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花色是观赏植物重要的园艺性状，也是吸引传粉者的主要因素[1-3]。花青素苷对植物呈色起重要作用[4]。在其生物合成途径中，二氢黄酮醇4-还原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）是下游阶段的关键酶，可催化二氢黄酮醇还原为无色花青素苷元，进而转变成橙色到砖红色的天竺葵素糖苷、红色的矢车菊素糖苷和蓝色到紫色的飞燕草素糖苷，与花色的产生直接相关[4]。目前， DFR 基因的克隆及其功能分析已在亚洲百合（Lilium Asiatic hybrids）[5]、玫瑰（Rosa rugosa Thunb.）[6]、牵牛花（Ipomoea nil (L.) Roth.）[7]、一品红（Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch）[8]、马樱杜鹃（Rhododendron delavayi Franch.）[9]和橙花龙胆（Gentiana lutea L. var. aurantiaca (M. Laínz) M. Laínz）[10]等多种观赏植物中得到研究。
对不同植物的研究发现，DFR在转录水平上的调控机制十分复杂，受光照、温度、激素等一系列外部环境和内部因子的影响。孟祥春等[11]研究发现经过短暂光照处理的非洲菊（Gerbera hybrida Hort.）花青素苷含量及DFR基因表达量均显著增加，且基因表达水平与光照时间呈正相关。在芜菁（Brassica rapa L.）中，与花青素苷积累相关的BrDFR对冷胁迫表现出明显响应[12]。紫花苜蓿（Medicago sativa L.）[13]、欧洲油菜（Brassica napus L.）[14]和金鱼草（Antirrhinum majus L.）[15]中的 DFR基因可分别响应干旱、盐和植物激素等非生物胁迫，转录水平发生明显变化。
牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）是我国的传统名花，具有极高的观赏价值和经济价值。研究表明，PsDFR在牡丹花色形成中起重要作用[16-18]，不仅作为转录因子PsbHLH1的靶基因参与调控花青素苷的生物合成，还可能与转运蛋白PsGSTF3互作，与花青素苷的转运和积累相关 [19-20]。启动子是位于结构基因上游的一段DNA序列，包含控制基因表达的多种调控元件，能够特异性结合RNA聚合酶，在基因表达调控中起核心作用[21]。开展启动子研究对于理解基因的时空表达模式[22]、环境响应机制[23]等具有重要意义。
本研究利用染色体步移法从牡丹花瓣中克隆了PsDFR的启动子序列，对其顺式作用元件进行了分析，探究了不同长度缺失启动子的活性及其对ABA、MeJA、光照等不同胁迫处理的响应，并初步确定了相关调控区域，为进一步研究PsDFR启动子的功能及其在牡丹花色形成中的转录调控机制提供参考。
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以‘黑花魁’牡丹（P. Suffruticosa ‘Hei Hua Kui’）盛花期花瓣为试材。于4月中下旬，取自中国林业科学研究院玉泉山牡丹资源圃，用锡箔纸包好，经液氮速冻后，保存于–80 ℃超低温冰箱。大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101 购自北京天根生化科技有限公司。烟草（Nicotiana benthamiana）野生型为本实验室保存，在 23 ℃、16 h/8 h 光暗周期下生长。
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参照北京天根生化科技有限公司Plant Genomic DNA Kit说明书提取‘黑花魁’花瓣基因组DNA。根据课题组已克隆的PsDFR基因cDNA序列（Accession No：HQ283448）及前期获得的牡丹花瓣转录组数据库（Accession No：PRJNA594258），利用生物学软件Primer Premier 5.0设计特异引物 PsDFR-F/PsDFR-R（表1），用于PsDFR 基因的gDNA 全长序列扩增。根据测序得到的DNA 序列，在启动子下游不同位置设计3 条特异性嵌套反向引物SP1、SP2、SP3（表1），以花瓣基因组DNA 为模板，按照TaKaRa 公司的Genome Walking Kit 说明书，连续开展3 轮PCR 扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收清晰条带，连接到pMD-19T载体上并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取转化平板上的白色菌落进行培养，通过菌液PCR和质粒酶切鉴定阳性克隆后，委托生工生物公司（上海）测序。
表 1 PsDFR 启动子克隆和活性分析相关引物
Table 1. The primers used in cloning and functional analysis of PsDFR promoters
用途
Usage引物名称
Primer name引物序列（5'−3'）
Primer sequencePsDFR启动子克隆
Cloning of PsDFR promoter sequencePsDFR-F ATGGAGGTAGAAAGAGTTCAGTCA PsDFR-R TTACTGGGGAAGCTTGTTGAGCTT SP1 CACTTCATTCTCAGGGTCCTTGG SP2 CCACAGGGTCAAATGGGTATCC SP3 ATTCTCTGGATCCCGCACCGTG PsDFR系列缺失片段构建
Construction of PsDFR series deletion fragments1301-PsDFRp0-F tcctctagagtcgacctgcagTTGTCGACTACGGAAGCAG 1301-PsDFRp0-R ttaccctcagatctaccatggTTGCTTTTGTTTTTTAAC PsDFR(1287)-F tcctctagagtcgacctgcagTTTGAATTAGTTTGTTTTAAT PsDFR(980)-F tcctctagagtcgacctgcagTTCGTCATCTTTCTCTTCCT PsDFR(507)-F tcctctagagtcgacctgcagGAAATAACCACCTGCAGTT PsDFR(140)-F tcctctagagtcgacctgcagCAGCTGGTGAGTTGATCACG 注：1301-PsDFRp0-R和5条正向引物分别配对扩增产生不同长度的PsDFR启动子片段
Note: 1301-PsDFRp-R and 5 forward primers were paired and amplified to generate PsDFR promoter fragments of different lengths利用在线软件PlantCARE（
http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/ ）和PLACE（https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace ）分析启动子序列所包含的调控元件，并用TBtools软件绘制各顺式作用元件分布图；通过TSSP在线网站（http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=tssp&group=programs&subgroup=promoter ）预测转录起始位点。 -
根据PsDFR启动子的全长序列，设计了5′端分别含有相应侧翼序列和酶切位点的扩增引物1301-PsDFRp0-F和1301-PsDFRp0-R（表1），以包含全长启动子序列的质粒为模板，通过同源重组方法将PsDFR 启动子构建至pCAMBIA1301-GUS 表达载体上。根据 PsDFR启动子顺式作用元件的分布情况，设计了4条启动子系列缺失引物，分别命名为PsDFR(1287)-F、PsDFR(980)-F、PsDFR(507)-F和PsDFR(140)-F（表1）。以上述构建好的PsDFR全长启动子重组质粒为模板，以1301-PsDFRp0-R为共用反向引物，通过同源重组方法，构建了不同长度启动子片段的pCAMBIA1301-GUS 融合表达载体。最后，对含有 5 个不同长度启动子片段，即1 687 bp （−1 623 至 + 64）、1 287 bp （−1 223 至 + 64）、980 bp（−916 至 + 64）、507 bp（−443 至 + 64 ）和140 bp（−76 至 + 64）的重组质粒进行菌液PCR和测序验证后，用于启动子瞬时表达分析。
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将构建好的5个不同长度启动子融合表达载体的质粒分别转化到农杆菌GV3101中。菌液PCR验证后，取2 mL接种于50 mL LB液体培养基（含50 mg·L−1 Rif 、50 mg·L−1 Kan和25 mg·L−1 Gen）中过夜培养至OD600=1.0 左右。离心收集菌体，用悬浮液（含10 mmol·L−1 MgCl2、10 mmol·L−1 MES和100 μmol·L−1 AS）重悬至OD600约等于0.6，室温避光静置3 h以上后，取2 mL分别注射到4～5叶期的烟草叶片中。72 h后取侵染后的叶片放入GUS 染色液进行组织化学染色。70%乙醇浸泡脱色后拍照记录。以注射pCAMBIA1301-35S-GUS 空载体的叶片为阳性对照，注射无菌水的叶片为阴性对照。
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为分析PsDFR 启动子对不同激素的响应，取不同菌液注射2 d后的烟草植株，对其叶片正反面分别喷洒外源茉莉酸甲酯（MeJA，100 μmol·L−1）和脱落酸（ABA，100 μmol·L−1）直到叶面呈滴水状态，其中MeJA喷洒后进行套袋密闭处理。以喷洒清水的烟草叶片为对照，每组设置5个重复，处理24 h后取样（每12 h 追加喷洒一次）。同时，为了解启动子对光照诱导的响应，对侵染2 d 后的烟草植株分别进行暗培养24 h后取样，以及暗培养24 h后恢复全光照培养12 h 后再取样两种处理。每组设置5个重复。所有样品经液氮速冻后，置于–80 ℃冰箱保存。参照阴霞等[24]的方法，利用荧光分光光度计检测GUS 酶活。
运用SPSS19.0的Duncan’s新复极差法进行显著性分析。
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以牡丹基因组DNA 作为模板，利用染色体步移法进行3 次巢式PCR 后，扩增到1 条长为1 687 bp 的目的片段（图1）。生物信息学预测结果显示，PsDFR启动子含有多个CAAT-box，转录起始位点位于翻译起始密码子ATG上游63 bp 处。转录起始位点上游16 bp处有一个TATA-box结构（图2）。
图 1 牡丹PsDFR启动子的 PCR 扩增
Figure 1. PCR production of PsDFR promoter from tree peony
图 2 PsDFR基因启动子序列
Figure 2. The sequence of the PsDFR promoter
如表2、图3所示，PsDFR启动子除含有核心启动子元件TATA-box 和CAAT-box外，还包含参与大多数植物启动子转录起始过程的Inr 元件INRNTPSADB和大量光调控元件，有G-Box、Box 4、GA-motif、GATA-motif、TCCC-motif 、TCT-motif、GT1-motif、I-Box、SORLIP1AT和TBOXATGAPB等，以及多个激素和胁迫响应相关元件。其中，激素响应元件包括：ABA响应元件ABRE和DPBFCOREDCDC3；细胞分裂素诱导相关元件ARR1AT；乙烯诱导相关元件ERE；GA响应元件GARE-motif和TATCCAOSAMY；茉莉酸甲酯响应元件TGACG-motif等。逆境胁迫响应元件包括：水分胁迫相关响应元件ACGTATERD1和CBFHV；低温响应元件CRTDREHVCBF2以及受伤和病原体应答相关元件W box等。值得注意的是，其他作用元件中类黄酮生物合成相关的调控元件或转录因子识别位点MYBCORE、MYBPLANT和MYCCONSENSUSAT多达17个。这些元件的存在表明PsDFR在牡丹花青素苷的生物合成中发挥重要作用，并可能在转录水平上受到光照、激素（如GA、ABA、乙烯）和非生物胁迫（如干旱、低温）等多种因素的调节。此外，在PsDFR 启动子序列中还发现了叶肉细胞特异表达作用元件 CACTFTPPCA1、花粉特异激活元件POLLEN1LELAT52和GTGANTG10等控制基因器官特异表达的作用元件，说明PsDFR 在植物体内的表达可能具有一定的器官特异性。
表 2 应用PlantCARE和 PLACE 预测 PsDFR启动子区顺式作用元件特性
Table 2. cis-acting regulatory elements characteristic of PsDFR promoters by PlantCARE and PLACE
元件种类
Element type基序名称
Motif name基序（5′-3′）
Motif（5′-3′）数量
No.功能
Function核心启动子
Core promoterCAAT-box CAAT
CAAAT8
3启动子和增强子区调控元件
Common cis-acting element in promoter and enhancer regionsTATA-box TATA/TATAAA 5/1 转录起始-30核心启动子元件
Core promoter element around -30 of transcription startINRNTPSADB YTCANTYY 3 Inr（initiator） elements 光调控
Light regulatoryBox 4 ATTAAT 1 参与光响应的保守DNA模块的部分元件
Part of a conserved DNA module involved in light responsivenessG-Box CACGTG（T） 8 参与光响应的元件
Element involved in light responsivenessGA-motif ATAGATAA 1 部分光应答元件
Part of a light responsive elementGATA-motif GATAGGA 7 部分光应答元件
Part of a light responsive elementTCCC-motif TCTCCCT 1 部分光应答元件
Part of a light responsive elementTCT-motif TCTTAC 1 部分光应答元件
Part of a light responsive elementGT1-motif GGTTAA 5 光应答元件
Light responsive elementI-Box GATAAG 6 部分光应答元件
Part of a light responsive elementSORLIP1AT GCCAC 2 参与光响应的元件
Element involved in light responsivenessTBOXATGAPB ACTTTG 1 参与光响应的元件
Element involved in light responsiveness激素相关
Hormone
responseABRE ACGTG 13 ABA响应元件
Element involved in the abscisic acid responsivenessARR1AT NGATT 14 细胞分裂素诱导相关元件 Induced by cytokinin DPBFCOREDCDC3 ACACNNG 3 ABA诱导相关元件 Induced by ABA ERE AWTTCAAA 1 乙烯诱导相关元件 Induced by ethylene GARE-motif TAACAAR 6 赤霉素响应元件 GA-responsive element TGACG-motif AACGTG 3 茉莉酸甲酯响应元件
Element involved in the MeJA-responsivenessT/GBOXATPIN2 AACGTG 3 茉莉酸响应元件
Element related to jasmonate signalingTATCCAOSAMY TATCCA 1 糖和赤霉素诱导相关元件 Induced by sugar and GA 逆境胁迫
Stress responseW box TGAC 13 诱导子、受伤及病原体应答，结合WRKY类转录因子
Inducer, injury and pathogen responses, combined with
WRKY transcription factorsACGTATERD1 ACGT 14 脱水胁迫诱导相关元件 Induced by dehydration stress CBFHV RYCGAC 2 失水响应元件
Element involved in dehydration-responsivenessCRTDREHVCBF2 GTCGAC 2 低温响应元件
Element involved in low temperature-responsiveness组织特异表达
Tissue specific expressionCACTFTPPCA1 YACT 17 叶肉细胞特异表达元件 Mesophyll specific element GTGANTG10 GTGA 14 花粉特异表达相关元件 Pollen specific element POLLEN1LELAT52 AGAAA 10 lat52 基因花粉特异激活元件
Element responsible for pollen specific activation of lat52 gene其它 Others MYBCORE CNGTTR 3 类黄酮生物合成调控元件
Element involved in the regulation of flavonoid biosynthesisMYBPLANT MACCWAMC 2 植物MYB结合元件
Binding site of plant MYB，known as flower-specific
protein activating flavonoid biosynthesisMYBPZM CCWACC 1 花青素苷合成的诱导元件 Induced by anthocyanin biosynthesis MYCCONSENSUSAT CANNTG 12 MYC/bHLH 识别位点
Binding site of MYC/bHLH, known as protein regulating flavonoid biosynthesisCARGCW8GAT CWWWWWWWWG 4 MADS-box 特异结合位点 Binding site of MADS-box CIACADIANLELHC CAANNNNATC 4 昼夜节律响应元件 Element involved in circadian 
图 3 PsDFR启动子顺式作用元件分布图
Figure 3. Distribution map of the cis-elements of PsDFR promoter
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5 个不同长度的缺失片段（图4）是根据PsDFR启动子顺式作用元件预测结果，从转录起始位点上游1 623 bp 的5′端对启动子序列进行逐步删除，最终获得：1687 bp（P0，−1623 至 + 64）、1287 bp（P1，−1223 至 + 64）、980 bp（P2，−916 至 + 64）、507 bp（P3，−443 至 + 64 ）和140 bp（P4；−76 至 + 64）。
图 4 PsDFR启动子缺失片段
Figure 4. Schematic diagram of the PsDFR promoter deletions
利用同源重组的方法将获得的PsDFR启动子全长序列P0构建到pCAMBIA1301-GUS 表达载体上，菌液PCR和测序结果证明该序列已经替换了原有的35S 启动子并与GUS基因融合（图5），重组质粒被命名为pCAM-PsDFRp0。以该质粒为模板，通过同样的方法，经菌液PCR和测序验证，获得了另外4个不同缺失片段的pCAMBIA1301-GUS 融合表达载体pCAM-PsDFRp1、pCAM-PsDFRp2、pCAM-PsDFRp3和pCAM-PsDFRp4（图5）。
图 5 PsDFR启动子及其缺失片段的融合表达载体验证
Figure 5. Verification of PsDFR promoter and deletion fragment fusion expression vector
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为研究PsDFR启动子各区域的表达活性，将含有不同缺失片段的融合表达载体分别转化农杆菌后，注射至烟草叶片中进行GUS组织化学染色分析。结果由图6所示，注射无菌水的阴性对照的叶片没有染色，而由启动子CaMV35S驱动的阳性对照GUS染色最明显。在不同PsDFR启动子缺失片段的瞬时表达中，随着启动子5′端序列的缺失，染色程度由深到浅变化，染色部位也越来越小。特别是全长启动子P0在相继缺失了−1 623至−1 223（P1）以及−1 223至−916（P2）之间的区域后，缺失材料的GUS染色明显变浅，最后仅在叶脉周围观察到稀疏分散的蓝色斑点，表明5 个缺失片段均具有启动子活性，但活性随片段的缩短而减弱，−1 623至−916之间的区域对于其活性具有重要作用。
图 6 PsDFR启动子缺失片段瞬时转化烟草染色结果
Figure 6. Detection of transient expression of different PsDFR promoter deletion regions in tobacco leaves
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对不同农杆菌侵染48 h 后的烟草分别进行ABA、MeJA、黑暗和光照处理后，检测叶片GUS 活性，结果如图7所示，对照中，GUS活性随启动子缺失片段的缩短而不断降低，这与染色结果（图6）相一致。黑暗处理后，所有启动子缺失片段诱导的GUS酶活性均受到不同程度抑制，恢复光照后，除P4外其余启动子活性均有显著升高（p<0.05）；ABA处理明显抑制了P0和P1下游GUS的表达活性，与对照相比，分别下降了51.85%和56.12%，但随着5′端序列的逐渐缺失，ABA对启动子P2的抑制作用明显降低，并反而促进了P3的启动子活性，约达对照的1.28倍；MeJA明显抑制了不同启动子片段诱导的GUS活性，与对照相比，均下降了40%以上。
图 7 光照和激素诱导下PsDFR启动子缺失片段驱动的GUS活性分析
Figure 7. Analysis of the GUS activity driven by PsDFR promoter deletion regions in response to light and hormone treatments
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本研究利用染色体步移法从牡丹花瓣中分离到PsDFR基因长1 687 bp的启动子序列。该序列位于转录起始位点上游的−1 623 bp处，除了包含调控转录起始精确度和效率的核心启动子元件外，还具有光响应元件、激素和逆境胁迫相关元件以及组织特异性表达相关元件等。
前期研究发现，随着花朵的着色，PsDFR基因的表达量与花青素苷的含量呈正相关，并且在花瓣中特异高表达，在叶片、萼片、雄蕊和心皮中的表达水平很低[16,25]。然而，除一些花粉特异激活元件外，在PsDFR启动子中未发现其他花器官相关特异元件。Roh 等[26]通过启动子缺失发现，花瓣特异性启动子PISTILLATA（BnPI）中的光响应元件G-box 可能与花瓣特异性表达有关。Imai 等[27]发现在菊花（Dendranthema morifolium (Ramat.) Tzvel.）CmCCD4a的ATG 上游存在一些与花瓣特异性表达相关的未知顺式元件。在非洲菊中，不同花器官间的着色差异与DFR启动子的结构无关，而是由调控其表达的上游转录因子启动子上的空间特异性顺式作用元件调控的[28]。因此，为了明确哪些顺式元件在PsDFR的花瓣特异性高表达中起重要作用，还需对其启动子或与其互作的转录因子启动子进行更全面、细致的片段缺失分析。
在启动子缺失片段的GUS染色分析中，发现不同区域的PsDFR启动子表达活性具有明显差异。全长启动子片段（P0）活性最高，但随着5'端序列的逐步缺失，活性不断降低。特别是删除-1 623至-916之间707 bp的片段后，启动子活性迅速下降，推测该片段中可能含有与启动子活性相关的核心元件。根据顺式元件分析结果，发现该片段包含2个Inr元件（INRNTPSADB）。Nakamura等[29]证实该元件可在缺乏TATA-box的情况下对转录激活起关键作用。在PsDFR启动子中，Inr元件是否在TATA-box存在的情况下也具有激活转录起始的作用，还有待进一步研究。
光照是影响植物合成花青素苷的重要环境因子之一，不同光质、光照强度和光周期信号可通过促进或抑制类黄酮合成相关基因的表达，调控花青素苷的合成和积累。Hartmann等[30]在拟南芥（Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.）CHS启动子区域发现了一个由G-Box核心元件（ACGT）和MYB识别元件（ACCWACCNN）组成的光响应单元LRU。小麦（Triticum aestivum L.）TaDFR-B在花青素苷积累的部位高表达，并受光诱导明显上调，也与其启动子中包含这两个元件有关[31]。本研究中，PsDFR启动子也含有该元件组合（G-Box和MYBPZM），并同时具有Box4、GA-motif、TCT-motif、GT1-motif、I-Box等多个光响应元件。光处理后，不同启动子缺失片段对光照变化均有明显响应，即在黑暗条件下启动子活性降低，恢复光照后启动子活性升高，这与Gollop 等[32]对葡萄（Vitis vinifera L.）DFR启动子的研究结果一致，推测这些元件在牡丹花青素苷生物合成对光照的响应中起重要作用。
除光照外，DFR在表达过程中还受ABA、MeJA等多种激素影响。如ABA可上调草莓（Fragaria ananassa Duch.）[33]和葡萄[34] 果实中DFR的表达水平，进而促进花青素苷的积累；红肉苹果（Malus sieversii f. niedzwetzkyana (Dieck) Langenf.）MdDFR的转录受MeJA正调控，但受ABA负调控[35]。目前，关于激素如何影响牡丹DFR的表达以及DFR的启动子活性如何响应激素处理的报道很少。在PsDFR启动子中，发现了典型的ABA响应元件ABRE和DPBFCOREDCDC3以及MeJA响应元件TGACG-motif和T/GBOXATPIN2。ABA处理抑制了P0和P1的启动子活性，但对启动子缺失片段P2的抑制作用明显降低，而P3的启动子活性显著高于对照，推测这与启动子-443至-76 bp序列区段存在ABA应答相关元件有关，且-1 623至-916 bp之间可能存在抑制ABA响应的未知元件。在MeJA方面，尽管MeJA处理通常被认为可促进花青素苷的积累[36]，但在拟南芥、甘薯（Ipomoea batatas Lam.）等植物中发现，受糖信号、品种及组织特异性或处理浓度的影响，MeJA处理也会对DFR基因的表达及花青素苷合成起抑制作用 [37-38]。本研究中，MeJA处理后各缺失片段的启动子活性均有明显下降，推测100 μmol·L−1 MeJA在‘黑花魁’牡丹花青素苷的合成中可能起负调控作用。
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DFR是植物花青素苷生物合成下游阶段的关键酶。本研究通过染色体步移法分离了牡丹PsDFR基因长1 687 bp的启动子序列。顺式作用元件分析结果表明PsDFR的表达可能受光信号、激素和胁迫等多种信号的共同调节。通过对瞬时转化烟草叶片的GUS组织化学染色和酶活性进行分析，明确了PsDFR启动子活性受光的正调控以及MeJA的负调控；-1 623至-916 bp间的区域对于启动子活性具有重要作用，-443至-76 bp是响应ABA处理的核心区域。上述结果为进一步揭示PsDFR响应不同环境信号参与牡丹花色形成的调控机制提供参考。
牡丹花青素苷合成关键基因PsDFR启动子活性分析
Promoter Functional Analysis of the Key Gene PsDFR Involved in Paeonia suffruticosa Anthocyanin Biosynthesis
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摘要:
目的 分析牡丹花青素苷合成关键基因PsDFR启动子的顺式作用元件及活性，为进一步研究PsDFR启动子的功能及其在牡丹花色形成中的调控机制奠定基础。 方法 以‘黑花魁’牡丹花瓣中提取的基因组DNA为模板，通过染色体步移法克隆PsDFR的启动子序列。利用生物信息在线软件预测分析启动子序列的顺式作用元件。构建5个不同长度缺失启动子与GUS基因融合的表达载体，并瞬时转化烟草叶片，通过GUS组织化学染色和酶活性检测分析缺失启动子的活性，及其对脱落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、光照等不同胁迫处理的响应。 结果 克隆得到PsDFR上游1 687 bp的启动子序列。生物信息学分析发现PsDFR启动子含有多个光信号、激素响应、逆境响应及组织特异表达等顺式作用元件，这暗示PsDFR的表达可能受光信号、激素和胁迫等多种信号的共同调节。GUS组织化学染色和酶活性检测表明，随启动子片段的缩短，启动子活性逐渐下降，-1 623至-916区段对于启动子活性具有重要作用。MeJA和黑暗处理对各启动子片段活性均有显著抑制作用，恢复光照可促使启动子活性明显回升，而参与ABA响应的核心调控区域位于-443至-76 bp。 结论 PsDFR启动子含有多个光信号、激素响应、逆境响应及组织特异表达等顺式作用元件，其活性受光的正调控以及MeJA的负调控；-1 623至-916 bp间的区域对于启动子活性具有重要作用，-443至-76 bp是响应ABA处理的核心区域。该研究为进一步揭示PsDFR应答环境信号参与牡丹花色形成的分子调控机制提供参考。 Abstract:Objective To analyze the cis-acting element and activity of the tree peony anthocyanin biosynthetic key gene PsDFR promoter for further research on its function and regulation mechanism involved in tree peony flower coloration. Method The genomic DNA extracted from the petals of tree peony ‘Hei Hua Kui’ was used as a template. PsDFR promoter was isolated by genomic walking method. The cis-acting elements of promoter were analyzed and predicted through Bioinformatics online software. Five different length of deletion fragments were fused with GUS gene to construct promoter-reporter vectors, and then were transiently expressed in tobacco leaves. The activities of deletion promoters and their response to different stress treatments such as Abscisic acid (ABA), Methyl jasmonate (MeJA) and light were analyzed by GUS staining and GUS activity assay. Result A 1 687 bp sequence of PsDFR promoter was isolated. The results of bioinformatics analysis showed that the promoter contains multiple cis-acting elements associated with light signals, hormone response, stress response, and tissue-specific expression, indicating that the expression of PsDFR may be regulated by various signals such as light signaling, plant hormone and stress. GUS staining and quantitative analysis of GUS activity showed that GUS activities decreased gradually with decrease of the length of PsDFR promoters, and the region of -1 623 bp to -916 bp played an important role on the activity of the PsDFR promoter. The GUS activities were inhibited significantly by MeJA or dark treatment, and were induced obviously after light restoration. And core regulation region involved in ABA-response might be located between -443 and -76 bp. Conclusion PsDFR promoter contains multiple cis-acting elements associated with light signals, hormone response, stress response, and tissue-specific expression. Its activity is positively regulated by light and negatively regulated by MeJA. The region of -1 623 bp to -916 bp is important for the activity of the PsDFR promoter, and -443 and -76 bp is the core region in response to ABA treatment. This study provides a reference for further revealing the regulatory mechanism of PsDFR response to environmental signals involved in tree peony flower coloration. -
Key words:
- Paeonia suffruticosa
- / anthocyanin
- / PsDFR
- / promotor
- / cis-acting elements
- / promoter activity
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图 3 PsDFR启动子顺式作用元件分布图
Figure 3. Distribution map of the cis-elements of PsDFR promoter
图 5 PsDFR启动子及其缺失片段的融合表达载体验证
Figure 5. Verification of PsDFR promoter and deletion fragment fusion expression vector
图 6 PsDFR启动子缺失片段瞬时转化烟草染色结果
Figure 6. Detection of transient expression of different PsDFR promoter deletion regions in tobacco leaves
图 7 光照和激素诱导下PsDFR启动子缺失片段驱动的GUS活性分析
Figure 7. Analysis of the GUS activity driven by PsDFR promoter deletion regions in response to light and hormone treatments
表 1 PsDFR 启动子克隆和活性分析相关引物
Table 1. The primers used in cloning and functional analysis of PsDFR promoters
用途
Usage引物名称
Primer name引物序列（5'−3'）
Primer sequencePsDFR启动子克隆
Cloning of PsDFR promoter sequencePsDFR-F ATGGAGGTAGAAAGAGTTCAGTCA PsDFR-R TTACTGGGGAAGCTTGTTGAGCTT SP1 CACTTCATTCTCAGGGTCCTTGG SP2 CCACAGGGTCAAATGGGTATCC SP3 ATTCTCTGGATCCCGCACCGTG PsDFR系列缺失片段构建
Construction of PsDFR series deletion fragments1301-PsDFRp0-F tcctctagagtcgacctgcagTTGTCGACTACGGAAGCAG 1301-PsDFRp0-R ttaccctcagatctaccatggTTGCTTTTGTTTTTTAAC PsDFR(1287)-F tcctctagagtcgacctgcagTTTGAATTAGTTTGTTTTAAT PsDFR(980)-F tcctctagagtcgacctgcagTTCGTCATCTTTCTCTTCCT PsDFR(507)-F tcctctagagtcgacctgcagGAAATAACCACCTGCAGTT PsDFR(140)-F tcctctagagtcgacctgcagCAGCTGGTGAGTTGATCACG 注：1301-PsDFRp0-R和5条正向引物分别配对扩增产生不同长度的PsDFR启动子片段
Note: 1301-PsDFRp-R and 5 forward primers were paired and amplified to generate PsDFR promoter fragments of different lengths
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表 2 应用PlantCARE和 PLACE 预测 PsDFR启动子区顺式作用元件特性
Table 2. cis-acting regulatory elements characteristic of PsDFR promoters by PlantCARE and PLACE
元件种类
Element type基序名称
Motif name基序（5′-3′）
Motif（5′-3′）数量
No.功能
Function核心启动子
Core promoterCAAT-box CAAT
CAAAT8
3启动子和增强子区调控元件
Common cis-acting element in promoter and enhancer regionsTATA-box TATA/TATAAA 5/1 转录起始-30核心启动子元件
Core promoter element around -30 of transcription startINRNTPSADB YTCANTYY 3 Inr（initiator） elements 光调控
Light regulatoryBox 4 ATTAAT 1 参与光响应的保守DNA模块的部分元件
Part of a conserved DNA module involved in light responsivenessG-Box CACGTG（T） 8 参与光响应的元件
Element involved in light responsivenessGA-motif ATAGATAA 1 部分光应答元件
Part of a light responsive elementGATA-motif GATAGGA 7 部分光应答元件
Part of a light responsive elementTCCC-motif TCTCCCT 1 部分光应答元件
Part of a light responsive elementTCT-motif TCTTAC 1 部分光应答元件
Part of a light responsive elementGT1-motif GGTTAA 5 光应答元件
Light responsive elementI-Box GATAAG 6 部分光应答元件
Part of a light responsive elementSORLIP1AT GCCAC 2 参与光响应的元件
Element involved in light responsivenessTBOXATGAPB ACTTTG 1 参与光响应的元件
Element involved in light responsiveness激素相关
Hormone
responseABRE ACGTG 13 ABA响应元件
Element involved in the abscisic acid responsivenessARR1AT NGATT 14 细胞分裂素诱导相关元件 Induced by cytokinin DPBFCOREDCDC3 ACACNNG 3 ABA诱导相关元件 Induced by ABA ERE AWTTCAAA 1 乙烯诱导相关元件 Induced by ethylene GARE-motif TAACAAR 6 赤霉素响应元件 GA-responsive element TGACG-motif AACGTG 3 茉莉酸甲酯响应元件
Element involved in the MeJA-responsivenessT/GBOXATPIN2 AACGTG 3 茉莉酸响应元件
Element related to jasmonate signalingTATCCAOSAMY TATCCA 1 糖和赤霉素诱导相关元件 Induced by sugar and GA 逆境胁迫
Stress responseW box TGAC 13 诱导子、受伤及病原体应答，结合WRKY类转录因子
Inducer, injury and pathogen responses, combined with
WRKY transcription factorsACGTATERD1 ACGT 14 脱水胁迫诱导相关元件 Induced by dehydration stress CBFHV RYCGAC 2 失水响应元件
Element involved in dehydration-responsivenessCRTDREHVCBF2 GTCGAC 2 低温响应元件
Element involved in low temperature-responsiveness组织特异表达
Tissue specific expressionCACTFTPPCA1 YACT 17 叶肉细胞特异表达元件 Mesophyll specific element GTGANTG10 GTGA 14 花粉特异表达相关元件 Pollen specific element POLLEN1LELAT52 AGAAA 10 lat52 基因花粉特异激活元件
Element responsible for pollen specific activation of lat52 gene其它 Others MYBCORE CNGTTR 3 类黄酮生物合成调控元件
Element involved in the regulation of flavonoid biosynthesisMYBPLANT MACCWAMC 2 植物MYB结合元件
Binding site of plant MYB，known as flower-specific
protein activating flavonoid biosynthesisMYBPZM CCWACC 1 花青素苷合成的诱导元件 Induced by anthocyanin biosynthesis MYCCONSENSUSAT CANNTG 12 MYC/bHLH 识别位点
Binding site of MYC/bHLH, known as protein regulating flavonoid biosynthesisCARGCW8GAT CWWWWWWWWG 4 MADS-box 特异结合位点 Binding site of MADS-box CIACADIANLELHC CAANNNNATC 4 昼夜节律响应元件 Element involved in circadian
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图(7) / 表(2)
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