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胡杨(Populus euphratica Oliv.)对干旱和盐碱具有极强的忍受能力，属于耐盐碱而非盐生植物，能在极端干旱、盐碱的荒漠地带中正常生长，被视为研究、发掘林木特异功能基因的模式生物[1]。Chen等发现，大多数植物耐盐性等生物表型是由多个基因片段共同调节控制[2]，但目前大多数研究仅局限于单基因克隆，对大片段基因簇的功能研究鲜有报道[3]。鉴于此，张瑷等[4]、周婧等[5]等将胡杨基因组片段导入拟南芥(Arabidopsis thaliana (L.) Heynh)中挖掘潜在的胡杨耐盐功能基因簇，朱晓静[6]发现了与叶绿体发育有关的胡杨基因组大片段，王智[7]得到赤霉素高合成转化型拟南芥植株，但有关胡杨基因组片段潜在功能的挖掘仍需进一步深入研究。本研究将继续探索胡杨基因组片段功能，为进一步开展林木基因工程育种研究发掘优异的基因资源。
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拟南芥材料为拟南芥哥伦比亚野生型植株。
质粒pCLD04541携带有新霉素磷酸转移酶(NPT Ⅱ)基因及四环素(Tet)抗性基因，全长约为27.3 kb。引物序列[5]如下：
NPT-R：5’-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3’；
NPT-F：5’-ATCTCCTgTCATCTCACCTTgCTCCT-3’；
Tet R3：5’-TCAACGTTCCTGACAACGAG-3’；
Tet F3：5’-GTCTGACGACACGCAAACTG-3’；
PCR引物由华大基因公司合成。NPT Ⅱ扩增片段大小约为490 bp，Tet扩增片段大小约为540 bp。
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操作方法参考文献[8]。转化前，先活化菌液，解冻摇菌、划平板，28℃扩大培养，提取的质粒DNA加入引物(Tet)进行PCR检测，确认农杆菌是否携带目的基因片段。离心机浓缩活化好的菌液，弃去上清液，得到的农杆菌体用质量体积比为50%的蔗糖溶液重悬，按0.5%体积加入silwet-77，浸染野生型拟南芥花序。
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收获的拟南芥种子，5%次氯酸钠溶液消毒后接种在含50 μg·ml-1的卡那霉素1/2 MS培养基上，并设对照。4℃条件下，春化2~3 d后，在温度20~23℃、湿度60%、光照16 h·d-1条件的培养室中培养10 d。种子萌发形成的幼苗移于土壤中，在同样条件的培养室中继续培养。
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摘取拟南芥幼苗2~3片嫩叶，CTAB法提取DNA[9]。加入引物(NPT Ⅱ)进行PCR扩增，扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳检测并拍照记录[9]。
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随机抽取4株转化型和野生型拟南芥叶片，数码相机拍照，采用Photoshop软件计算叶片面积[10]，重复3次。用SPSS statistics 19软件统计分析叶片面积。每周定期测量转化型和野生型拟南芥的株高，并拍照、记录。
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培养的菌落及拟南芥t2代幼苗叶片DNA的PCR扩增结果见图 1。由图 1A可知：菌落于540 bp处有条带，PCR扩增出的Tet基因和NPT Ⅱ基因的特异片段表明菌液携带有大片段基因78A2D10，可进行花序浸染。由图 1B可知，t2代幼苗叶片DNA于490 bp处有条带，表明t2代抗性植株基因组中携带有外源大片段78A2D10。
图 1 PCR检测图像
Figure 1. PCR identification image
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t1代转化型植株(T)与野生型植株(WT)生长表现见图 2A~C。由图 2A可知：与野生型植株相比，转化型植株莲座叶的叶片数量明显偏多，多些细小的叶片。抽薹后(图 2B)，转化型植株同时抽出2根几乎等高等粗的主茎，而野生型植株先抽出1根主茎再萌发侧茎。转化型植株的莲座叶数量多于野生型。3次重复试验，转化型与野生型植株的生长表型差异一致(图 2C)。但是，植株停止生长后，转化型与野生型植株的株高差异在统计学上不显著。
图 2 转化型与野生型植株对比
Figure 2. The Comparison of transgenic and wild plants
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转化型t2代与野生型植株在不同生长时期的株高差异见图 2D~G。野生型植株播种4周后开始抽薹，播种5周后型差异一致(图 2D)主茎达到22.0 cm，播种10周后型差异一致主茎达到36.0 cm (图 2E)，随后停止生长。转化型t2代植株营养期较长，播种17周后型差异一致(图 2F)才开始抽薹，播种27周后型差异一致株高达到63.0 cm(图 2G)。与野生型相比，转化型植株的株高明显增高。从图 2F可看出，播种17周后型差异一致，野生型植株开始枯萎，而转化型植株仍能正常生长。
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t2代转化型和野生型植株的叶片形态、数量以及侧茎形态特征见图 2H~J。由图 2H可知：与野生型植株相比，t2代转化型植株的莲座叶边缘向下内卷，严重皱缩，具有明显的远轴化叶片特征[11]。播种12周后型差异一致，野生型的莲座叶已经逐渐枯萎(图 2H)，但t2代转化型植株仍继续生长并不断从中心生出小叶，叶片数量增多。播种22周后型差异一致，野生型植株完全枯萎死亡；而t2代转化型植株仍能继续正常生长(图 2I)，直到播种29周后型差异一致，才枯萎。由此，笔者初步推测，胡杨基因组大片段78A2D10可能具有延长营养生长期及延长植株寿命的功能。同时，与野生型对比，t2代转化型植株侧茎分化成次生莲座(图 2I、2J)，具有典型的莲座叶特征。前期实验，从卡那霉素培养基中随机挑选12株抗性植株幼苗，移植于土壤后，4株出现特异表型。重复筛选，随机从卡那霉素培养基中挑选36株抗性植株幼苗中，获得特异表型植株11株。
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t2代转化型和野生型植株莲座叶的叶面积、株高及花期统计分析结果见图 3。由图 3A可知：转化型植株t2代莲座叶面积明显大于野生型莲座叶面积(P＜0.05)，在统计学上有显著意义。t2代转化型植株莲座叶叶面积比野生型莲座叶增长近3倍。由图 3B可知：t2代转化型植株株高明显高于野生型，株高平均增长近32.0 cm。由图 3C可知：t2代转化型植株花期与野生型花期差异极明显(P＜0.01)，野生型植株在4周即开始抽薹，而转化型植株在17周才陆续抽薹，比野生型晚抽薹13周。
图 3 2种拟南芥植株莲座叶面积(A)、株高(B)和花期(C)性状统计
Figure 3. Analysis of leaf area (A), flowering time(B) and plant height(C) of Arabidopsis transgenic and wild plants
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利用收获到的t2代无特异表型植株的种子进行卡那霉素平板筛选，种子萌发形成的150株t3代幼苗中，绿色抗性植株118株，黄化植株32株，比例接近3:1。随机从绿色抗性植株中挑取36株移植土壤中，结果发现，11株表现为抽薹晚、植株叶量多、叶面积大等特异表型，无特异表型与特异表型比例接近2:1。利用t2代特异表型植株的种子进行卡那霉素平板筛选，种子萌发形成的t3代幼苗均为绿色抗性植株，无黄化苗。从中随机挑取12株，移植于土壤中，结果发现，所有植株表现为特异表型。
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植物抽薹、开花是经过一连串的信号转导与一系列基因家族协同调控的[12-14]。有研究认为，植物内源激素[15-16]与小分子RNA(miR156)及其靶基因[17-18]影响植物营养生长和花发育。胡杨大片段基因长度远远大于单个基因序列长度，随机插入拟南芥植物体内，可能会发生中断调控、破坏正常基因阅读框或高效表达等[19]情况。本研究中，胡杨基因组大片段78A2D10转化型拟南芥表现为营养生长期长、抽薹晚等现象是否与上述机理有关，有待进一步研究。有报道指出，GRF转录因子能参与调控植物细胞体积大小[20]，油菜素甾醇(BR)、生长素(IAA)、赤霉素(GA)均能促进植物细胞伸长[21-22]，胡杨基因组大片段78A2D10转化型拟南芥株高明显高于野生型、主茎变粗，是由上述机理决定的，还是由于转化型植株的前期营养生长积累了大量营养物质[23]造成的，目前还不清楚。
对胡杨基因组大片段78A2D10转化型拟南芥植株的后代(t2至t3)进行反复筛选，发现转化型植株后代群体中，无特异表型植株与特异表型植株比例接近2:1，性状分离比例与孟德尔遗传定律中分离比基本吻合。这表明，胡杨基因组大片段78A2D10遗传方式符合孟德尔定律[24]，胡杨基因组大片段78A2D10为隐性遗传方式[25]，无特异表型植株为杂合体，特异表型植株为纯合体。本研究中，t1代转化型植株出现的抽双薹性状未在t2代杂合体中出现，尚不清楚其原因。
为了进一步探讨胡杨基因组大片段78A2D10的功能，下一步计划将携带胡杨基因组大片段78A2D10的农杆菌原始菌液转入其他模式植物如烟草(Nicotiana tabacum L.)中，观察烟草转化型植株是否会出现延长营养生长的现象。基于基因测序方法，获取其碱基序列，通过生物信息学分析，在分子水平上进一步探讨该大片段基因的时空表达模式。
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本研究中，导入胡杨基因组大片段78A2D10的拟南芥转化型植株在莲座基叶数量、基叶面积、营养生长期、莲座叶的叶片伸展程度、株高、茎粗、茎生叶、抽薹时间、侧茎发育方式以及植株寿命等方面与野生型存在明显差异，转化型植株的营养期明显延长、株高明显增高，这表明胡杨基因组大片段78A2D10可能与植物营养生长有关。如果将胡杨基因组大片段78A2D10转化到重要用材林树种，如杨树(Populus L.)中，可望提高树木的高生长量和胸径生长量，增加单位面积蓄积量，为林业新品种创制提供新的基因资源。
胡杨基因组片段转化拟南芥表型研究
Phenotypic Study of Arabidopsis thaliana Transformed by Genome Fragment from Populus euphratica
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摘要:
目的 本研究旨在探索与挖掘胡杨基因组大片段的潜在功能，发掘具有潜在育种价值的胡杨基因簇。 方法 利用已构建的胡杨基因组BIBAC文库，采用花序浸染法，将胡杨基因组大片段78A2D10导入模式植物拟南芥基因组中。采用抗性筛选、分子检测及表型观察等方法鉴定、分析转化型植株。 结果 共获得15株特异表型的转化植株。与野生型相比，转化型植株主侧茎生长受到抑制，莲座叶面积增大近3倍，叶片数量增多，叶边缘皱缩，抽薹推迟约13周，株高增加近32.0 cm，侧茎发育成次生莲座，植株寿命延长约7周。 结论 胡杨基因组片段78A2D10可延长植株营养生长期及植株寿命，据此推测该基因片段可能与营养生长有关。 Abstract:Objective The study aims at exploring and excavating the potential function of large genome fragment cloned from Populus euphratica, and finding out the potential gene clusters with breeding value. Method Based on BIBAC library, the fragment 78A2D10 from the genome of P. euphratica, was inserted into the genome of Arabidopsis thaliana by the method of floral-dip. Resistance selection, molecular identification and phenotypic observation were applied to identify and analyze the transgenic plants. Result Fifteen transgenic plants with specific phenotype were obtained in the research. Compared with the wild plants, the positive plants showed the characters such as inhibited growth of the stems, 3 times rosette leaf area, more leaves, crimping blade edge, delayed bolting with 13 weeks, height increasing by 32.0 cm, developing lateral stems and prolonged lifetime with 7 weeks. Conclusion The fragment of 78A2D10 may prolong the vegetative growth and lifetime of plants. The fragment may be related to the vegetative growth of plants. -
Key words:
- Populus euphratica
- / genome large fragment
- / floral dip
- / Arabidopsis thaliana
- / phenotype
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