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樟树(Cinnamomum camphora(L.)Presl)又名香樟树,属樟科(Lauraceae),樟属(Cinnamomum Trew)常绿乔木,是良好的林木、绿化树、行道树和庭荫树,且具有较高的药用价值[1-2]。随着人们环保意识的增强和城市绿化工程的加快,越来越多的樟树进入城市绿化的行列,但是城市绿化移植樟树导致樟树病害的发生也日趋严重[3-4],其中,樟树溃疡病是樟树上发病最严重的病害之一,该病害主要危害主干,尤以移植后的苗木受害较重,发病率一般为15%~50%,发病严重时病株率达100%,死亡率达88%,极大地影响了樟树造林成活率和樟树的长势[5]。
樟树溃疡病于1995年由郭立中等[5]通过调查与研究湖南地区樟树病害的发生后首次报道,并且将其病原菌的有性型鉴定为囊孢壳菌(Physalospora sp.),无性型鉴定为大茎点霉菌(Macrophoma sp.)。2005年,邓先琼等[6]对该病的病原菌种类进行了再鉴定,根据樟树溃疡病菌子囊、子囊孢子、分生孢子、分生孢子梗的形态特征,将该病害的病原菌鉴定为葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea Ces et de Not.)。赵桂华等[7]通过对樟树溃疡病的病原菌分离培养、致病性测定及观察菌丝特征和分生孢子的萌发状况,证实了江苏地区的樟树溃疡病由真菌耧斗大茎点霉菌(Macrophoma aquilegiae)引起。然而,前期的研究范围主要集中于湖南和江苏地区,且关于该病菌与其近缘真菌的转录间隔区(ITS)序列差异、系统进化和分类地位等方面缺乏系统研究。因此,本研究通过采自重庆地区的樟树溃疡病的发病组织进行病原菌的分离纯化,根据病原菌的形态学特征、致病性及ITS序列、β-微管蛋白基因(β-tubulin)序列和延伸因子基因(EF1-α)序列的同源性分析,对引起重庆樟树溃疡病的病原菌进行鉴定与分析,以期为系统研究樟树溃疡病及对其进行防治奠定理论基础。
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樟树溃疡病可危害不同树龄樟树的主干、主枝和树梢,树干受害后皮层坏死,后期皮层纵横开裂并翘起(图 1A)。樟树枝梢被病菌侵染后易形成黑褐色病斑,随后病斑以上枝条变黑褐色坏死,形成枝枯(图 1B、D)。在幼龄树上,大部分病斑位于主干的中部和下部,在主干与侧枝的分蘖处也容易产生病斑,被为害的主干部分形成凹陷的U形溃疡病灶(图 1C),将发病部分的主干横切,发现患病部分已经深入到了树干的木质部(图 1E),在病患交接的地方为红棕色的病斑,患病严重的部位则出现黑色腐烂的病斑(图 1C、E、F)。
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从重庆渝中区、北碚区和涪陵区共采集到樟树溃疡病样品62份,分离得到48株具有葡萄座腔菌属真菌特征的菌株,单菌丝纯化后获得68株纯化菌株。根据纯化菌株在PDA培养基上的培养特性及分生孢子特征,可分为3种类型,分别称为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型,其中,Ⅰ型菌株有43份,Ⅱ型菌株有16份,Ⅲ型菌株有9份。从3种类型的菌株中选取14株代表菌株进行形态学分析(表 1),包括分离自渝中区的3份菌株(YZS7-6a、YZS8-1a和YZS8-1b)、北碚区的5份菌株(YZS9-1a、YZS9-1b、YZS9-1c、YZS9-1d和YZS11-1a)及涪陵区的6份菌株(YZS1-1a、YZS1-2a、YZS1-6a、YZS3-2a、YZS3-3a和YZS5-1a)。
表 1 樟树溃疡病菌不同类型菌株的分生孢子大小
Table 1. Conidial dimensions of camphor tree canker strains
菌株Strains 分生孢子大小Conidial dimensions 长×宽Length×width/μm (长×宽)平均值±标准误Mean of Length×width±SD/μm 长/宽L/W Ⅰ型 YZS1-2a (18.36~32.23)×(5.55~12.35) (25.64±2.44)×(8.53±1.51) 3.08±0.54 YZS11-1a (19.21~26.21)×(5.42~10.40) (22.36±2.14)×(9.16±0.97) 3.04±0.51 YZS5-1a (21.36~32.24)×(8.55~14.56) (28.16±2.44)×(11.22±1.44) 2.54±0.35 Ⅱ型 YZS9-1a (21.82~32.23)×(9.03~17.96) (26.33±2.35)×(11.79±1.62) 2.48±0.49 YZS9-1b (18.23~29.66)×(7.50~13.58) (24.01±2.17)×(10.40±1.31) 2.34±0.29 YZS1-1a - - - YZS3-2a - - - YZS9-1c - - - YZS9-1d - - - Ⅲ型 YZS1-6a (19.12~26.51)×(10.54~14.86) (22.43±1.45)×(12.62±1.13) 1.79±0.15 YZS3-3a (19.36~26.23)×(9.85~15.48) (22.96±1.53)×(13.27±1.13) 1.74±0.21 YZS8-1a (21.86~29.58)×(12.69~18.19) (26.50±1.66)×(15.32±1.19) 1.74±0.15 YZS8-1b (22.23~33.61)×(12.65~19.97) (28.45±2.29)×(16.41±1.54) 1.74±0.14 YZS7-6a - - - 注:每菌株分别统计50个分生孢子;“-”观察期内未产生分生孢子(30 d)。
Note: The length and width of 50 conidia were measured from each selected strains. “-” No conidia were observed during the observation period (30 days).Ⅰ型代表菌株(3株)在PDA平板培养2 d,菌落为白色,边缘不整齐,生长缓慢,气生菌丝较短且很密集,呈棉絮状(图 2 A1);4 d后菌落长满整个培养皿,气生菌丝逐渐变成灰白色,菌落背面为灰绿色,后期变成黑色。分生孢子器黑色,多为单生,菌株YZS1-2a和YZS11-1a能够泌出乳白色的分生孢子角。显微镜下可观察到分生孢子为梭形、透明的单细胞(图 2 A2),分生孢子的长度为18.36~32.24 μm,宽度为5.42~14.56 μm,平均长宽比为2.80(表 1)。这类型菌株的菌落特征和分生孢子形态与B. dothidea的代表菌株相似[14-15]。
Ⅱ型代表菌株(6株)的菌落初期为白色,气生菌丝呈束状直立生长,气生性较强但生长稀疏,培养至2 d菌落已长满整个培养皿,菌丝尖端可接触至培养皿盖(图 2 B1);4 d后菌落逐渐变成灰白色,背面呈灰棕色,最后变成黑色。分生孢子器黑色,多分布在培养皿的边缘,菌株YZS9-1a和YZS9-1b可泌出乳白色的分生孢子角,显微镜下可观察到分生孢子为椭圆形、无隔膜、透明的单细胞(图 2 B2),分生孢子长度为18.23~32.23 μm,宽度为7.50~17.96 μm,平均长宽比为2.41(表 1)。其他4株代表菌株在培养30 d时能够观察到黑色的孢子器,但镜检时均未观察到分生孢子。这类型菌株的菌落特征和分生孢子形态与B. parva代表菌株相似[15]。
Ⅲ型代表菌株(5株)的菌落初期为白色,气生菌丝呈放射状生长,气生性较上述2种类型菌株强,且很浓密,菌落生长最快,培养2 d菌落已长满整个培养皿(图 2 C1);培养4 d后,菌落正面灰白色,背面呈灰黑色,气生菌丝呈棉絮状。分生孢子器位于培养基表面,且为聚生,其中,4株代表菌株能够泌出乳白色的分生孢子角。显微镜下发现有2种类型的分生孢子,初期无色透明、无隔膜,成熟后则变成深褐色,且孢子中间形成一条横隔(图 2 C2),分生孢子长度为19.12~33.61 μm,宽度为9.85~19.97 μm,平均长宽比为1.75(表 1)。代表菌株YZS7-6a在培养30 d时镜检时均未观察到成熟的分生孢子。该类型菌株的菌落特征和分生孢子形态与B. rhodina代表菌株相似[15]。
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对选取的14株代表菌株进行ITS、β-tubulin和EF1-α序列扩增,3个基因分别扩增到长度约550、400、200 bp的特异性片段,与预期目标片段大小一致。将获得的ITS序列在NCBI上Blastn比对,结果显示:菌株YZS1-2a、YZS5-1a、YZS11-1a与B. dothidea(无性型:七叶树壳梭孢Fusicoccum aesculi)的代表菌株CMW8000相似性为100%;菌株YZS1-1a、YZS3-2a、YZS9-1a、YZS9-1b、YZS9-1c、YZS9-1d与B. parva(无性型:小新壳梭孢Neofusicoccum parvum)的代表菌株CMW9081相似性为99%;菌株YZS1-6a、YZS3-3a、YZS7-6a、YZS8-1a、YZS8-1b与B. rhodina(无性型:可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae)的代表菌株CMW9074相似性为99%。
将来源于重庆市不同地区的14份樟树溃疡病菌株以及GenBank上登录的不同国家地区及不同寄主的葡萄座腔菌属菌株的ITS核苷酸序列进行系统进化树分析,结果表明:14份樟树溃疡病菌株聚集为3个不同的分支(图 3),其中,3份形态特征为Ⅰ型的菌株和来源于瑞士李树的菌株CMW8000(登录号AY236949)聚在同一组群;6份形态特征为Ⅱ型的菌株和来源于新西兰杨树的菌株CMW9081(登录号AY236943)聚在同一组群;5份形态特征为Ⅲ型的菌株和来源于墨西哥松树的菌株CMW9074(登录号AY236952)聚在同一组群。此外,将部分代表菌株的ITS、β-tubulin和EF1-α序列组合构建进化树,获得的进化树与根据ITS序列所构建的进化树结果一致(图 4)。因此,本研究中获得的樟树溃疡病菌为3种不同类型的葡萄座腔菌属真菌,分别是B. dothidea、B. parva和B. rhodina。
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将选取的代表菌株接种樟树1年生离体枝条,2 d开始发病,4 d时枝条上形成棕色或黑色的溃疡状病斑。病斑初期棕色,后期变成深褐色,最终变成黑色,溃疡部位软化腐烂并凹陷(图 5A),接种无菌PDA的枝条对照均未发病。对发病枝条进行再分离,所得病原菌与原接种病原菌形态特征一致,且ITS序列相同,符合科赫氏法则,说明分离得到的菌株均为樟树溃疡病的病原菌。采用SPSS软件对不同类型樟树溃疡病菌株接种樟树1年生离体枝条后4 d的病斑长度进行显著性差异分析,结果显示:B. parva菌株的致病性最强,B. rhodina菌株的致病性次之,B. dothidea菌株的致病性最弱,相同种的菌株之间致病性差异不显著(图 5B)。
重庆樟树溃疡病病原菌的鉴定及序列分析
Identification and Sequence Analysis of Canker Pathogen of Camphor Tree in Chongqing
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摘要:
目的 为了明确重庆樟树溃疡病的病原菌种类。 方法 采集重庆市渝中区、北碚区和涪陵区的樟树溃疡病样品进行病原菌的分离与纯化,观察病原菌的形态学特征,对不同菌落形态代表菌株的rDNA-ITS、β-tubulin和EF1-α序列进行扩增和测序,构建系统进化树,并测定其致病性。 结果 从重庆不同地区采集的樟树溃疡病样品中共分离得到48份菌株,单菌丝纯化后得到68株纯化菌株,根据纯化菌株在PDA培养基上的培养特性及分生孢子特征,将其分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3种类型。选取不同类型的代表菌株构建系统进化树,结果表明:这3类菌株分别为葡萄座腔菌属中的Botryosphaeria dothidea、B.parva和B.rhodina。致病性测定结果发现:所有菌株均能使樟树枝条产生黑色坏死病斑,且B.parva菌株的致病性最强,B.rhodina菌株的致病性次之,B.dothidea菌株的致病性最弱。 结论 重庆樟树溃疡病的病原菌为B.dothidea、B.parva和B.rhodina,其中B.rhodina和B.parva为引起樟树溃疡病的首次报道。 Abstract:Objective To identify the pathogen of camphor tree (Cinnamomum camphora) canker disease, the diseased branches of camphor tree were collected from the Fuling, Beibei and Yuzhong district of Chongqing. Method Pathogens were isolated from the diseased samples and purified by single-mycelium tips culture. The species of pathogens were primarily identified by the morphological characterizations of purified strains. To analyze the phylogenetic of the selected strains, the sequences of rDNA-ITS, β-tubulin and EF1-α genes were amplified and sequenced. The selected strains showing different morphological and molecular characteristics were tested for their pathogenicity on detached shoots of camphor. Result A total of 48 isolates were isolated from the diseased camphor tree canker samples in Chongqing, and 68 purified strains were obtained by single-mycelium tip technique. Based on the characterization of fungal colony and conidia, the 68 purified strains were grouped into three types. Fourteen strains from the three types were selected to construct phylogenetic tree. The phylogenetic analysis results showed that the three types belong to Botryosphaeria dothidea (type Ⅰ), B. parva (type Ⅱ) and B. rhodina (type Ⅲ). Pathogenicity tests on the camphor tree shoots showed that all the tested strains could induce canker lesions. Remarkably, the strains of B. parva exhibited the strongest virulence than that of the B. rhodina and B. dothidea strains. The B. dothidea strains showed the weakest virulence. Conclusion B. parva, and B. rhodina are isolated from camphor canker disease for the first time. It is suggested that B. dothidea, B. parva, and B. rhodina are the common causal agents for camphor tree canker diseases in Chongqing. -
Key words:
- camphor tree canker
- / Botryosphaeria
- / sequence analysis
- / pathogenicity
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表 1 樟树溃疡病菌不同类型菌株的分生孢子大小
Table 1. Conidial dimensions of camphor tree canker strains
菌株Strains 分生孢子大小Conidial dimensions 长×宽Length×width/μm (长×宽)平均值±标准误Mean of Length×width±SD/μm 长/宽L/W Ⅰ型 YZS1-2a (18.36~32.23)×(5.55~12.35) (25.64±2.44)×(8.53±1.51) 3.08±0.54 YZS11-1a (19.21~26.21)×(5.42~10.40) (22.36±2.14)×(9.16±0.97) 3.04±0.51 YZS5-1a (21.36~32.24)×(8.55~14.56) (28.16±2.44)×(11.22±1.44) 2.54±0.35 Ⅱ型 YZS9-1a (21.82~32.23)×(9.03~17.96) (26.33±2.35)×(11.79±1.62) 2.48±0.49 YZS9-1b (18.23~29.66)×(7.50~13.58) (24.01±2.17)×(10.40±1.31) 2.34±0.29 YZS1-1a - - - YZS3-2a - - - YZS9-1c - - - YZS9-1d - - - Ⅲ型 YZS1-6a (19.12~26.51)×(10.54~14.86) (22.43±1.45)×(12.62±1.13) 1.79±0.15 YZS3-3a (19.36~26.23)×(9.85~15.48) (22.96±1.53)×(13.27±1.13) 1.74±0.21 YZS8-1a (21.86~29.58)×(12.69~18.19) (26.50±1.66)×(15.32±1.19) 1.74±0.15 YZS8-1b (22.23~33.61)×(12.65~19.97) (28.45±2.29)×(16.41±1.54) 1.74±0.14 YZS7-6a - - - 注:每菌株分别统计50个分生孢子;“-”观察期内未产生分生孢子(30 d)。
Note: The length and width of 50 conidia were measured from each selected strains. “-” No conidia were observed during the observation period (30 days). -
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