银杏种胚蛋白提取及双向电泳体系的优化
Embryo Protein Extraction from Ginkgo biloba and Optimization of Two-Dimensional Electrophoresis
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摘要: [目的] 探索一套适用于银杏种胚蛋白的双向电泳体系,为研究银杏种胚在不同发育阶段的表达差异蛋白提供基础。[方法] 分别从蛋白的不同提取方法(直接提取法、酚提取法、Tris-HCl法、Trizol提取法和TCA-丙酮-酚法)、裂解液中的尿素浓度(6 mol·L-1、7 mol·L-1、8 mol·L-1、9 mol·L-1)蛋白上样量(1500 μg、1650 μg、1800 μg)和分离胶浓度(10%、12.5%、15%)四个方面对银杏种胚的蛋白图谱进行分析,筛选出适宜双向电泳的条件。[结果] 采用TCA-丙酮-酚法提取银杏种胚蛋白,在裂解液中尿素浓度为8 mol·L-1、上样量为1650 μg、分离胶浓度为12.5%的方法,可以获得分辨率较高、背景更加清晰、重复性更好的银杏种胚蛋白质双向电泳图谱。[结论] 建立了适合银杏种胚蛋白双向电泳的体系:TCA-丙酮-酚法制备样品,选取尿素浓度为8 mol·L-1的裂解液提取样品粉末全蛋白,蛋白上样量控制为1650 μg,第二向分离胶浓度定为12.5%。Abstract: [Objective] A two-dimensional (2-DE) electrophoresis system was explored for proteomic analysis of Ginkgo biloba embryo, aiming at laying a foundation for studying the differences in protein expression at different developmental stages.[Method] The 2-DE gels were involved with different protein extraction methods (direct extraction method, phenol extraction method, Tris-HCl method, Trizol extraction and TCA-acetone-phenol method), different concentrations of urea in lysis buffer (6 mol·L-1, 7 mol·L-1, 8 mol·L-1, and 9 mol·L-1), different protein loading dosages (1500 μg, 1650 μg, and 1800 μg) and different separation gel concentrations (10%, 12.5%, and 15%), to select the suitable condition.[Result] The optimized system includes the following steps:extracting total protein from G. biloba embryo by TCA-acetone-phenol method,dissolving proteins with lysis buffer containing 8 mol·L-1 urea,1650 μg of protein loading dosage and running SDS-PAGE with 12.5% gel concentration. Reproducible profiles with high resolution and clean background were obtained by this optimized two dimensional electrophoresis of embryonic total protein.[Conclusion] The optimized 2-DE electrophoresis system suitable for the separation of embryonic total protein from G. biloba was established, which is:extracting total protein by TCA-acetone-phenol method,dissolving proteins with lysis buffer containing 8 mol·L-1urea, 1650 μg of protein loading dosage and running SDS-PAGE with 12.5% gel concentration.
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Key words:
- Ginkgo biloba
- / embryo
- / protein
- / two-dimensional electrophoresis
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