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松材线虫病又名松树枯萎病(Pine Wilt Dise)，能引起松属植物的快速萎蔫死亡、成片地毁灭，是以松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer))为主要病原。松材线虫是一种重要的国家级林业检疫性有害生物，其危害严重、防治困难[1]。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis Bt)是世界上开发应用最为成熟的生防微生物，自1972年，Prasa等首次报道了苏云金芽孢杆菌对植物寄生线虫的毒杀作用[2]，国内外便开始对苏云金芽孢杆菌及其代谢产物对松材线虫的毒杀作用进行研究[3-6]。伊氏杀线真菌(Esteya vermicola (liou J Y, Shih J Y﹠Tzean S S))是世界上第一个被报道的松材线虫内寄生真菌，它产生的新月形孢子对松材线虫具有侵染活性[7]。杜婷与Wang等人先后在室内、室外测定了E.vermicola对松材线虫的侵染活力[8-9]。目前，虽然利用生防微生物防治松材线虫的研究很多[3-10]，但由于松材线虫的隐蔽性，防治效果并不明显。其中将两种微生物联合起来防治松材线虫的研究未见报道。本试验将松材线虫内寄生真菌E.vermicola孢子与苏云金芽孢杆菌代谢产物结合起来对松材线虫进行毒力研究，以图找到控制松材线虫更有效、持续的手段，为以后能否利用E. vermicola和苏云金芽孢杆菌联合防控松材线虫提供参考。
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供试伊氏杀线真菌菌株为Esteya vermicola CBS 115803, 由韩国国立忠南大学成昌根教授惠赠，在本实验4℃斜面保存。供试苏云金芽孢杆菌菌株Bt KNU-07由本实验室斜面保存。
供试松材线虫由中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所汪来发研究员提供，在本实验室利用多毛孢Pestalotia sp.培养繁殖以供测试用。
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将多毛孢Pestalotia sp.接种到PDA培养基，26℃培养7~10 d，菌落长满整个平板后，无菌条件下接种松材线虫, 26℃放置10 d，待多毛孢菌丝完全消失，采用Berman漏斗法分离、收集线虫[11-12]。将收集的线虫用消毒液(0.002%的放线菌酮+0.1%的硫酸链霉素)重复消毒2次，再用无菌水漂洗3次[12]，配制成浓度约为5 000头·mL-1的悬浮液。供试线虫即用即提。
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将保存的E.vermicola CBS 115803转接到PDA培养基，置于26℃恒温培养箱中培养10 d。用无菌的Tween-80溶液(0.05%)从菌落生长旺盛的平板上洗下分生孢子，装入50 mL灭菌离心管中，置于涡旋振荡器上充分振荡，使孢子尽可能从菌丝上脱落悬浮于0.05%的Tween-80溶液中，悬浮液用滤纸过滤以除去菌丝。用血球计数法确定悬浮液的孢子浓度，置于4℃保存待用[9]。
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将实验室保存于斜面上的Bt KNU-07转接到LB固体培养基上，置于26℃恒温培养箱中24 h进行活化培养。活化成功后将其接种到装有100 mL LB培养液的250 mL锥形瓶中，置于摇床振荡培养48 h, 摇床参数设为150 r·min-1，28℃。将发酵的产物10 000 r·min-1离心5 min，去除菌体沉淀，上清液用0.22 μm除菌过滤器过滤待用。
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将不同浓度的E.vermicola孢子悬浮液与不同稀释倍数的Bt发酵液两两按照1:1(V/V)联合处理松材线虫，使E.vermicola孢子悬浮液最终浓度分别为2.5×108 spores·mL-1(高浓度)、2.5×107 spores·mL-1(中浓度)、2.5×106 spores·mL-1(低浓度)；Bt发酵液最终稀释倍数分别为3倍、5倍、7倍。各取混合液800 μL加入到1.5 mL灭菌离心管中，再加入线虫悬浮液200 μL，使松材线虫的终浓度为1头·μL-1。每个处理重复3次，以无菌LB培养液处理为空白对照，Bt发酵液为阳性对照。25℃静置3 d, 每天进行取样观测。取样后2 000 r·min-1离心3 min，弃掉上清，线虫漂洗2次，再加入500 μL浓度为2%的NaCl溶液，混匀，取30 μL(观察线虫总数不低于30头)点到载玻片上[6]，5 min后在光显微镜下观察线虫死亡症状和死亡数目(僵直不动或用针尖刺激也不动即视为死亡[13])及线虫总数。
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校正死亡率计算公式[14]：校正死亡率=(处理死亡率－对照死亡率)/(1－对照死亡率)×100%
采用SPSS Statistics 19.0软件对数据进行单因素方差分析，最小显著差数法(LSD，P=0.05)进行处理间显著性检验，并用Microsoft Excle 2007软件画图。图中数据均采用平均值±标准误表示。
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松材线虫经E.vermicola孢子悬浮液、Bt发酵液以及二者联合处理后的形态观察结果如图 1所示。图 1A为对照组观察到的活体线虫，线虫形态自然，活动自如，呈“S”型，虫体内容物分布均匀，结构完整。经Bt发酵液处理24 h后，约80%线虫虫体僵直，最终成新月形或者直形死亡(图 1B)，剩余死亡线虫尾部弯曲成钩状(图 1C)。经E.vermicola孢子悬浮液处理3 d后，线虫虫体内容物外渗、体腔收缩与表皮完全分离，收缩后的体腔直径约为虫体直径的一半，也有部分线虫体腔断裂(图 1D、E)。两者联合处理过的线虫死亡状态有两种，一种与E.vermicola孢子悬浮液处理过的虫体状态相似，体腔收缩甚至弯曲、断裂等(图 1F)，一种与Bt发酵液处理过的线虫一样(图 1G)。
图 1 光学显微镜观察的不同方式处理的松材线虫形态
Figure 1. The morphology of B.xylophilus with different treatment under optical microscope
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不同浓度的E.vermicola孢子悬浮液与不同稀释倍数的Bt发酵液的组合对松材线虫毒力测定结果表明(图 2)：E.vermicola孢子悬浮液浓度越大，对线虫的致死效果越好；随着Bt发酵液的稀释，无论Bt单用还是与E.vermicola孢子悬浮液联合的毒力都逐渐降低。在联合处理松材线虫的条件下:低浓度E.vermicola孢子悬浮液的毒力都比高浓度E.vermicola孢子悬浮液的毒力低25%左右，与中浓度E.vermicola孢子悬浮液的毒力没有显著的差异(P < 0.05)。
图 2 E.vermicola孢子悬浮液与Bt发酵液的联合对B. xylophilus的校正死亡率
Figure 2. The corrected mortality of B.xylophilus treated with the combination of E.vermicola spore suspension and Bt fermentation broth
当E.vermicola孢子悬浮液浓度为高浓度时：与Bt发酵液联合处理松材线虫可明显地提高线虫的死亡率(P < 0.05)；其中Bt发酵液稀释倍数为3倍时，混合液处理的致死效果最好，死亡率可以达到100%；随着Bt发酵液稀释成7倍，联合处理的毒力下降了约一半，与单用真菌孢子处理的毒力(51.86%)接近，但却是仅用Bt发酵液处理的毒力(23.86%)的2倍多。当E.vermicola孢子悬浮液浓度为2.5×106、2.5×107 spores·mL-1时：与Bt发酵液联合处理松材线虫并没有提高线虫的死亡率(P < 0.05)，甚至会略微降低Bt发酵液的毒力；只有中浓度的孢子悬浮液与3倍稀释的Bt发酵液联合处理的毒力也达到100%。当不加Bt发酵液处理时：低浓度的E.vermicola孢子悬浮液对松材线虫没有影响，中浓度E.vermicola孢子悬浮液的毒力也仅有10%，远低于高浓度E.vermicola孢子悬浮液的毒力(51.86%)(P < 0.05)。
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3 d内E.vermicola孢子悬浮液与Bt发酵液联合处理的毒力变化如图 3，随着时间的延长，各种处理的线虫死亡率均呈上升趋势。在处理3 d内：未加E.vermicola孢子悬浮液处理的线虫死亡率增长缓慢，上升幅度并不明显(图 3A)；高浓度E.vermicola孢子悬浮液处理过的线虫死亡速度较快，而且它们的死亡速度基本保持不变(图 3D)。
图 3 E.vermicola孢子悬浮液与Bt发酵液联合处理的B. xylophilus在不同时间的校正死亡率
Figure 3. Over time—mortality of B.xylophilus treated with the combination of E.vermicola suspension and Bt fermentation broth
处理线虫1 d后：图 3B与图 3D相比较，低浓度孢子悬浮液与3倍稀释的Bt发酵液联合的毒力翻了一倍，死亡速度最快(图 3B)，和高浓度E.vermicola孢子悬浮液与5倍、7倍Bt发酵液联合处理的线虫死亡速度相近(图 3D)。处理2 d后：图 3B与图 3C相比较，低浓度E.vermicola孢子悬浮液与5倍稀释的Bt发酵液(图 3B)、中浓度E.vermicola孢子悬浮液与3倍稀释的Bt发酵液联合处理的线虫死亡速度明显加快(图 3C)，而其余由低浓度、中浓度E.vermicola孢子悬浮液处理的线虫死亡速度则放缓。
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本试验通过研究E.vermicola孢子悬浮液与Bt发酵液联合处理过的松材线虫的形态结构、死亡率及其变化趋势证明了高浓度E.vermicola孢子悬浮液与较小稀释倍数的Bt发酵液的联合不仅会显著提高线虫的死亡率，而且会使死亡率随处理时间的延长稳步上升。由此可见高浓度E.vermicola孢子悬浮液与较小稀释倍数的Bt发酵液的联合使用不但能使毒杀松材线虫的效果叠加，还能保持线虫的死亡速度基本不变。线虫在死亡的过程中还会出现逐渐消解、内容物渗漏的症状。
以往的报道研究关于Esteya vermicola杀松材线虫活性的室内测定均是在平板菌落上进行的，且认为只有该菌产生的新月形孢子才能够杀松材线虫[8, 15-16]。本试验是将Esteya vermicola平板菌落上的孢子洗脱下来制备成悬浮液来测定该真菌对线虫的影响[16]，结果是不论E.vermicola孢子悬浮液单用还是与Bt联合使用，线虫的死亡率都随E.vermicola孢子悬浮液浓度的上升而提高。Wang等将E.vermicola孢子悬浮液注射于被松材线虫侵染的松树中，2个月后发现高浓度(3×109 spores·mL-1)比低浓度(3×108 spores·mL-1)注射后树体内的线虫数量显著减少，且树体中的线虫数量分别降低79%与47%[17]。可见，在野外防治过程中，提高联合处理中E.vermicola孢子悬浮液的浓度，可达到快速减少病树中松材线虫的数量。经过E.vermicola孢子悬浮液处理后无法观察到杜婷等运用真菌菌落法得到新月形孢子侵染线虫的现象[8]，但却发现了线虫体腔内容物外溢、虫体逐步被酶解消散的症状，这可能和线虫与E.vermicola孢子接触时所处的环境不同有关，在一定程度上也可以说明E.vermicola孢子在平板菌落与悬浮液中杀松材线虫的机制可能不同，还需要对两种杀线虫方式的机理与差异进行深入地研究。
联合处理时间对松材线虫的影响试验过程中，高浓度的E.vermicola孢子悬浮液处理组的毒力变化最为明显，毒力随处理时间的延长稳步上升；其它处理组的线虫死亡率上升幅度在不同处理时间段有高有低。由此说明了松材线虫的死亡速度与E.vermicola孢子悬浮液浓度和Bt发酵液稀释倍数都有关系，并且在不同时间两者所起的作用大小不同，正如添加E.vermicola孢子悬浮液的处理组线虫死亡率在1 d到3 d的上升幅度都比不加E.vermicola孢子悬浮液的处理组的大，说明了联合处理1 d到3 d是由E.vermicola孢子悬浮液起主要作用。
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本研究将E.vermicola孢子悬浮液与Bt发酵液联合起来对松材线虫进行毒力测定，旨在室内试验二者联合对松材线虫的毒性及在野外运用该种方法防治松材线虫的可能性。试验结果表明在室内这种防治思路是可行的，在E.vermicola孢子悬浮液与Bt发酵液浓度都合适的条件下，二者之间的防治效果是可以叠加的，而且联合处理的线虫死亡速度更快。如果在野外防治中，需要考虑的因素会更多，如松树的萎蔫状况、天气、E.vermicola与Bt的浓度与剂量、防治的方式(注射)与持续性、注射部位等。至于为何E.vermicola孢子悬浮液与Bt发酵液能够联合，并以较快的速度杀死松材线虫，需要进一步地探索研究。但是将两种生防微生物联合起来防治松材线虫已显现出巨大的研究价值和生防潜力。
伊氏杀线真菌与苏云金芽孢杆菌对松材线虫的联合毒力研究
Study on Joint Toxicities of Esteya vermicola and Bacillus thuringiensis to Pine Wood Nematode (Bursaphelenchus xylophilus)
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摘要:
目的 探究伊氏杀线真菌与苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）对松材线虫的联合毒力。 方法 使用Esteya vermicola孢子悬浮液与Bt发酵液处理松材线虫，通过线虫的形态变化、死亡率及死亡速度3个方面测定E.vermicola与Bt联合对松材线虫的影响。 结果 经过E.vermicola孢子悬浮液处理过的线虫会出现内容物渗漏，体腔收缩、弯曲、断裂的现象；高浓度的E.vermicola孢子悬浮液与Bt发酵液联合处理松材线虫可以明显地提高线虫的死亡率，最高可以达到100%；联合处理的线虫死亡速度较快，随着处理时间的延长，死亡率会一直呈上升的趋势。 结论 应用这两种生防微生物在合适的浓度下混配能够在较短时间内提高松材线虫的死亡率 -
关键词:
- Esteya vermicola孢子悬浮液
- / Bt发酵液
- / 松材线虫
- / 死亡率
Abstract:Objective To explore the toxicities of Esteya vermicola in combination with Bacillus thuringiensis (Bt) against Bursaphelenchus xylophilus. Method The joint toxicities of E. vermicola and Bt against pine wood nematodes was measured by the morphological changes, mortality and death rate of nematodes treated with E. vermicola spore suspension and Bt fermentation supernatant. Result The results showed that the nematodes treated by E. vermicola spore suspension could cause leakage of body contents and shrinkage, bending and fracture of body cavity. The combination of high concentration of E. vermicola spore suspension and Bt fermentation solution could significantly increase the mortality of nematodes, with a maximum of 100%. The combined treatment of pine wood nematodes died faster, and the mortality rate would continue to rise with the extension of treatment time. Conclusion Application of these two bio-control agents at the right concentrations can increase the mortality of pine wood nematodes in a relatively short time. -
图 1 光学显微镜观察的不同方式处理的松材线虫形态
Figure 1. The morphology of B.xylophilus with different treatment under optical microscope
图 2 E.vermicola孢子悬浮液与Bt发酵液的联合对B. xylophilus的校正死亡率
Figure 2. The corrected mortality of B.xylophilus treated with the combination of E.vermicola spore suspension and Bt fermentation broth
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