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日本落叶松(Larix kaempferi (Lamb.) Carr.)为松科(Pinaceae)落叶松属(Larix)乔木,广泛分布于温带和寒温带等地区。它是我国重要的用材树种,具有早期速生、病虫害少、轮伐期短、成林快、抗逆性强等特点。基于有性繁殖的落叶松传统育种存在优良性状难以保持、生长周期长等问题极大地限制着日本落叶松优异种质资源的大规模利用。和扦插、嫁接相比,日本落叶松体细胞胚胎发生技术具有遗传稳定性强、繁殖系数高等优点,已成为当前最有潜力的无性繁殖技术,受到越来越多的关注[1-6]。
体细胞胚胎发生(Somatic embryogenesis)是指体细胞经历脱分化并在体外形成类似胚胎的胚状体,这一过程与合子胚的发育过程有许多相似之处[7-8]。在1987年von Aderkas以杂种落叶松(L. ecidua × L. leptolepis)雌配子体为外植体诱导出胚性愈伤,但未获得再生植株[9]。Klimaszewska以欧日杂种落叶松(Larix × eurolepis)未成熟种子为外植体,成功培育出再生植株[10]。此后体细胞胚胎发生技术在多种杂种落叶松[11-12]、华北落叶松(L. gmelinii var. principis-rupprechtii (Mayr) Pilger)、西伯利亚落叶松(L. sibirica Ledeb.)[13-14]、长白落叶松(L. olgensis Henry)[15-16]和日本落叶松[17-18]等落叶松中都得以应用并取得一定的进展,但依然存在一些问题亟待解决,比如胚状体萌发率和成苗转化率低等,这些问题限制了日本落叶松体胚发生技术的发展和应用。
在萌发培养前对胚状体进行干化处理是解决上述问题的一种可行的方法。干化处理可以将“形态成熟”的胚状体转化成“生理成熟”的胚状体,从而促进萌发[19-20]。这在云杉属(Picea)体细胞胚胎发生技术体系中得到很好的应用,被认为是体细胞胚成功萌发的先决条件[21-22],但在日本落叶松体细胞胚胎发生技术体系中尚未见到过相关的研究和应用报道。
本研究以日本落叶松胚状体为材料,观察并统计不同类别胚状体的萌发情况,探究干化处理对日本落叶松胚状体萌发的影响,旨在提高日本落叶松胚状体的萌发率,促进日本落叶松高效稳定再生体系的建立,为日本落叶松良种繁育和规模化应用提供技术支撑。
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日本落叶松C6胚性愈伤组织经过成熟培养后产生形态各异的胚状体。进一步观察和分析后,胚状体可分为10种类型(图1、表1),其中类型I发生频率最高,达到56.75%;类型Ⅲ、类型Ⅵ发生频率分别为12.75%、13.25%,仅次于类型I;其余类型的发生频率较低,都不足5%。
表 1 日本落叶松胚状体的形态和分类
Table 1. Morphology and classification of Larix kaempferi embryoids
分类
Classification子叶数量
Number of
cotyledon (NC)胚轴形态
Hypocotyl
shape发生频率/%
FrequencyI 4≤NC≤10 匀称 56.75 II 4≤NC≤10 无 4.75 Ⅲ 4≤NC≤10 膨大 12.75 Ⅳ 0≤NC<4 匀称 2.50 Ⅴ 0≤NC<4 无 1.25 Ⅵ 0≤NC<4 膨大 13.25 Ⅶ NC>10 匀称 1.00 Ⅷ NC>10 无 1.25 Ⅸ NC>10 膨大 2.75 Ⅹ — — 3.75 注:“—”表示不能分析
Note: “—” indicates no analysis -
在萌发培养基上,随机挑选的淡黄色胚状体先在暗环境下培养3 d,之后在光环境下培养。7 d左右观察到胚状体发生膨大,子叶变绿。12 d左右子叶变成翠绿色、胚轴伸长。随后,部分胚状体长出红色根尖(图2)。
类型Ⅰ胚状体萌发培养5 d后,子叶由黄变绿,胚状体开始膨大;10 d后子叶变成翠绿色,子叶和胚轴伸长,基部产生微小的红色根尖(图2A),萌发率为4.48%。类型Ⅹ的胚状体在萌发培养过程中会慢慢褐化死亡。其它8种类型的胚状体都表现出子叶伸长,部分胚状体有胚轴生长,但均未见胚根生长(表2,图2B)。
表 2 日本落叶松胚状体的萌发情况
Table 2. Germination of Larix kaempferi embryoids
分类
Classification子叶伸长
Cotyledon
elongation胚轴生长
Hypocotyl
growth胚根生长
Radicle
growthI √ √ √ II √ × × Ⅲ √ × × Ⅳ √ √ × Ⅴ √ × × Ⅵ √ × × Ⅶ √ √ × Ⅷ √ × × Ⅸ √ × × Ⅹ × × × -
在萌发培养过程中,仅类型Ⅰ胚状体表现出完整的萌发性状,因此用类型Ⅰ胚状体进行干化处理。与未干化处理的胚状体相比,干化处理7、14、21和28 d的胚状体萌发率均有增加,其中干化处理14 d的胚状体萌发率最高,达到69.43%(表3,图3),说明干化处理可以显著促进胚状体萌发。
表 3 干化对日本落叶松胚状体萌发的影响
Table 3. Effect of desiccation on the germination of Larix kaempferi embryoids
干化天数
Desiccation time/d萌发率
Germination rate/%0 5.57 ± 0.98 d 7 25.00 ± 6.03 c 14 69.43 ± 12.61 a 21 38.90 ± 6.97 bc 28 48.87 ± 10.86 b 注:不同字母表示P <0.05水平差异显著
Note: Different letters indicate a significant difference at P <0.05 level (LSD) -
在干化处理过程中,胚状体的颜色有两种变化,一种是子叶、胚轴变绿,胚根变红(图4A),另一种是子叶、胚轴颜色无明显变化,胚根微微变红(图4B、C)。参考粗枝云杉胚状体干化处理后的分类标准[24],将子叶和胚轴变绿、胚根变红的日本落叶松胚状体称为有干化响应的胚状体,将另外一种胚状体称为无干化响应的胚状体。
进一步分析发现,有干化响应的胚状体更易萌发。所有经过干化处理的720个胚状体中,有干化响应的胚状体共有649个(90.1%),其中有317个(48.8%)萌发;无干化响应的胚状体共有71个,但仅有11个(15.5%)萌发。干化处理14 d,有干化响应的胚状体162个(90%),其中122个(75.3%)萌发,而无干化响应的胚状体18个(10%),只有3个(16.7%)萌发(表4)。因此,可以将干化响应作为挑选胚状体进行萌发培养的依据。
表 4 干化响应与胚状体萌发
Table 4. Desiccation response and germination of somatic embryos
干化天数
Desiccation
time/d有干化响应的胚状体
Embryoids with
desiccation response无干化响应的胚状体
Embryoids without
desiccation response数量
Number萌发数量
Germination
number数量
Number萌发数量
Germination
number7 165 43 15 2 14 162 122 18 3 21 157 66 23 4 28 165 86 15 2
日本落叶松胚状体干化处理对萌发的影响
Effect of Desiccation on Germination of Larix kaempferi Embryoids
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摘要:
目的 提高日本落叶松胚状体的萌发能力,优化日本落叶松良种繁育技术。 方法 本研究根据子叶数量和胚轴形态,对胚状体进行分类,并分别统计其萌发率;利用“滤纸容器法”对类型Ⅰ胚状体进行干化处理,统计其萌发情况。 结果 胚状体分为10种类型。类型Ⅰ胚状体萌发率为4.48%,其余类型胚状体难以萌发。干化处理14 d后,类型Ⅰ胚状体萌发率提高到69.43%,且具有干化响应的胚状体更易萌发。 结论 本研究表明日本落叶松胚状体干化处理后萌发率明显提高,为该物种良种繁育提供依据。 Abstract:Objective To improve the germination ability of Larix kaempferi embryoids and optimize the breeding technology of Larix kaempferi. Method In this study, we conducted classification on embryoids based on the number of cotyledon and the hypocotyl shape. Subsequently, their germination rates were recorded respectively. The germination rate of type Ⅰ embryoids was evaluated after desiccation using “paper vessel method”. Result Type I embryoids exhibited an initial germination rate of 5%, while the remaining types did not show any germination. However, after drying for two weeks, the germination rate of type I embryoids significantly increased to 69.43%, and embryoids with desiccation response were more likely to germinate. Conclusion These results show that the germination rate of Larix kaempferi embryoids is significantly improved after desiccation, which provides insights into new strategies for improving seedling production for this species. -
Key words:
- Larix kaempferi
- / Embryoid
- / Germination
- / Desiccation
- / Somatic embryo
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表 1 日本落叶松胚状体的形态和分类
Table 1. Morphology and classification of Larix kaempferi embryoids
分类
Classification子叶数量
Number of
cotyledon (NC)胚轴形态
Hypocotyl
shape发生频率/%
FrequencyI 4≤NC≤10 匀称 56.75 II 4≤NC≤10 无 4.75 Ⅲ 4≤NC≤10 膨大 12.75 Ⅳ 0≤NC<4 匀称 2.50 Ⅴ 0≤NC<4 无 1.25 Ⅵ 0≤NC<4 膨大 13.25 Ⅶ NC>10 匀称 1.00 Ⅷ NC>10 无 1.25 Ⅸ NC>10 膨大 2.75 Ⅹ — — 3.75 注:“—”表示不能分析
Note: “—” indicates no analysis表 2 日本落叶松胚状体的萌发情况
Table 2. Germination of Larix kaempferi embryoids
分类
Classification子叶伸长
Cotyledon
elongation胚轴生长
Hypocotyl
growth胚根生长
Radicle
growthI √ √ √ II √ × × Ⅲ √ × × Ⅳ √ √ × Ⅴ √ × × Ⅵ √ × × Ⅶ √ √ × Ⅷ √ × × Ⅸ √ × × Ⅹ × × × 表 3 干化对日本落叶松胚状体萌发的影响
Table 3. Effect of desiccation on the germination of Larix kaempferi embryoids
干化天数
Desiccation time/d萌发率
Germination rate/%0 5.57 ± 0.98 d 7 25.00 ± 6.03 c 14 69.43 ± 12.61 a 21 38.90 ± 6.97 bc 28 48.87 ± 10.86 b 注:不同字母表示P <0.05水平差异显著
Note: Different letters indicate a significant difference at P <0.05 level (LSD)表 4 干化响应与胚状体萌发
Table 4. Desiccation response and germination of somatic embryos
干化天数
Desiccation
time/d有干化响应的胚状体
Embryoids with
desiccation response无干化响应的胚状体
Embryoids without
desiccation response数量
Number萌发数量
Germination
number数量
Number萌发数量
Germination
number7 165 43 15 2 14 162 122 18 3 21 157 66 23 4 28 165 86 15 2 -
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