测定。
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将烘干的根和叶片样品研磨粉碎后,过0.5 mm筛,称取0.2~0.3 g样品(精确至0.001 g),置于消煮管中,加入8 mL浓硝酸,摇匀后过夜,并做空白对照。消解前加入2 mL H2O2,静置20 min,随后使用Mars高压微波消解仪(Mars-6,CEM Corp.,USA)消解,之后加热赶酸,待消解液剩余约 2 mL 时停止加热,冷却后过滤到50 mL容量瓶中并定容、摇匀。静置 20 min,吸取上清液 10 mL 至离心管中,使用等离子体发射光谱仪 iCAP 6300(Thermo Scientific,USA)测定Na+、K+、Ca2+、Mg2+ 含量,并计算Na+/K+、Na+/Ca2+、Na+/Mg2+比值。
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使用植物RNA提取试剂盒(DP432,天根)提取刺槐根和叶样品中总RNA,并进行浓度及纯度检测。使用PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047B,TaKaRa)将纯化后的RNA进行反转录,获得cDNA,然后使用荧光定量PCR仪(ABI7500,Applied Biosystems,USA)进行相对荧光定量(qPCR)分析。引物由北京Invitrogen公司合成,具体信息见表1,内参基因为Actin[18]。
基因名称
Gene name引物序列
Primers扩增效率/%
PCR efficiencyTIP 1;1 F: 5′-GCCTCCTTGCTCCTCCTCT-3′ 92 R: 5′-ACAATAGCAGGTCCGAATGATAC-3′ PIP 1;1 F: 5′-TGTCCCTCACAAGAGCCCTAT-3′ 96 R: 5′-GCATCAGTGGCGGAGAAGA-3′ PIP 2;1 F: 5′-AAAGACTACCAAGACCCACCTC-3′ 103 R: 5′-GGAACAACCCAAATGTCACAG-3′ NHX 1 F: 5′-TTTGACAGGTCTACTTAGTGCGT-3′ 102 R: 5′-CAGAATGCCACTCAGATAGGTT-3′ Actin F: 5′- TTGCCTTGGATTATGAACA -3′ 97 R: 5′- GATGGCTGGAACAGAACTT -3′ Table 1. Primers used for qRT-PCR
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采用2−ΔΔCT法获得qPCR的差异表达倍数。对本试验获得的所有数据使用Statgraphics Centurion XVI.I (STN, St, Louis, MO, USA)软件进行分析。数据分析之前,对其进行正态分布检验。所有数据采用单因素进行分析,以NaCl作为自变量因素。采用LSD法进行数据间差异显著性分析,当F检验的P-Value < 0.05时,认为数据间的差异显著。
1.1. 试验材料及处理方法
1.2. 测定方法
1.2.1. 光合参数测定及材料收获
1.2.2. 叶片相对含水量和叶绿素含量测定
1.2.3. 丙二醛(MDA)含量测定
1.2.4. 游离脯氨酸、氨基酸、可溶性蛋白质含量测定
1.2.5. 酶活性测定
1.2.6. 离子含量分析
1.2.7. 水通道蛋白及Na+ / H+ 逆向转运蛋白基因表达分析
1.3. 数据统计分析
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在NaCl处理下,刺槐幼苗根、茎和叶的干质量均出现不同程度的下降,根冠比增加(表2),说明NaCl处理影响了刺槐的正常生长发育。随NaCl浓度的升高,刺槐幼苗叶片相对含水量显著降低,与0 mmol·L−1 NaCl处理组相比,50、100 mmol·L−1 NaCl处理组刺槐幼苗叶片的相对含水量分别减少了7.0%和18.2%。
NaCl浓度/
(mmol·L−1)根
Root/g茎
Shoot/g叶
Leaf/g根冠比
Root to shoot ratio叶片相对含水量
RWC /%0 0.94 ± 0.06 a 2.26 ± 0.07 a 3.75 ± 0.13 a 0.16 ± 0.007 b 0.907 ± 0.005 a 50 0.73 ± 0.06 b 1.75 ± 0.16 b 2.65 ± 0.18 b 0.17 ± 0.004 b 0.844 ± 0.010 b 100 0.69 ± 0.05 b 1.68 ± 0.08 b 1.91 ± 0.07 c 0.20 ± 0.007 a 0.742 ± 0.014 c P-Value * ** ** ** ** 注:数据为平均值±标准误(n=6),同列不同字母代表差异显著( P ≤ 0.05) ; *: P ≤ 0.05; **: P ≤ 0.01。下同。
Notes: The data is the average ±SE (n=6), different letters in the same column mean significant different in P ≤ 0.05 level; **: P ≤ 0.01. The same below.Table 2. The effects of NaCl concentrations on biomass, root to shoot ratio and leaf relative water content of R. pseudoacacia
NaCl处理使刺槐幼苗叶中叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)和类胡萝卜素(Car)均呈下降趋势(表3)。与0 mmol·L−1 NaCl处理组相比,100 mmol·L−1 NaCl 处理使刺槐幼苗叶片Chl a、Chl b和Car含量分别降低了29.8%、30.5%和36.6%。刺槐净光合速率(A)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(E)均随着NaCl浓度增加显著减少,而水分利用效率(WUE)和气孔限制值(Ls)出现不同程度的增加(表4)。100 mmol·L−1 NaCl 处理组刺槐的A、Gs、Ci和E仅为0 mmol·L−1 NaCl处理组刺槐的42.3%、40.0%、84.7%和31.1%。50 mmol·L−1 NaCl 处理对刺槐幼苗叶片的WUE和Ls无显著影响;而100 mmol·L−1 NaCl 处理组刺槐幼苗叶片的WUE和Ls 分别比0 mmol·L−1 NaCl 处理组刺槐升高了39.3%和25.0%。
NaCl浓度/
(mmol·L−1)叶绿素a
Chl a/(mg g−1)叶绿素b
Chl b/(mg·g−1)类胡萝卜素
Car/(mg·g−1)叶绿素a+b
Chl a+b/(mg g−1)0 9.26 ± 0.80 a 2.69 ± 0.21 a 2.02 ± 0.18 a 11.95 ± 1.02 a 50 7.92 ± 0.05 ab 2.27 ± 0.10 ab 1.48 ± 0.04 b 10.19 ± 0.15 ab 100 6.50 ± 0.05 b 1.87 ± 0.05 b 1.28 ± 0.05 b 8.38 ± 0.11 b P-Value * * ** * Table 3. The effects of NaCl concentrations on photosynthetic pigment content of R. pseudoacacia
NaCl浓度/
(mmol·L−1)净光合速率
A/(μmol· m−2·s−1)气孔导度
Gs/(mol ·m−2·s−1)胞间CO2浓度
Ci/(μmol·mol−1)蒸腾速率
E/ (mmol ·m−2·s−1)水分利用效率
WUE/(μmol·mmol−1)气孔限制值
Ls0 9.7 ± 0.16 a 0.10 ± 0.008 a 252.5 ± 6.3 a 1.64 ± 0.12 a 5.98 ± 0.28 b 0.36 ± 0.03 b 50 6.0 ± 0.27 b 0.07 ± 0.006 b 221.8 ± 13.8 b 1.06 ± 0.08 b 6.14 ± 0.30 b 0.43 ± 0.03 ab 100 4.1 ± 0.26 c 0.04 ± 0.004 c 213.8 ± 7.7 b 0.51 ± 0.05 c 8.33 ± 0.41 a 0.45 ± 0.02 a P-Value ** ** ** ** ** * Table 4. The effects of NaCl concentrations on photosynthetic parameters, WUE and Ls of R. pseudoacacia
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表5表明:在50 mmol·L−1 NaCl处理下,刺槐根和叶中MDA含量均是0 mmol·L−1 NaCl处理组的1.2倍;与0 mmol·L−1 NaCl处理相比,100 mmol·L−1 NaCl处理组刺槐幼苗根和叶中MDA含量虽然出现一定程度增加,但差异不显著。
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表5表明:随NaCl浓度的增加,CAT、APX和GR的活性变化不同;在根中,与0 mmol·L−1 NaCl 处理组刺槐相比,50 mmol·L−1 NaCl处理对CAT和GR活性无显著影响,但使APX活性显著升高;100 mmol·L−1 NaCl处理使CAT、APX和GR活性显著升高。在叶中,50 mmol·L−1 NaCl处理使CAT活性显著升高,但对APX和GR活性无显著影响;100 mmol·L−1 NaCl处理组刺槐CAT、APX和GR活性分别是0 mmol·L−1 NaCl 处理组的3.0、1.8、1.7倍。
NaCl浓度/
(mmol·L−1)丙二醛
MDA/(nmol·g−1)过氧化氢酶
CAT/nKat抗坏血酸过氧化物酶
APX/nKat谷胱甘肽还原酶
GR/nKat根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 0 51.8 ± 3.9 b 86.7 ± 0.7 b 208.0 ± 35.0 b 241.6 ± 19.9 c 182.5 ± 21.0 c 269.8 ± 26.0 b 61.6 ± 9.4 b 76.8 ± 10.3 b 50 62.2 ± 2.1 a 102.8 ± 1.7 a 229.2 ± 32.7 b 399.3 ± 34.4 b 265.9 ± 21.1 b 325.4 ± 14.3 b 46.4 ± 1.8 b 79.0 ± 8.5 b 100 57.3 ± 1.3 ab 93.7 ± 5.2 ab 383.5 ± 35.6 a 721.5 ± 7.0 a 373.0 ± 17.3 a 482.1 ± 17.2 a 145.6 ± 5.4 a 130.0 ± 5.4 a P-Value ns * * ** ** ** ** ** Table 5. The effects of NaCl on MDA content, CAT, APX and GR activities in roots and leaves of R. pseudoacacia
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NaCl处理导致刺槐幼苗根和叶中游离脯氨酸、氨基酸和可溶性蛋白质出现不同程度升高(表6)。在根中,与0 mmol·L−1 NaCl 处理组相比,50 mmol·L−1 NaCl处理使刺槐幼苗游离脯氨酸、氨基酸和可溶性蛋白质分别升高了72.1%、86.4%和63.2%;100 mmol·L−1 NaCl处理使刺槐幼苗游离脯氨酸升高了74.4%,可溶性蛋白质升高了156.7%,但对氨基酸含量影响不显著。在叶中,与0 mmol·L−1 NaCl 处理组相比,50 mmol·L−1 NaCl处理使刺槐幼苗游离脯氨酸和可溶性蛋白质分别升高了136.4%和64.3%;100 mmol·L−1 NaCl处理使刺槐幼苗游离脯氨酸升高了381.8%,氨基酸升高了21.3%。
NaCl浓度/
(mmol·L−1)游离脯氨酸
Free proline/(mg·g−1)氨基酸
Amino acid/(μmol·g−1)可溶性蛋白质
Soluble protein/(mg·g−1)根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 0 0.43 ± 0.01 b 0.11 ± 0.03 c 702.4 ± 57.5 b 762.5 ± 64.0 b 17.1 ± 3.4 c 66.1 ± 4.5 b 50 0.74 ± 0.08 a 0.26 ± 0.02 b 1309.6 ± 79.5 a 800.1 ± 25.6 ab 27.9 ± 2.8 b 108.6 ± 7.5 a 100 0.75 ± 0.03 a 0.53 ± 0.03 a 908.8 ± 59.8 b 924.7 ± 38.0 a 43.9 ± 1.5 a 81.0 ± 2.2 b P-Value ** ** ** ns ** ** Table 6. The effects of NaCl on free proline, amino acid and soluble protein contents in roots and leaves of R. pseudoacacia
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表7表明:随NaCl浓度的增加,刺槐幼苗根和叶中Na+ 含量显著升高,50 mmol·L−1 NaCl处理组刺槐根和叶中Na+ 是0 mmol·L−1 NaCl处理组的2.5和3.1倍,100 mmol·L−1 NaCl处理组刺槐根和叶中Na+ 是0 mmol·L−1 NaCl处理组的4.6和5.6倍,且根中Na+含量高于叶中含量。50、100 mmol·L−1 NaCl处理使刺槐幼苗根中K+ 含量比0 mmol·L−1 NaCl处理组分别降低了16.3% 和11.1%,但对叶中K+ 含量影响不显著。NaCl处理使刺槐幼苗根中Mg2+ 含量逐渐升高,而叶中Mg2+含量逐渐降低,与0 mmol·L−1 NaCl 处理组相比,100 mmol·L−1 NaCl 处理使根中Mg2+含量升高了29.7%,使叶中Mg2+含量下降了28.2%。NaCl处理对刺槐幼苗根和叶中Ca2+ 含量影响不显著。
NaCl浓度/
(mmol·L−1)Na+/(mg·g−1) K+/(mg·g−1) Mg2+/(mg·g−1) Ca2+/(mg·g−1) 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 0 1.99 ± 0.17 c 0.18 ± 0.02 c 16.52 ± 0.09 a 25.93 ± 0.71 a 2.59 ± 0.08 b 5.03 ± 0.30 a 4.69 ± 0.11 a 23.31 ± 0.62 a 50 5.04 ± 0.42 b 0.55 ± 0.12 b 13.82 ± 0.85 b 26.42 ± 0.39 a 3.08 ± 0.26 ab 4.45 ± 0.36 ab 4.79 ± 0.12 a 21.77 ± 1.01 a 100 9.11 ± 0.95 a 1.00 ± 0.07 a 14.69 ± 0.07 b 26.05 ± 0.15 a 3.36 ± 0.07 a 3.61 ± 0.38 b 4.42 ± 0.11 a 22.39 ± 2.02 a P-Value ** ** * ns * ns ns ns Table 7. The effects of NaCl on ion contents in roots and leaves of R. pseudoacacia
NaCl处理下,刺槐幼苗根和叶中Na+/K+、Na+/Mg2+ 和Na+/Ca2+ 显著升高,且NaCl浓度越高,比值越大(表8)。50 mmol·L−1 NaCl处理使根中Na+/K+、Na+/Mg2+ 和Na+/Ca2+ 分别升高了200.0%、110.3%和150.0%,使叶中Na+/K+、Na+/Mg2+ 和Na+/Ca2+ 分别升高了100.0%、200.0%和100.0%。与0 mmol·L−1 NaCl处理组刺槐相比,100 mmol·L−1 NaCl处理组刺槐根中Na+/K+、Na+/Mg2+ 和Na+/Ca2+ 分别升高了4.2、2.5和3.9倍,叶中Na+/K+、Na+/Mg2+ 和Na+/Ca2+ 分别升高了3.0、6.0和3.0倍。
NaCl浓度/
(mmol·L−1)Na+/K+ Na+/Mg2+ Na+/Ca2+ 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 0 0.12 ± 0.01 c 0.01 ± 0.001 c 0.78 ± 0.09 c 0.04 ± 0.004 c 0.42 ± 0.03 c 0.01 ± 0.001 c 50 0.36 ± 0.01 b 0.02 ± 0.005 b 1.64 ± 0.01 b 0.12 ± 0.017 b 1.05 ± 0.06 b 0.02 ± 0.004 b 100 0.62 ± 0.07 a 0.04 ± 0.003 a 2.70 ± 0.23 a 0.28 ± 0.019 a 2.07 ± 0.27 a 0.04 ± 0.001 a P-Value ** ** ** ** ** ** Table 8. The effects of NaCl on Na+/K+, Na+/Mg2+ and Na+/Ca2+ in roots and leaves of R. pseudoacacia
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对刺槐幼苗根和叶中编码水通道蛋白(TIP1;1,PIP1;1和PIP2;1)及Na+/H + 逆向转运蛋白(NHX1)的mRNA 的表达水平进行分析,结果(表9)表明:在刺槐幼苗根中,50和100 mmol·L−1 NaCl处理使TIP1;1、PIP1;1、PIP2;1和NHX1基因的mRNA 表达水平显著升高,分别是0 mmol·L−1 NaCl处理组的6.4、11.1、28.6、6.4倍和5.6、6.1、14.6、3.2倍;在叶中,与0 mmol·L−1 NaCl处理组刺槐幼苗相比,50 mmol·L−1 NaCl处理对TIP1;1、PIP1;1和NHX1基因的mRNA 表达水平影响不显著,100 mmol·L−1 NaCl处理使TIP1;1、PIP1;1和NHX1基因的mRNA表达水平增加了3.7、1.6和1.3倍,但NaCl处理使PIP2;1基因的mRNA 表达水平显著降低。
NaCl浓度/
(mmol·L−1)TIP 1;1 PIP1;1 PIP2;1 NHX1 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 0 0.98 ± 0.02 b 0.95 ± 0.10 b 1.25 ± 0.19 c 1.61 ± 0.31 b 1.01 ± 0.01 c 0.85 ± 0.11 a 0.97 ± 0.06 c 1.42 ± 0.25 b 50 6.31 ± 0.38 a 1.11 ± 0.11 b 13.88 ± 1.52 a 2.46 ± 0.23 b 28.88 ± 1.60 a 0.34 ± 0.11 b 6.22 ± 0.78 a 2.29 ± 0.30 ab 100 5.45 ± 0.75 a 4.45 ± 0.31 a 7.60 ± 1.00 b 4.15 ± 0.71 a 14.75 ± 1.57 b 0.16 ± 0.07 b 3.12 ± 0.58 b 3.24 ± 0.71 a P-Value ** ** ** * ** ** ** ns Table 9. The expression of aquaporin and Na+ / H + reverse transporter genes in roots and leaves of R. pseudoacacia under NaCl treatments.