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CUCs(CUP-SHAPED COTYLEDONs)基因在调控植物营养生长到生殖生长中发挥着核心作用,如参与植物顶端分生组织建成[1];与生长素、miRNA等相互调控影响叶边缘形态[2];通过调控下游LAS(LATERALSUPRESSOR)基因促进腋生分生组织起始,进而影响侧枝发育[3];在拟南芥根外植体培养中,CUC1和CUC2基因表达量可与根形成不定芽的能力成正相关,可见,CUC基因可作为一个预测性标志基因,筛选根形成芽的最佳组培条件[4]。CUC1属于植物特有的NAC家族NAM超家族成员[5],具有NAC家族典型的N端高度保守NAC-domain和C端高度多变序列,NAC-domain是一个包含约150至160个氨基酸[6],分为5个亚结构域(A-E),其中,A、C、D保守性高,B、E保守性低,且D、E是DNA结合所必需的亚结构域[7]。CUC1基因在愈伤组织再生出芽中发挥着重要作用,Daimon等[8]在愈伤组织中过表达CUC1基因,可促使芽的再生率从30%提高到80%。进一步研究表明,通过对CUC亚家族和ATAF1亚家族NAC-domain互换实验中发现,ATAF1的NAC-domain不能诱导愈伤组织再生出芽,这是由于其自身特异的NAC-domain所决定的[9]。Aida等[10]研究中发现,CUC1和CUC2基因双突变体植株可呈现雄蕊、萼片和子叶愈合,很难产生SAM(顶端分生组织)。进一步研究发现,CUC1和CUC2可通过调控STM(SHOOT MERISTEMLESS对于分生组织起始和维持SAM 中心区的未分化细胞是必需的)的表达来决定分生组织中心的建立[11]。如STM首先在CUC基因表达原基的细胞环中表达,当SAM形成时,STM将CUC基因的表达限制在SAM的外周区,进而形成反馈调节环[12]。此外,CUC1基因的表达受到其他转录因子和表观遗传修饰调控,如PLT3(PLETHORA3)、PLT5、PLT7可以促进CUC1的表达[13],ESR1(ENHANCER OF SHOOT REGENERATION1)也可以促进CUC1的表达[14];在离体器官再生过程中,CUC1基因表达与其启动子区和3′端的DNA甲基化修饰水平呈明显负相关性[15],且CUC1的表达也受到了H3K4乙酰化水平调控[16]。目前,CUC1基因的研究大多集中于拟南芥等模式植物,而在木本植物中鲜有研究。
水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)系木犀科(Oleaceae)白蜡树属,是东北地区重要的珍贵用材树种,由于地域特征水曲柳能够耐寒、耐旱、耐盐碱,且木材优良,用途广泛,具有较高的经济价值[17-19]。其作为黑龙江省主要的造林树种,再生困难造成遗传转化效率低的现象一直困扰着育种工作者,而瞬时转化是一种快速有效的遗传转化方法,对研究植物基因功能具有重要意义,如邹全程等[20]利用农杆菌介导刚毛柳(Tamarix hispida)ThCBL4基因瞬时过表达可提高转基因植株耐盐性;Wu等[21]证实,在桑叶中瞬时过表达MaFT基因可能促使桑树(Morus alba L.)早熟开花等。因此,为了提高水曲柳遗传转化效率,解决再生难等问题,可见从分子水平研究再生相关的基因是必要的。本研究从水曲柳中克隆获得了FmCUC1基因,对其分子特征、组织特异性、亚细胞定位进行分析,测定其在不同激素信号下的基因表达情况,同时构建了FmCUC1基因表达载体(pNC-Cam1304-SubC-FmCUC1),利用农杆菌介导水曲柳FmCUC1基因瞬时过表达72 h后,分析比较其通路相关基因表达情况以初步鉴定FmCUC1基因功能。该研究将有助于为水曲柳转基因工作提供新思路。
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试验所用材料均为水曲柳种子种植。将水曲柳种子接种于WPM固体培养基中(pH5.8~6.0),培养于人工气候室(湿度为60%~80%,温度为22 ± 2℃,光照15 h)。以生长30 d,长势均一的实生幼苗为实验材料。根、茎、叶取自30 d组培苗,顶芽取自3年生盆栽苗。
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根据水曲柳CUC1基因的编码区(CDS)设计引物(表1),以生长30 d的水曲柳组培苗cDNA为模板进行FmCUC1基因的PCR扩增(反应体系:上下游引物各1.0 μL,cDNA模板1.0 μL,2 × Es MasterMix 10 μL,ddH2O 7.0 μL。PCR扩增程序为:94℃预变性3 min;94℃变性35 s,56℃退火30 s,72℃延伸30 s,30个循环;72℃延伸2 min,4℃保存)。将目的片段回收纯化,连接至pEASY-T5-Zero载体上,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,将阳性克隆送至擎科生物科技有限公司测序。
引物名称
Primer name引物序列(5′-3′)
Primer sequence(5′-3′)用途
purposeFmCUC1-F ATGGAAAAAGTATCTGGTTTTAGTAGAG 基因克隆 FmCUC1-R TTAACAATTCCAGAGAAAATCAAGG SFmCUC1-F AGTGGTCTCTGTCCAGTCCTATGGAAAAAGTATCTGGTTT 过表达、亚细胞定位 SFmCUC1-R GGTCTCAGCAGACCACAAGTACAATTCCAGAGAAAATCAA QFmCUC1-F TTTGAATTACCTCCTGGATTTCG 实时荧光定量PCR QFmCUC1-R CAGCCTCTGTTGCTCTGTTTGT QFmESR1-F GGCTTGGAACTTTTGACACG QFmESR1-R TGAAGCTATACGAACGGACAAG QFmPLT3-F CAGCCGTTCAACCAGTGTCAGTGT QFmPLT3-R CCGAGGTTCCTGCATTGCTTGACT QFmPLT5-F CCCATAGGAGGCTTGAACAACA QFmPLT5-R ACGGCAGGAGTAGACCACGAAT QFmARR12-F TGACCAGGGACCAGTTAGGAGT QFmARR12-R TGTTTCCATATTGGGACGCC QFmSTM-F GCTCATCCTCATTACCACCGTCTC QFmSTM-R GCTTCCTCAAGTCTTGCCACTACT FmTU-F AGGACGCTGCCAACAACTTT 内参基因 FmTU-R TTGAGGGGAAGGGTAAATAGTG Table 1. Primer sequence and Application
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根据FmCUC1基因序列分析其理化性质、亲疏水性、保守结构域及构建系统进化树,具体操作步骤参考郭依萍等[22]。
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根据FmCUC1基因CDS序列设计引物(表1),以阳性克隆质粒为模板进行PCR扩增,将扩增产物回收纯化后使用Nimble Cloning MIX试剂将其连接至pNC-Green-SubC表达载体中,构建植物表达载体pNC-Green-SubC-FmCUC1,将阳性菌液送至擎科生物科技有限公司测序。将检测正确的pNC-Green-SubC-FmCUC1质粒转化农杆菌GV3101感受态细胞。利用农杆菌介导法分别将pNC-Green-SubC-FmCUC1和空载pNC-Green-SubC转入到洋葱内表皮细胞中,使用荧光共聚焦显微镜观察并照相。
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分别以水曲柳根、茎、叶、顶芽组织为cDNA模板,以水曲柳微管蛋白FmTU[23]为内参基因对FmCUC1基因表达进行荧光定量PCR。
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以水曲柳下胚轴和种子为实验材料,分别在培养6、12、18、24、30、36 d与接种0、3、4、5、7、8、10、14、18、21 d进行取样,待取样完毕后,使用Tris-CTAB法提取RNA,反转录,对水曲柳下胚轴芽再生与种子萌发过程中FmCUC1基因表达进行荧光定量PCR。
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分别对长势均一的组培苗喷施6-BA(100 μmol·L−1)、BR(1 μmol·L−1)、IAA(100 μmol·L−1)激素处理,每个处理设3个重复,每重复5株水曲柳苗,于0 h、10 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h进行整株取样。对8个取样点FmCUC1表达进行荧光定量PCR。
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以阳性克隆质粒为模板进行PCR扩增,将扩增产物回收纯化后使用Nimble Cloning MIX试剂[24]将其连接至pNC-Cam1304-SubC表达载体中,构建植物表达载体pNC-Cam1304-SubC-FmCUC1,将阳性菌液送至擎科生物科技有限公司测序。将检测正确的pNC-Cam1304-SubC-FmCUC1质粒转化农杆菌GV3101感受态细胞,保存菌种备用。
利用农杆菌介导的瞬时转化法,方法参照杨少彤等[25];将pNC-Cam1304-SubC-FmCUC1-GV3101和转化液(对照)分别对生长30 d的整株水曲柳组培苗进行瞬时侵染。为了检验FmCUC1基因及其通路的ESR1(ENHANCER OF SHOOT REGENERATION1)、PLT3(PLETHORA3)、PLT5(PLETHORA5)、B型ARR12(ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATOR12)、STM(SHOOT MERISTEMLESS)基因表达情况,提取72 h的FmCUC1瞬时过表达植株的总RNA,进行荧光定量PCR。
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每个实验至少3次生物学重复;基因相对表达量使用7500 Software v 2.0.6软件获取,按照基因相对定量法(2−ΔΔCt)对基因相对表达量进行计算;利用SPSS version 22.0 软件采用Duncan’s多重比较法进行显著性分析。
Cloning and Transient Expression Analysis of CUC1 Gene from Fraxinus mandshurica Rupr.
- Received Date: 2021-03-15
- Accepted Date: 2021-09-18
- Available Online: 2022-02-20
Abstract: