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磷是植物生长必需的三大营养元素之一,我国土壤中总磷量较高,但多以无效形式存在,植物很难直接吸收利用[1],而施入土壤的磷肥当季利用率一般只有10% 25%[2],不能满足植物对磷的需求。大量研究证明,在土壤中存在许多溶磷微生物,它们不仅能将土壤中难溶性的磷酸盐活化,提高土壤中的有效磷含量[3],还能在其代谢过程中分泌生长素(IAA)、ACC脱氨酶等,促进植物生长和减轻植物病害[4-5]。应用溶磷微生物活化土壤难溶性磷被公认为是安全、经济和高效的生物措施[6]。近些年,溶磷微生物已成为国内外研究的热点,但相关研究多集中于农作物,多年生林木较少[7],且南方红豆杉根际溶磷细菌的系统研究更少[8]。
南方红豆杉(Taxus chinensis (Pilger) Rehd. var. mairei (Lemee et Levl.) Cheng et L. K. Fu)是我国一级保护野生濒危药用植物,采取人工栽培措施,在一定程度上能够克服南方红豆杉天然林生长缓慢、资源紧缺的问题[9]。本课题组前期从南方红豆杉根际分离筛选到1株高效溶无机磷细菌——草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)CHW10B,经初步研究发现,该菌株对南方红豆杉60 d实生苗幼苗期生长有明显的促生作用[8],并能稳定地定殖于南方红豆杉根际和根部[10]。本研究在前期工作的基础上,进一步探讨该菌株产IAA、ACC脱氨酶、嗜铁素及精氨酸脱羧酶等促生长特性,分析比较其溶磷特性及对1年生南方红豆杉的促生效果,旨在完善该菌株的系统研究,为高效利用该菌株以更好提高南方红豆杉人工栽培效率、丰富生物肥料菌种资源奠定基础。
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从图 1可看出:前4 d CHW10B菌株培养液的可溶磷含量逐渐增加,到第4天时达到峰值(757.752 mg·L-1),此时溶磷能力最强;4 d后该菌的溶磷能力明显降低,但到第7天却有所回升,回升原因可能是培养后期营养耗尽,菌体细胞大量死亡裂解导致可溶性磷释放。以上结果说明,该菌株溶磷的最佳培养时间为4 d。
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图 2表明:随着磷酸钙浓度的增加,CHW10B菌株的溶磷量呈先上升后下降的趋势;在磷酸钙浓度为2.50~10.00 g·L-1时,该菌株皆表现出较强的溶磷活性;磷酸钙为5.00 g·L-1时,该菌株的溶磷量最高(740.310 mg·L-1),溶磷能力最强。
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图 3表明:不同碳源明显影响CHW10B菌株溶解磷酸钙的能力;以葡萄糖为唯一碳源时,该菌株溶磷能力最强,溶磷量达740.310 mg·L-1;其次为果糖(79.457 mg·L-1);以麦芽糖、甘露醇、蔗糖和可溶性淀粉为碳源时,溶磷量大幅降低,尤其以可溶性淀粉为碳源时,溶磷量最小(2.907 mg·L-1)。由此可知,葡萄糖为CHW10B菌株充分发挥其溶磷功能的最适碳源。因此,在CHW10B菌株的实践应用中,应考虑与可以降解土壤中多糖的菌株结合使用。
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图 4表明:不同氮源条件下,CHW10B菌株溶磷能力差异显著;以(NH4)2SO4为氮源时,CHW10B菌株的溶磷能力最强,溶磷量为738.372 mg·L-1;以NH4NO3为氮源时,该菌株的溶磷能力比以(NH4)2SO4为氮源时略低(溶磷量为720.504 mg·L-1),但二者差异不显著。以牛肉膏、酵母膏和蛋白胨为氮源时,该菌株的溶磷能力明显下降,而以KNO3为氮源时,该菌株的溶磷能力最弱(溶磷量为179.201 mg·L-1)。说明该菌株以NH4+为氮源时的溶磷能力明显比以NO3-为氮源时的强,NH4+适合该菌株溶磷能力的充分发挥。因此,CHW10B菌株溶磷作用最适氮源为(NH4)2SO4,在实践应用中与(NH4)2SO4没有显著差异的NH4NO3也可以考虑。
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以最适碳源(葡萄糖)和最适氮源(硫酸铵)分别作为碳源和氮源,比较不同C/N对CHW10B菌株溶磷能力的影响。图 5表明:不同C/N对CHW10B菌株的溶磷能力影响显著;C/N≤100/1时,C/N越大,CHW10B菌株的溶磷能力越强;C/N>100/1,随着C/N升高,该菌株的溶磷能力反而减弱。C/N为25/1时,该菌株的溶磷量最低(318.542 mg·L-1),C/N为100/1时,该菌株的溶磷量最高(684.108 mg·L-1),此时溶磷能力最强。
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图 6表明:随着pH值的升高,CHW10B菌株的溶磷能力表现为先增长后降低;当初始pH值为10时,该菌株的溶磷能力最差,但可溶性磷含量仍达521.318 mg·L-1;初始pH值为7时,该菌株的溶磷能力最强(727.713 mg·L-1)。以上结果表明,CHW10B菌株对不同的pH值具有较强的适应能力,但中性条件最利于其溶磷功能的发挥,这也暗示了该菌株可以应用于多种不同酸碱性土壤中。
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溶氧量对微生物的生长有重要作用,不同微生物对溶解氧需求也不同。装液量是影响溶氧量的一个重要因素,装液量越少,溶氧系数越大,溶氧量越多。图 7表明:CHW10B菌株在不同装液量下均有一定的溶磷能力,但溶磷能力的强弱不同:装液量400 mL· L-1(2/5)和800 mL·L-1(4/5)时,CHW10B菌株的溶磷能力差异不显著;装液量600 mL·L-1(3/5)时,CHW10B菌株的溶磷能力最差;装液量500 mL·L-1(1/2)时,CHW10B菌株的溶磷能力最强,溶磷量高达750.001 mg·L-1。由此可知,装液量500 mL·L-1(1/2)为本研究条件下CHW10B菌株溶磷的最适装液量。
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图 8表明:CHW10B菌株在NaCl浓度为0.0~20.0 g·L-1内均能生长,但溶磷能力不同,且差异显著(P<0.05),NaCl浓度越高,其溶磷量反而越低。当NaCl浓度为0.0 g·L-1时,CHW10B菌株的溶磷能力最强,发酵液中可溶性磷含量为736.434 mg·L-1;NaCl为20.0 g·L-1时,该菌株几乎不表现溶磷功能。可能由于高浓度Na+造成的高渗溶液中微生物体细胞活动受抑制甚至死亡,进而影响到该菌株的溶磷能力。
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图 9表明:CHW10B菌株培养液在20~40℃下均有一定的溶磷能力,但差异显著(P<0.05)。该菌株培养液的溶磷能力由大至小的温度为:30、35、25、40、20℃,其最高溶磷量为749.576 mg·L-1,最低溶磷量为287.462 mg·L-1。温度低于30℃时,随着温度的升高,CHW10B菌株的溶磷量增加;当温度超过30℃后,其溶磷量随着温度的增加反而降低。可能是因为30℃时CHW10B菌株的生长发育和新陈代谢皆处于较好状态,相关的酶活性较强,而温度的升高或降低,都会影响到该菌株的生长繁殖和新陈代谢,使其溶磷能力降低。因此,该菌株溶磷最适温度为30℃。
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表 1表明:CHW10B菌株发酵液产生有机酸,且有机酸总量为5 710.82 μg·L-1,比对照组的665.05 μg·L-1 高758.70%。CHW10B菌株分泌的有机酸为草酸和葡萄糖酸,与对照相比,虽然少了甲酸和柠檬酸,但其葡萄糖酸的产生量远大于对照,分泌草酸的量与CK的相差不大。葡萄糖酸一方面能降低pH值从而溶解难溶性磷,另一方面还能与Al3+等螯合释放磷酸根[17]。由此可见,CHW10B菌株发酵液良好的分泌葡萄糖酸的能力促进了其高效溶磷作用。
表 1 CHW10B菌株分泌的有机酸种类和含量
Table 1. The kinds and concentrations of organic acid strain CHW10B secreted
有机酸Organic acids 有机酸含量/(μg·L-1) The content of organic acids CHW10B CK 草酸Oxalic acid 5.90 5.94 葡萄糖酸Glucose acid 5 704.92 641.53 甲酸Formic acid - 15.19 柠檬酸Citric acid - 2.38 有机酸总量Organic acids amount 5 710.82 665.04 注:“-”代表未检测到。Note:“-” represents not detected. -
经测定,CHW10B菌株可以产生吲哚乙酸(IAA)和ACC脱氨酶,产IAA量为8.908 mg·mL-1,其ACC脱氨酶比活力为0.922 U·mg-1。采用CAS平板对CHW10B菌株进行产铁载体定性测定,结果表明:CHW10B菌株能产生铁载体(图 10)。图 11表明:该菌株还具有产精氨酸脱羧酶的能力。以上结果说明,CHW10B菌株具有多种植物促生特性。
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南方红豆杉1年生实生苗接种CHW10B菌株后360 d的生长情况(表 2)表明:接种CHW10B菌剂对南方红豆杉生长具促进作用,与对照相比,南方红豆杉实生苗地径、苗高和生物量的增长率分别为19.53%、20.14%和25.39%。CHW10B菌株对南方红豆杉实生苗生物量和苗高的促生作用达极显著(P<0.01),而对地径的促生作用达显著(P<0.05)。
表 2 CHW10B菌株对南方红豆杉生长的影响
Table 2. The effect of strain CHW10B on the growth of Taxus chinensis var. mairei
项目Item 南方红豆杉Taxus chinensis var. mairei 增长率Growth rate/% CK CHW10B 平均值±标准差x±s 最大值Max 最小值Min 平均值±标准差x±s 最大值Max 最小值Min 生物量Biomass/(mg·株-1) 11.54±1.87 a 15.65 9.60 14.47±2.04 b 18.13 11.41 25.39 苗高Seedling height/cm 31.09±2.06 a 33.21 26.62 37.35±2.75 b 39.35 29.39 20.14 地径Ground diameter/mm 5.58±0.99 a 7.62 3.53 6.67±1.16 b 9.25 5.09 19.53 注:同行不同小写字母表示差异显著,P < 0.05。Note:The different small letters in the samerow mean the significant difference at P < 0.05.
草木樨中华根瘤菌CHW10B溶磷特性及其对南方红豆杉的促生作用
Phosphate-solubilizing Characteristics and Growth-promoting Effect of Sinorhizobium meliloti CHW10B on Taxus chinensis var. mairei
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摘要:
目的 探讨南方红豆杉根际微生物草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)CHW10B的溶磷特性及促生作用。 方法 利用液体发酵试验比较不同时间、碳源、氮源、碳氮比、培养温度等条件下CHW10B菌株的溶磷量,采用温室盆栽法研究该菌株对南方红豆杉生长的影响,并分析该菌株产嗜铁素、精氨酸脱羧酶、ACC脱氨酶及有机酸等成分的能力。 结果 该菌株分别在培养时间4 d、磷酸钙5.00 g·L-1、初始pH值7.0、装液量1/2、NaCl为0.0 g·L-1、温度30℃、碳源为葡萄糖、氮源为硫酸铵、碳氮比100:1时溶磷能力最强。将该菌株接种于1年生南方红豆杉实生苗360 d后,苗木的地径、苗高、生物量比对照分别增长了19.53%、20.14%、25.39%。该菌株能够产嗜铁素、精氨酸脱羧酶、ACC脱氨酶(0.922 U·mg-1)和IAA(8.908 mg·mL-1),并可分泌大量有机酸-葡萄糖酸(5 704.92 μg·L-1)。 结论 草木樨中华根瘤菌CHW10B溶磷能力强,对南方红豆杉促生作用显著,适用于多种不同酸碱性土壤,可高效应用于南方红豆杉的人工栽培,具有被开发为生物肥料的潜力。 Abstract:Objective A phosphate-solubilizing bacterium, Sinorhizobium meliloti CHW10B, was selected from Taxus chinensis var. mairei. Its phosphate-solubilizing characteristics and growth-promoting effect on T. chinensis var. mairei were studied. Method The effects of culture time, Ca3(PO4)2 concentration, carbon sources, nitrogen sources, initial pH, liquid filling volume, salt ions and other environment factors on phosphate solubilizing ability of strain CHW10B were studied by liquid fermentation experiment. Pot experiment was conducted to evaluate the role of strain CHW10B in promoting the growth of T. chinensis var. mairei. Some growth-promoting mechanism such as producing ACC deaminase, siderophore, indoleacetic acid, arginine decarboxylase and organic acid were determined. Result The results showed that CHW10B strain displayed the highest phosphate-dissolving capacity when the cultivation period was 4 days, the amount of calcium phosphate was 5.00 g·L-1, the initial pH reached 7.0, the volume of liquid was 1/2, the NaCl concentration was 0.0 g·L-1 and the temperature was 30℃. The phosphate solubilizing capacity of the strain got the highest when using glucose as carbon source and ammonium sulfate as nitrogen source. Moreover, the ratio of carbon to nitrogen (100:1) is optimum for strain CHW10B. After being inoculated with strain CHW10B, the ground diameter, seedling height and biomass of 1-year-old T. chinensis var. mairei seedlings increased by 19.53%, 20.14% and 25.39% in 360 days' post-inoculation, respectively. The strain could produce siderophore, arginine decarboxylase, ACC deaminase (0.922 U·mg-1) and IAA (8.908 mg·mL-1), and secrete a large amount of gluconic acid (5 704.92 μg·L-1). Conclusion S. meliloti CHW10B has strong phosphorus-solubilizing capability, and plays a significant promoting role in the growth of T. chinensis var. mairei. The strain can be applied to a variety of soils of different acidity-alkalinity. The result would be an important reference for further exploring of the CHW10B strain in production of bio-fertilizer and high efficient cultivation on T. chinensis var. mairei, etc. -
表 1 CHW10B菌株分泌的有机酸种类和含量
Table 1. The kinds and concentrations of organic acid strain CHW10B secreted
有机酸Organic acids 有机酸含量/(μg·L-1) The content of organic acids CHW10B CK 草酸Oxalic acid 5.90 5.94 葡萄糖酸Glucose acid 5 704.92 641.53 甲酸Formic acid - 15.19 柠檬酸Citric acid - 2.38 有机酸总量Organic acids amount 5 710.82 665.04 注:“-”代表未检测到。Note:“-” represents not detected. 表 2 CHW10B菌株对南方红豆杉生长的影响
Table 2. The effect of strain CHW10B on the growth of Taxus chinensis var. mairei
项目Item 南方红豆杉Taxus chinensis var. mairei 增长率Growth rate/% CK CHW10B 平均值±标准差x±s 最大值Max 最小值Min 平均值±标准差x±s 最大值Max 最小值Min 生物量Biomass/(mg·株-1) 11.54±1.87 a 15.65 9.60 14.47±2.04 b 18.13 11.41 25.39 苗高Seedling height/cm 31.09±2.06 a 33.21 26.62 37.35±2.75 b 39.35 29.39 20.14 地径Ground diameter/mm 5.58±0.99 a 7.62 3.53 6.67±1.16 b 9.25 5.09 19.53 注:同行不同小写字母表示差异显著,P < 0.05。Note:The different small letters in the samerow mean the significant difference at P < 0.05. -
[1] 张希涛, 康丽华, 马海宾, 等. 具有解磷能力的相思根瘤菌的筛选[J]. 林业科学研究, 2008, 21(5): 619-624. doi: 10.3321/j.issn:1001-1498.2008.05.005 [2] 张玉兰, 王俊宇, 马星竹, 等. 提高磷肥有效性的活化技术研究进展[J]. 土壤通报, 2009, 40(1): 194-202. doi: 10.3321/j.issn:0564-3945.2009.01.049 [3] 王舒, 张林平, 郝菲菲, 等. 油茶根际高效溶磷细菌的筛选、鉴定及其安全性测试[J]. 林业科学研究, 2015, 28(2): 166-172. [4] Babita K J, Monhandass G P, et al. Simultaneous phosphate solubilization potential land antifungal activity of new fluorescent pseudomonad strains, Pseudomonas aeruginosa, P. plecoglossicida and P. mosselii[J]. World J Microbiol Biotechnol, 2009, 25: 573-581. doi: 10.1007/s11274-008-9925-x [5] 梅新兰, 闪安琪, 蒋益, 等. 适应玉米的溶磷细菌筛选及其对玉米生长的影响[J]. 土壤学报, 2016, 53(2): 502-509. [6] 史发超, 殷中伟, 江红梅, 等. 一株溶磷真菌筛选鉴定及其溶磷促生效果[J]. 微生物学报, 2014, 54(11): 1333-1343. [7] 王舒, 张林平, 张扬, 等. 红壤区油茶根际解磷细菌的筛选、鉴定及其解磷能力[J]. 林业科学研究, 2015, 28(3): 409-416. doi: 10.3969/j.issn.1001-1498.2015.03.016 [8] 任嘉红, 刘辉, 吴晓蕙, 等. 南方红豆杉根际溶无机磷细菌的筛选、鉴定及其促生效果[J]. 微生物学报, 2012, 52(3): 295-303. [9] 肖遥, 楚秀丽, 徐肇友, 等. 南方红豆杉2年生容器苗多点试验的生长节律家系变异[J]. 林业科学研究, 2016, 29(2): 238-244. doi: 10.3969/j.issn.1001-1498.2016.02.014 [10] 任嘉红, 刘辉, 姜楠, 等. GFP标记溶磷草木樨中华根瘤菌CHW10B及其定殖[J]. 林业科学, 2015, 51(1): 74-79. [11] Penrose D M, Glick. Methods for Isolating and Characterizing ACC Deaminase-Containing Plant Growth-Promoting Rhizobacteria[J]. Physiologia Plantarum, 2003, 118(1): 10-15. doi: 10.1034/j.1399-3054.2003.00086.x [12] 鲁如坤. 土壤农业化学分析方法(第一版)[M]. 北京: 中国农业科技出版社, 2000. [13] Saleh S S, Glick B R. Involvement of gacS and rpoS in enhancement of the plant growth-promoting capabilities of Enterobacter cloacae CAL2 and UW4[J]. Canadian Journal of Microbiology, 2001, 47(8): 698-705. doi: 10.1139/w01-072 [14] Johan H, Leveaul J, Lindow S E. Utilization of the plant hormone indole-3-Acetic acid for growth by Pseudomonas putida strain 1290[J]. Applied Environment Microbiology, 2005, 71(5): 2365-2371. doi: 10.1128/AEM.71.5.2365-2371.2005 [15] Sun L N, Zhang Y F, He L Y, et al. Genetic diversity and characterization of heavy metal-resistant-endophytic bacteria from two copper-tolerant plant species on copper mine wasteland[J]. Bioresource Technology, 2010, 101(2): 501-509. doi: 10.1016/j.biortech.2009.08.011 [16] Yu X, Chen M, Jiang Z, et al. The two-component regulators GacS and GacA positively regulate a nonfluorescent siderophore through the Gac/Rsm signaling cascade in high-siderophore-yielding Pseudomonas sp. strain HYS[J]. Journal of Bacteriology, 2014, 196(18): 3259-3270. doi: 10.1128/JB.01756-14 [17] 刘文干, 何园球, 张坤, 等. 一株红壤溶磷菌的分离、鉴定及溶磷特性[J]. 微生物学报, 2012, 52(3): 326-333. [18] 王俊娟, 阎爱华, 王薇, 等. 铁尾矿区油松根际溶磷泛菌D2的筛选鉴定及溶磷特性[J]. 应用生态学报, 2016, 27(11): 3705-3711. [19] Yi Y M, Huang W Y, Ge Y. Exopolysaccharide: a novel important factor in the microbial dissolution of tric alcium phosphate[J]. World J. Microbiol. Biotechnol, 2008, 24: 1059-1065. doi: 10.1007/s11274-007-9575-4 [20] 赵小蓉, 林启美, 李保国. C、N源及C/N比对微生物溶磷的影响[J]. 植物营养与肥料学报, 2002, 8(2): 197-204. doi: 10.3321/j.issn:1008-505X.2002.02.013 [21] 刘辉, 吴小芹, 任嘉红, 等. 一株荧光假单胞菌的溶磷特性及其对杨树的促生效果[J]. 林业科学, 2013, 49(9): 112-118. [22] Patel D K, Archana G, Kumar G N. Variation in the nature of organic acid secretion and mineral phosphate solubilization by Citrobacter sp. DHRSS in the presence of different sugars[J]. Current Microbiology, 2008, 56(2): 168-174. doi: 10.1007/s00284-007-9053-0 [23] 范丙全, 金继运, 葛诚. 溶磷草酸青霉菌筛选及其溶磷效果的初步研究[J]. 中国农业科学, 2002, 35(5): 525-530. doi: 10.3321/j.issn:0578-1752.2002.05.012