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Volume 35 Issue 6
Nov.  2022
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Synergistic Effect of 3-bromopyruvate Combined with Hyphantria cunea Nucleopolyhedrovirus Against Hyphantria cunea (Drury)

  • Corresponding author: WANG Qing-hua, wqh633@caf.ac.cn
  • Received Date: 2022-02-06
    Accepted Date: 2022-07-05
  • Objective In this paper, we used 3-bromopyruvate (3-BrPA) as a biological synergist of Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus (HycuNPV) to investigate the effect of 3-BrPA on the virulence of HycuNPV and the growth and development of Hyphantria cunea, which will provide new synergist resources for the application of HycuNPV insecticides. Method The synergistic effect on HycuNPV was analyzed by adding different doses of 3-BrPA incorporating with HycuNPV in laboratory. Result The bioassay results showed that 3-BrPA had a synergistic effect on HycuNPV. It could not only improve infectivity of HycuNPV, but also increase the insecticidal speed. When the dosages of 3-BrPA with 5.0, 10.0 and 15.0 mg·g−1 were added to HycuNPV, the LC50 of HycuNPV in the 3rd instar larvae of H.cunea decreased. The synergistic ratio (SR) of HycuNPV were 825.14, 164.72 and 0.47, and the co-toxicity coefficients (CTC) were 82613.63, 16579.25 and 147.27, respectively. Different concentrations of HycuNPV had different insecticidal effects under the different doses of 3-BrPA. Added different doses of 3-BrPA, the LT50 of HycuNPV against the larvae were shorten by 3.280~9.724 d. According to SR, CTC, LT50 and ST, the optimum synergistic effect was observed: 5.0 mg·g−1 3-BrPA + 9.0 × 105 OBs·mL−1 HycuNPV. In addition, the combination of 3-BrPA and HycuNPV significantly inhibited the growth and development of larvae, and the pupation and emergence rate of surviving larvae were significantly lower than that of the virus insecticide alone. Conclusion 3-BrPA has a synergistic effect on HycuNPV, and is expected to be an ideal synergistic resource of viral insecticides.
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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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Synergistic Effect of 3-bromopyruvate Combined with Hyphantria cunea Nucleopolyhedrovirus Against Hyphantria cunea (Drury)

    Corresponding author: WANG Qing-hua, wqh633@caf.ac.cn
  • 1. Institute of Forest Ecology, Environment and Nature Conservation, Chinese Academy of Forestry/Key Laboratory of Forest Frotection, State Forestry and Grassland Administration, Beijing 100091, China
  • 2. , Forestry College, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010019, Inner Mongolia, China
  • 3. North China Forestry Experimental Center, Chinese Academy of Forestry, Beijing 102300, China
  • 4. Xinhai Landscape Engineering Co., Ltd., Beijing 100018, China

Abstract:  Objective In this paper, we used 3-bromopyruvate (3-BrPA) as a biological synergist of Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus (HycuNPV) to investigate the effect of 3-BrPA on the virulence of HycuNPV and the growth and development of Hyphantria cunea, which will provide new synergist resources for the application of HycuNPV insecticides. Method The synergistic effect on HycuNPV was analyzed by adding different doses of 3-BrPA incorporating with HycuNPV in laboratory. Result The bioassay results showed that 3-BrPA had a synergistic effect on HycuNPV. It could not only improve infectivity of HycuNPV, but also increase the insecticidal speed. When the dosages of 3-BrPA with 5.0, 10.0 and 15.0 mg·g−1 were added to HycuNPV, the LC50 of HycuNPV in the 3rd instar larvae of H.cunea decreased. The synergistic ratio (SR) of HycuNPV were 825.14, 164.72 and 0.47, and the co-toxicity coefficients (CTC) were 82613.63, 16579.25 and 147.27, respectively. Different concentrations of HycuNPV had different insecticidal effects under the different doses of 3-BrPA. Added different doses of 3-BrPA, the LT50 of HycuNPV against the larvae were shorten by 3.280~9.724 d. According to SR, CTC, LT50 and ST, the optimum synergistic effect was observed: 5.0 mg·g−1 3-BrPA + 9.0 × 105 OBs·mL−1 HycuNPV. In addition, the combination of 3-BrPA and HycuNPV significantly inhibited the growth and development of larvae, and the pupation and emergence rate of surviving larvae were significantly lower than that of the virus insecticide alone. Conclusion 3-BrPA has a synergistic effect on HycuNPV, and is expected to be an ideal synergistic resource of viral insecticides.

  • 美国白蛾(Hyphantria cunea (Drury))属鳞翅目(Lepidoptera)灯蛾科(Arctiidae),是一种极易暴发成灾的世界性的检疫害虫,也是我国重大外来入侵害虫。美国白蛾具有食性杂、适应性强,繁殖量大、危害严重,传播速度快等特点[1-2],2019年被国家林业和草原局列为二级危害性林业有害生物(国家林业和草原局公告2019年第20号)。美国白蛾于1979年首次在我国辽宁丹东地区发现,此后由东向西扩散,到2019年疫区已经扩散至北京、河北、内蒙古、河南、江苏和安徽等13个省(区、市)的598个县级行政区[3];到2020年,发生面积已达74.64万hm2,扩散范围进一步加大,仅疫区就新增11个[4-5];2021年疫区已涉及13个省(区、市)的607个县级行政区(国家林业和草原局公告2021年第7号)。据预测分析,随着气候变化,美国白蛾潜在生境整体向中国北部和内陆湿度较高地区偏移,黑龙江、四川、山西、台湾等地区未来可能成为美国白蛾主要潜在的发生区域[6]。为了减少美国白蛾的危害,人们研究了多种防治药剂,其中化学农药因具有易加工、高效杀死大量个体等特点而在美国白蛾防治中发挥了重要作用,但其所带来的负面影响,如环境污染,易产生药害、抗药性、杀伤天敌、破坏生态系统等问题,促使人们偏向开发和利用安全、高效、可持续的生物防治药剂。

    美国白蛾核型多角体病毒(Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus,HycuNPV)具有毒力强,对寄主专一,对环境和人畜安全,不杀伤天敌等优点,成为美国白蛾生物防治中重要的一种病原微生物杀虫剂[7]。但其自身也有一定的缺陷,如病毒的大量复制只能通过活体繁殖,生产成本和防治成本较化学农药均相对较高;另外,病毒侵染害虫到致病通常需要一定的周期,在该周期内,病虫的取食量几乎不减少,仍会对农林作物造成一定的损失[8-9],这些因素制约了HycuNPV杀虫剂的发展。因此,研究和开发能够提高HycuNPV的杀虫效率、缩短杀虫时间的增效剂资源,成为扩大该病毒杀虫剂推广应用的重要途径[10-12]

    3-溴丙酮酸(3-bromopyruvate,3-BrPA)既是杀菌剂噻菌灵的中间体,也是糖酵解产物中丙酮酸的类似物,对糖酵解途径的限制酶——己糖激酶(hexokinase II,HKII)的活性具有抑制作用[13]。已有研究表明,3-BrPA在医学上可用于抑制肿瘤细胞ATP的产生[14-15],并会抑制真菌的繁殖[16],被称为是一种新型、高效、无污染的生物制剂[17-18]。在病虫害防治方面,高剂量的3-BrPA对秀丽隐杆线虫具有毒性,低剂量的3-BrPA会延长线虫的生长发育时间[18-19];此外,3-BrPA对美国白蛾幼虫生长发育也具有显著的抑制作用[20]。为此,本研究利用3-BrPA作为HycuNPV的生物增效剂,探讨3-BrPA对HycuNPV的毒力影响和对美国白蛾生长发育的影响。以期利用3-BrPA作为HycuNPV的增效剂提高病毒对美国白蛾的杀虫效果,为HycuNPV杀虫剂的广泛应用提供技术支持。

    • 美国白蛾核型多角体病毒(HycuNPV)、美国白蛾3龄幼虫和人工饲料均由中国林业科学研究院林业昆虫病毒研发中心提供,3龄幼虫于温度(25 ± 1)℃,相对湿度(60 ± 10)%,光周期16 L∶8 D的昆虫饲养室中饲养。3-BrPA(纯度≥95%)购自北京爱博森生物试剂有限公司。

    • 美国白蛾3龄幼虫置于养虫杯(Φ 6.3 cm × 5.2 cm)饥饿处理24 h。3-BrPA添加剂量分别为5.0、10.0、15.0、20.0和25.0 mg·g−1时;纯化的HycuNPV悬浮液依次稀释为3.0 × 107、9.0 × 106、3.0 × 106、9.0 × 105和3.0 × 105 OBs·mL−1。将上述3-BrPA与HycuNPV混合加至养虫杯,混合的加入方法具体如下:先将3-BrPA加入每杯含有(20 ± 0.5)g的人工饲料表面,待渗入饲料后,再将HycuNPV悬浮液加入,自然晾干,接入试虫,并设置无菌水为对照组。每组选取健康幼虫10头,重复3次。自接毒后第3 d开始每天记录美国白蛾幼虫死亡症状和死亡数,直至虫体全部死亡或化蛹[21-22]

    • 选取浓度为9.0 × 105和3.0 × 105OBs·mL−1的HycuNPV,并分别添加剂量为5.0、10.0、12.5和15.0 mg·g−1的3-BrPA对美国白蛾3龄幼虫进行接毒,分析不同处理对美国白蛾幼虫的发育历期、化蛹率和羽化率的影响。

    • 应用Excel 2021处理数据,运用SPSS 22.0进行probit分析,分别求出3-BrPA对HycuNPV的致死中浓度(LC50)和致死中时间(LT50),并用单因素方差分析(ANOVA),Tukey test(P<0.05)分析幼虫发育历期、化蛹率和羽化率等[23]

    • 增效作用采用增效倍数(SR)与共毒系数(CTC)来衡量[11],计算公式如下:

      上式(1)中SR的计算和评价参考刘海明与段彦丽等人的方法[11、24],增效倍数(SR)>0,表示为增效作用;(SR)<0,表示为拮抗作用;(SR)=0,表示为无增效作用。

      上式(2)根据复配剂的联合作用划分标准,共毒系数(CTC)≥120,则药剂复配表示为增效作用;若CTC≤80,则表示拮抗作用;若80<CTC<120,则表示为相加作用[25-26]

    2.   结果分析
    • 表1可知,HycuNPV悬浮液在不同剂量的3-BrPA作用下,其毒力出现显著差异。当3-BrPA的添加剂量为0时,仅含有HycuNPV的对照组LC50为4.362 × 105 OB·mL−1;当3-BrPA的添加剂量低于15.0 mg·g−1时,HycuNPV的LC50均低于对照组的LC50;添加15.0 mg·g−1 3-BrPA的HycuNPV与对照组相比,LC50并没有显著的差异。也就是说,随着添加3-BrPA的剂量降低,LC50差异逐步增大。同时根据增效作用计算可知,当3-BrPA的添加剂量分别为5.0、10.0和15.0 mg·g−1时,增效倍数(SR)分别为825.14、164.72和0.47,共毒系数(CTC)分别为82 613.63、16 579.25和147.27。由此可见,添加5.0和10.0 mg·g−1的3-BrPA对HycuNPV具有明显的增效作用,且前者的增效作用最显著。

      处理 TreatmentProbit 回归方程
      Probit structural equation regression
      y=a + bx
      卡方值
      χ2
      自由度
      df
      LC50/
      (OBs·mL−1
      增效倍数
      Synergy ratio
      (SR
      共毒系数
      Co-toxicity coefficient
      (CTC)
      HycuNPV/
      (OBs·mL−1
      3-BrPA/
      (mg·g−1
      HycuNPV--y=−5.164 + 0.916x24.9573.1624.362 × 105
      5.0y=−1.153 + 0.423x19.3083.1625.28 × 102825.1482 613.63
      10.0y=−0.915 + 0.268x12.1723.1622.631 × 103164.7216 579.25
      15.0y=−4.570 + 0.835x15.4013.1622.962 × 1050.47147.27

      Table 1.  Analysis of LC50 and synergistic effects of different treatments on the 3rd instar larvae of H. cunea

    • 不同浓度的HycuNPV悬浮液在不同剂量的3-BrPA作用下的杀虫速度如表2所示。不同浓度的HycuNPV在不同剂量的3-BrPA作用下,其杀虫效果各不相同。在浓度为3.0 × 107 OBs·mL−1的HycuNPV中添加5.0 mg·g−1的3-BrPA,LT50最短(3.112 d),添加10.0 mg·g−1的3-BrPA次之(3.710 d);在浓度为9.0 × 105 OBs·mL−1的HycuNPV中添加5.0 mg·g−1的3-BrPA,LT50缩短时间最长,达9.724 d。

      处理 Treatment卡方值
      χ2
      自由度
      df
      LT50 (95%置信区间)
      (95% CL)/d
      ST/d
      HycuNPV/
      (OBs·mL−1
      3-BrPA/
      (mg·g−1
      0(无菌水)
      5.076.8418.37650.376(37.552~89.993)
      10.079.6668.37629.177(25.600~35.333)
      15.0140.1228.37613.155(11.326~15.302)
      3.0 × 107127.5827.0007.740(6.995~7.462)
      5.0123.8338.1853.112(2.059~3.982)4.628
      10.0103.3068.1853.710(1.882~5.253)4.030
      15.0184.0188.1858.979(7.380~10.479)−1.239
      9.0 × 10625.1397.0007.115(6.713~7.49)
      5.067.7928.18513.291(12.320~14.337)−6.176
      10.088.0028.18518.002(16.646~19.713)−10.887
      15.0214.0108.18510.084(8.111~12.046)−2.969
      3.0 × 10653.5907.00011.187(10.374~12.073)
      5.0124.2578.1854.811(3.604~5.842)6.376
      10.0124.4188.18519.498(17.177~23.090)−8.311
      15.0218.3468.18517.465(15.680~19.865)−6.278
      9.0 × 105112.5637.00014.835(10.97~29.701)
      5.0149.8018.1855.111(3.574~6.405)9.724
      10.0224.0208.1857.765(4.553~10.338)7.070
      15.070.5668.1859.832(8.436~11.290)5.003
      3.0 × 10530.3585.00015.293(11.695~30.359)
      5.068.1257.2118.074(7.306~8.821)7.219
      10.038.2117.21112.013(11.224~12.876)3.280
      15.041.3047.21111.496(10.619~12.459)3.797
      注:ST 表示比对应浓度 HycuNPV中未添加3-BrPA 缩短的LT50
        Note: ST represents the LT50 compared with the corresponding concentration of HycuNPV without 3-BrPA.

      Table 2.  Analysis of LT50 of different treatments on the 3rd instar larvae of H. cunea

      当HycuNPV浓度为3.0 × 107 和3.0 × 106 OBs·mL−1时,添加15.0 mg·g−1的3-BrPA会使LT50延长;添加5.0 mg·g−1的3-BrPA会缩短LT50,相比较对照,分别缩短4.628 d和6.376 d。当HycuNPV浓度为9.0 × 106 OBs·mL−1时,添加3-BrPA均会使LT50延长。当HycuNPV浓度为9.0 × 105和3.0 × 105 OBs·mL−1时,添加3-BrPA均可使LT50明显缩短,且随着3-BrPA添加剂量的降低,LT50的差异逐步增大。

      当3-BrPA的添加剂量为5.0 mg·g−1时,仅有浓度为9.0 × 106 OBs·mL−1的HycuNPV的LT50延长了,其余浓度的HycuNPV的LT50均明显缩短,其中浓度为9.0 × 105 OBs·mL−1的HycuNPV的LT50缩短时间最长(9.724 d)。当3-BrPA的添加剂量为10.0 mg·g−1时,浓度为3.0 × 107、9.0 × 105和3.0 × 105 OBs·mL−1的HycuNPV的LT50缩短了,且浓度为9.0 × 105 OBs·mL−1的HycuNPV的LT50缩短时间(7.070 d)明显长于其余2个浓度(4.030 d和3.280 d)。当3-BrPA的添加剂量为15.0 mg·g−1时,仅有浓度为9.0 × 105和3.0 × 105 OBs·mL−1的HycuNPV的LT50出现缩短。

      综上所述,在一定浓度的HycuNPV中加入低剂量的3-BrPA,会显著提高病毒的杀虫速度。

    • 表3可以看出,不同浓度的HycuNPV悬浮液在不同剂量的3-BrPA作用下,美国白蛾幼虫的3龄发育历期和总发育历期(3龄起)都得到延长。当3-BrPA的添加剂量一定时,浓度为9.0 × 105 OBs·mL−1的HycuNPV感染的美国白蛾幼虫3龄发育历期的延长时间都长于浓度为3.0 × 105 OBs·mL−1;浓度为9.0 × 105 OBs·mL−1的HycuNPV感染的美国白蛾幼虫总发育历期的延长时间与浓度为3.0 × 105 OBs·mL−1的几乎无差异。特别是当3-BrPA的添加剂量为15.0 mg·g−1时,浓度为9.0 × 105和3.0 × 105 OBs·mL−1的HycuNPV感染的美国白蛾幼虫一直未化蛹。

      处理
      Treatment
      3龄发育历期
      Duration of 3rd instar larvae/d
      延长时间
      Extended time/d
      幼虫总发育历期(3龄起)
      Duration of larvae stage(From 3rd instar)/d
      延长时间
      Extended time/d
      HycuNPV/
      (OBs·mL−1
      3-BrPA/
      (mg·g−1
      0(无菌水)3.67 ± 0.333 c9.00 ± 0.577 c
      5.08.67 ± 0.333 b13.00 ± 0.577 b
      10.09.33 ± 0.333 b15.00 ± 0.000 a
      12.510.67 ± 0.333 a16.00 ± 0.577 a
      15.011.67 ± 0.333 a
      3.0 × 1053.67 ± 0.333 c9.33 ± 0.333 c
      5.08.67 ± 0.333 c5.0015.00 ± 0.577 c5.67
      10.09.33 ± 0.333 c5.6615.67 ± 0.333 c6.34
      12.59.67 ± 0.333 c6.0016.33 ± 0.333 c7.00
      15.012.33 ± 0.333 c8.66未化蛹
      9.0 × 1054.00 ± 0.000 c9.67 ± 0.667 c
      5.09.67 ± 0.667 c5.6715.33 ± 0.333 c5.66
      10.09.67 ± 0.333 c5.6716.00 ± 0.000 c6.33
      12.510.33 ± 0.333 c6.3316.67 ± 0.333 c7.00
      15.013.00 ± 0.577 b9.00未化蛹
      注:表中的数据为平均数 ± 标准误,不同字母表示在不同处理下p<0.05水平差异显著。
        Note: The data is average ± standard error in the table, different small letters indicate that the p<0.05 level is significantly different under different treatments.

      Table 3.  Effects of different treatments on the larvae development duration of H. cunea

      当HycuNPV浓度一定时,随着3-BrPA添加剂量的升高,美国白蛾幼虫的3龄发育历期和总发育历期均逐步变长,其中,在HycuNPV浓度为9.0 × 105 OBs·mL−1时,添加剂量为15.0 mg·g−1的3-BrPA后,美国白蛾幼虫3龄发育历期最长,较对照组延长时间高达9.00 d。

    • 在不同浓度的HycuNPV中添加不同剂量的3-BrPA,感染美国白蛾3龄幼虫后的总存活率、化蛹率和羽化率如表4所示。当HycuNPV的浓度为3.0 × 105 OBs·mL−1,仅在3-BrPA剂量为12.5 mg·g−1时,美国白蛾幼虫总存活率为10.00%,化蛹率和羽化率均为33.33%;在3-BrPA其余的添加剂量下,美国白蛾幼虫总存活率都为0,无化蛹,也无羽化。当HycuNPV的浓度为9.0 × 105 OBs·mL−1 时,随着3-BrPA添加剂量的降低,美国白蛾幼虫总存活率逐渐下降,最高为30.00%,最低为13.33%;3-BrPA添加剂量为5.0、10.0和12.5 mg·g−1时,美国白蛾幼虫的化蛹率分别为66.67%、25.00%和44.44%,羽化率分别为22.22%、33.33%和9.52%。

      处理 Treatment幼虫总存活率 ± 标准误差
      Overall survival rate ± SE/%
      化蛹率 ± 标准误差
      Pupation rate ± SE/%
      羽化率 ± 标准误差
      Emergence rate ± SE/%
      HycuNPV/
      (OBs·mL−1
      3-BrPA/
      (mg·g−1
      0(无菌水)83.33 ± 3.333 b92.13 ± 3.955 c91.07 ± 4.495 c
      5.083.33 ± 8.819 b59.29 ± 9.285 c77.78 ± 11.110 c
      10.046.67 ± 8.819 c40.00 ± 13.879 c33.33 ± 33.333 c
      12.533.33 ± 3.333 c33.33 ± 19.246 c0
      3.0 × 10573.33 ± 8.819 b89.68 ± 5.206 c69.44 ± 19.445 c
      5.00
      10.00
      12.510.00 ± 5.774 c33.33 ± 33.333 c33.33 ± 33.333 c
      9.0 × 10530.00 ± 10.000 c62.22 ± 23.201 c61.11 ± 30.932 c
      5.013.33 ± 8.819 c66.67 ± 33.333 c22.22 ± 22.223 c
      10.020.00 ± 11.547 c25.00 ± 14.434 c33.33 ± 33.333 c
      12.530.00 ± 11.547 c44.44 ± 29.397 c9.52 ± 9.523 c
      注:表中的数据为平均数 ± 标准误,不同字母表示在不同处理下p<0.05水平差异显著。
        Note: The data is average ± standard error in the table, different letters indicate that the p<0.05 level is significantly different under different treatments.

      Table 4.  Effects of different treatments on the overall survival rate, pupation rate and emergence rate of larvae

      当3-BrPA的添加剂量一致时,浓度为3.0 × 105 OBs·mL−1 的HycuNPV感染的美国白蛾幼虫总存活率、化蛹率和羽化率均低于浓度为9.0 × 105 OBs·mL−1的HycuNPV。

    3.   讨论
    • 3-BrPA为低毒性杀菌剂,安全性高,对环境无害,有望作为一种理想的昆虫病毒增效剂。已有研究表明,高剂量的3-BrPA对线虫和美国白蛾有毒性作用,且低剂量的3-BrPA可使线虫生长发育历期延长,美国白蛾的生长发育抑制[18-20];但是,都未将3-BrPA作为增效剂与其他生物杀虫剂联合使用。本研究发现3-BrPA能够与HycuNPV联合作用,既提高了HycuNPV的毒力和杀虫速度,又表现出显著的增效作用(表12)。当添加3-BrPA的剂量降低时,对HycuNPV的增效倍数(SR)和共毒系数(CTC)越显著,其中3-BrPA为5.0 mg·g−1时,SR和CTC的值最大。当3-BrPA的添加剂量为5.0 mg·g−1时,仅有浓度为9.0 × 106 OBs·mL−1的HycuNPV的LT50延长了,其余浓度的LT50均明显缩短。其中浓度为9.0 × 105 OBs·mL−1的HycuNPV的LT50缩短时间最长。根据SR、CTC、LC50与LT50综合决定,两者联合的最佳增效配比为:9.0 × 105 OBs·mL−1 HycuNPV + 5.0 mg·g−1 3-BrPA。

      更为重要的是,3-BrPA的添加,使HycuNPV对美国白蛾幼虫的生长发育有显著的抑制作用(表3)。而HycuNPV单剂作用速度慢,即便害虫最终因感染病毒而死,可害虫在感染病毒后较长一段时间内生长发育速度正常,其对寄主的取食量并未减少,当代害虫依然对农林作物造成了严重的危害[27]。因此HycuNPV和3-BrPA的联合应用不仅保证了病毒本身控制作用的发挥,也弥补了其病毒本身的缺陷,从而有效抑制了该害虫对农林作物的危害程度,进而达到减少防治成本和农林作物经济损失的目的。此外,研究还发现,3-BrPA与HycuNPV联合作用对化蛹率和羽化率有一定的影响(表4),加入3-BrPA后化蛹率与羽化率均低于单独饲喂HycuNPV。同单独应用HycuNPV防治美国白蛾幼虫相比,3-BrPA显示出了其作为昆虫病毒增效剂的诸多优越性,可见,3-BrPA有望成为病毒增效剂的理想因子。

    4.   结论
    • 3-BrPA的添加对HycuNPV具有增效作用,为HycuNPV提供新的具有应用前景的增效剂资源。

Reference (27)

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