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园林废弃物主要包括人工修剪的枝叶和草坪草、自然生长的杂草、自然掉落的枯枝落叶[1],其主要有机成分包括木质素、纤维素、半纤维素等[2]。随着生态文明建设的开展和城市绿化覆盖率的提高,城市中待处理的园林废弃物数量猛增,已成为城市第二大固体废弃物[3],2017年北京市年产园林废弃物已经达到600万吨[4]。堆肥处理等园林废弃物资源化利用是解决该问题的重要途径,堆肥处理可以将园林废弃物转化为有机肥料、栽培基质等产品,同时这些产品对提高土壤肥力、改善土壤物理结构[5]、促进植物生长[6]以及延缓土壤重金属污染等方面有重要作用[7]。有关堆肥的研究集中在调节C/N[8]、堆肥过程控制[9]及外源添加物改良园林废弃物堆肥品质[10]等方面;但园林废弃物堆肥木质素降解周期长、木质素降解率不高等问题依旧存在,如何加快木质素降解成为关键问题。木质素、纤维素及其二者的复合体是限制堆肥快速腐熟的关键因素,其中,木质素的影响作用尤甚[11]。漆酶、锰过氧化物酶[12]和木素过氧化物酶[13]是主要的降解酶类型,酶系对木质素降解的机理已有报道[14]。有研究表明,细菌、真菌对木质素的降解[15]及加速堆肥达到腐熟[16]都具有重要影响。木质素降解细菌的菌种筛选研究较多,然而,目前对木质素降解真菌的研究主要集中在白腐菌类,其他种属真菌的研究相对较少[17],菌种资源库亟待扩充。
本研究以北京地区收集的经过堆肥处理的园林废弃物为材料,从中筛选高效的木质素降解菌,对其进行分子生物学鉴定,并对其降解不同种类的园林废弃物效果进行研究,以期为提高园林废弃物利用率提供优质的菌株资源。
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从经过堆肥处理的园林废弃物材料中共筛选出真菌18株,分别命名为菌株1~18。采用PDA-苯胺蓝平板显色法和PDA-愈创木酚平板褪色法筛选其中具有产生降解木质素相关降解酶能力的菌株。由表 1可看出:有4种真菌在愈创木酚培养基中产生了变色圈,8种真菌在苯胺蓝培养基中产生褪色圈,其中,2种真菌在2种平板中出现显色和褪色圈。愈创木酚培养基中产生变色圈说明真菌具有分泌锰过氧化物酶的能力,苯胺蓝培养基中产生褪色圈说明真菌具有产生漆酶的能力,菌株No.11和No.12可以同时分泌漆酶和锰过氧化物酶。图 1可见:菌株No.11在72 h内于苯胺蓝培养基中出现了褪色圈,且在愈创木酚培养基中出现了最大变色圈,因此,选取菌株No.11进行种属鉴定及后续研究。
表 1 不同菌株在选择培养基中的显色和褪色结果
Table 1. The coloring and decoloring results of different strains on selective mediums
菌株
strains愈创木酚显色时间
Culture time/h苯胺蓝褪色时间
Culture time/h24 48 72 24 48 72 菌株No.1 - - - + + + 菌株No.2 - - - + ++ ++ 菌株No.3 - + + - - - 菌株No.5 - - - + + + 菌株No.7 - - - + + + 菌株No.8 - + ++ - - - 菌株No.9 - - - - - + 菌株No.10 - - - - - + 菌株No.11 + ++ +++ + + + 菌株No.12 + + + + + + 注:-表示不显色(或不褪色);+、+ +、+ + +、+ + + +表示显色(或褪色)圈逐渐增大。
Note: “-” means no coloring (or no decoloring) zone; “+”, “+ +”, “+ + +”, “+ + + +” means bigger coloring (or bigger decoloring) zone gradually. -
菌株No.11在PDA培养基培养24 h的菌落为翠绿色(图 2),培养48 h后出现黄褐色,质地丝柔状,表面有黄褐色絮状颗粒结构。平、薄或具不明显的放射状沟纹。菌落反面近于无色或黄褐色。
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对菌株No.11进行ITS序列测序,测得菌株No.11的ITS序列与Genebank数据库中已注册的相应序列使用BLAST程序进行序列相似性比较分析,从比较结果中选取相似性为99%的已注册菌株,采用Mega5.0软件构建系统进化树图 3。
图 3显示:与菌株No.11同源性相似度较高的菌株属于曲霉属(Aspergillus sp.)和裸胞壳属(Emericella sp.),其中,同源性最高的为构巢曲霉(Aspergillus nidulans (Eidam) G.Winter),其次为Emericella omanensis Y. Horie & Udagawa。结合系统发育树及形态特征,最终确定菌株No.11为构巢曲霉。
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图 4~6表明:在固态发酵过程中,接菌处理的漆酶酶活力均高于对照,在固态发酵第3天,除连翘枝叶组外,其余4个接菌处理的漆酶酶活力仍处在较低水平。固态发酵第9天后,圆柏枝、冬青卫矛叶和连翘枝叶组漆酶酶活力开始逐渐升高。圆柏枝组在第13天漆酶酶活力到达峰值,为342.7 U·L-1。冬青卫矛叶和连翘枝叶组在第15天酶活力达到峰值,分别为388.7和588.5 U·L-1。冬青卫矛枝组和圆柏叶组在第18天酶活力达到峰值,分别为326.3和461.4 U·L-1。酶活性在一定程度上可以反应真菌对木质素的降解能力。分析原因在于,微生物从繁殖到代谢产酶需要一段时间,在固态发酵初始阶段漆酶酶活力较低,随着菌体生长及代谢旺盛,漆酶酶活力也逐渐达到高峰期。总体来看,以叶片为底物的固态发酵中的漆酶酶活力峰值高于以树枝为底物的接菌处理。可能的原因在于树枝中的木质素与纤维素、半纤维素相互结合形成木质纤维素,阻碍了微生物与木质素的接触,不利于木质素降解菌的利用[22]。
图 4 固态发酵中冬青卫矛枝、叶的漆酶酶活力变化
Figure 4. Changes in laccase activity of Euonymus japonicus branches and leaves during composting
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图 7~9表明:在固态发酵中,接菌处理组锰过氧化物酶酶活力均高于对照组,说明添加外源菌株在固态发酵中能够提高锰过氧化物酶的酶活力。固态发酵第5天,除圆柏枝接菌组锰过氧化物酶酶活力较之前有较高提升外,其他各组的酶活力仍处于较低水平。冬青卫矛叶组、连翘枝叶组第5天后酶活力开始逐渐升高,第15天酶活力达到峰值,分别为138.3、73.3 U·L-1。圆柏枝组在第15天酶活力达到峰值128.6 U·L-1。冬青卫矛枝组和圆柏叶组在第21天酶活力达到峰值,分别为121.1、104.6 U·L-1。接菌处理组锰过氧化物酶酶活力随时间的变化趋势和漆酶酶活力的变化趋势基本相近,说明二者的产酶期基本一致,但是从峰值与平均值看,各个接菌处理的锰过氧化物酶酶活力均低于漆酶酶活力,说明菌株主要通过分泌漆酶降解木质素,这与先前平板显色褪色实验得到结果吻合。
图 7 固态发酵中冬青卫矛枝、叶的锰过氧化物酶酶活力变化
Figure 7. Changes in Manganese peroxidase activity of Euonymus japonicus branches and leaves during composting
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在以不同园林废弃物为底物的固态发酵实验中,接种菌株No.11 40 d后各个接菌处理与对照组木质素降解率的测定结果见表 2。使用SPSS软件独立样本t检验分析得出:接种菌株No.11后,5种底物处理组与其对照组的木质素含量差异显著,菌株No.11显著降低了园林废弃物中木质素含量,降解木质素作用明显。以冬青卫矛叶为底物的固态发酵实验中,木质素相对降解率从模拟自然状态下的16.74%提高到了37.40%。冬青卫矛枝与圆柏枝对照组的模拟自然状态下的相对降解率分别为20.74%和23.03%,接菌处理的木质素相对降解率分别提升到43.59%和48.29%。在圆柏叶为底物的处理中,添加菌液对其木质素相对降解率提升效果最好,相对降解率提高值达到了29.90%。在连翘枝叶为底物的固态发酵中,木质素相对降解率从对照组的35.21%提高到52.17%。与冬青卫矛和圆柏的叶、枝对照、连翘枝叶对照相比,堆肥接菌处理的木质素含量分别减少了3.47%、4.90%、3.87%、8.22%、3.82%。多重比较结果表明,添加构巢曲霉对圆柏枝的处理效果与其他处理间差异显著,接菌处理对圆柏枝木质素绝对降解率有更明显的提升效果。对比添加菌液后各个处理组的木质素相对降解率提高值发现:添加菌液对圆柏枝与叶中木质素降解率的提升效果优于连翘枝叶,与冬青卫矛枝叶差异不显著。冬青卫矛枝叶和连翘枝叶的相对木质素降解率提高值间差异不显著,说明添加菌液对二者木质素的降解率提高效果相似。
表 2 不同底物的木质素含量及其降解率变化
Table 2. Variation of lignin content and degradation rate during simulated composting with different substrates
试验材料
Experimental material处理
Treatment木质素含量
Lignin content/%绝对降解率提高值
Increment of absolute degradation rate/%相对降解率
Relative degradation rate/%相对降解率提高值
Increment of relative degradation rate/%堆肥处理前
Before composting堆肥处理后
After composting冬青卫矛叶Euonymus japonicus leaves 处理T 17.08±0.79 10.69±0.48A 3.47±0.69a 37.40±6.51 20.40±4.56ab 对照CK 14.17±0.51B 16.74±4.77 冬青卫矛枝 Euonymus japonicas branches 处理T 21.67±0.87 12.22±0.87A 4.90±1.62a 43.59±2.87 22.44±6.67abc 对照CK 17.12±0.93B 20.74±6.18 圆柏叶Sabina chinensis leaves 处理T 12.92±1.00 8.01±0.13A 3.87±0.56a 38.39±4.12 29.90±2.23c 对照CK 11.88±0.61B 8.12±5.19 圆柏枝 Sabina chinensis branches 处理T 32.50±0.33 16.81±1.27A 8.22±1.32b 48.29±2.26 25.28±3.84bc 对照CK 25.03±0.66B 23.03±4.43 连翘枝叶Forsythia suspensa branches and leaves 处理T 24.17±0.81 11.60±0.49A 3.82±0.45a 52.17±2.81 15.77±1.39a 对照CK 15.42±0.38B 35.21±3.64 注:同列不同大写字母表示同一试验材料内处理与对照组间差异显著,同列不同小写字母表示材料间差异显著(P < 0.05)。
Note: Different capital letters in same column mean significant difference between treatment and control among same material. Different lowercase letters in same column mean significant difference among those materials(P < 0.05).
园林废弃物木质素降解真菌的筛选、鉴别及其能力研究
Study on Screening, Identification and Capability of Lignin-Degrading Fungi for LandscapingWaste
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摘要:
目的 为获得能够高效降解园林废弃物的真菌并研究其降解能力,从经过堆肥处理的园林废弃物中分离和筛选出1株木质素降解能力较强的真菌。 方法 经过形态分析、ITS分子序列分析,构建系统发育树,鉴定出该株木质素降解真菌种属,并利用该菌株进行固态发酵实验,研究其在固态发酵过程中漆酶、锰过氧化物酶的酶活力变化及其对不同园林废弃物中木质素的降解能力。 结果 从经过堆肥处理的园林废弃物中共挑选出真菌18株,筛选出1株高效的木质素降解真菌,编号为菌株No.11,经鉴定该菌株为构巢曲霉(Aspergillus nidulans(Eidam)G.Winter)。以冬青卫矛叶、冬青卫矛枝、圆柏叶、圆柏枝、连翘枝叶为底物的模拟固态发酵的漆酶酶活力峰值分别为388.7、326.3、461.4、342.7、588.5 U·L-1,锰过氧化物酶酶活力峰值分别为138.3、121.1、104.6、128.6、73.3 U·L-1。添加菌株No.11使冬青卫矛叶、冬青卫矛枝、圆柏叶、圆柏枝、连翘枝叶40 d后木质素降解率分别提高了20.40%、22.44%、29.90%、25.28%、15.77%。 结论 筛选出的构巢曲霉对北京地区常见园林废弃物冬青卫矛、圆柏和连翘枝叶中的木质素具有较好的降解能力,在降解园林废弃物方面可能更具有优势。 Abstract:Objective To obtain a fungus that can efficiently degrade landscaping waste, to study its ability to decomposite various landscaping waste, and to select the fungus strain from the composted landscaping waste by a series of isolation and culture. Method The species of lignin decomposition strain were identified by morphological analysis, ITS molecular sequence analysis and phylogenetic tree. Solid-state fermentation experiments were carried out for studying the changes of enzyme activity of laccase (Lac) and manganese peroxidase (MnP) of the strain and their ability to decompose lignin in landscaping waste. Result A total of 18 fungus were selected from the composted landscaping waste and a highly efficient lignin-decomposing fungus was selected. The strain was designated as strain No.11, and was identified as Aspergillus nidulans (Eidam) G. Winter by morphological analysis and ITS molecular sequence analysis. The enzyme activity peaks of laccase and manganese peroxidase in solid canisters were determined using Japanese spindle leaves, Japanese spindle branches, juniper leaves, juniper branches and forsythia as the substrates were 388.7 and 138.3, 326.3 and 121.1, 461.4 and 104.6, 342.7 and 128.6, 588.5 and 73.3 U·L-1. The addition of strain 11 increased the lignin decomposition rate of Japanese spindle leaves, Japanese spindle branches, juniper leaves, juniper branches and forsythia after 40 days, respectively, by 20.40%, 22.44%, 29.90%, 25.28%, and 15.77%. Conclusion The lignin-decomposing fungus, Aspergillus nidulans (Eidam) G. Winter, has a strong ability to decompose the lignin in the branches and leaves of Japanese spindle, juniper and forsythia common to the landscaping waste in Beijing. Aspergillus nidulans (Eidam) G. Winter may have advantages in decomposing landscaping waste. -
Key words:
- landscaping waste
- / lignin-degradation fungi
- / enzyme activity
- / solid-state fermentation
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表 1 不同菌株在选择培养基中的显色和褪色结果
Table 1. The coloring and decoloring results of different strains on selective mediums
菌株
strains愈创木酚显色时间
Culture time/h苯胺蓝褪色时间
Culture time/h24 48 72 24 48 72 菌株No.1 - - - + + + 菌株No.2 - - - + ++ ++ 菌株No.3 - + + - - - 菌株No.5 - - - + + + 菌株No.7 - - - + + + 菌株No.8 - + ++ - - - 菌株No.9 - - - - - + 菌株No.10 - - - - - + 菌株No.11 + ++ +++ + + + 菌株No.12 + + + + + + 注:-表示不显色(或不褪色);+、+ +、+ + +、+ + + +表示显色(或褪色)圈逐渐增大。
Note: “-” means no coloring (or no decoloring) zone; “+”, “+ +”, “+ + +”, “+ + + +” means bigger coloring (or bigger decoloring) zone gradually.表 2 不同底物的木质素含量及其降解率变化
Table 2. Variation of lignin content and degradation rate during simulated composting with different substrates
试验材料
Experimental material处理
Treatment木质素含量
Lignin content/%绝对降解率提高值
Increment of absolute degradation rate/%相对降解率
Relative degradation rate/%相对降解率提高值
Increment of relative degradation rate/%堆肥处理前
Before composting堆肥处理后
After composting冬青卫矛叶Euonymus japonicus leaves 处理T 17.08±0.79 10.69±0.48A 3.47±0.69a 37.40±6.51 20.40±4.56ab 对照CK 14.17±0.51B 16.74±4.77 冬青卫矛枝 Euonymus japonicas branches 处理T 21.67±0.87 12.22±0.87A 4.90±1.62a 43.59±2.87 22.44±6.67abc 对照CK 17.12±0.93B 20.74±6.18 圆柏叶Sabina chinensis leaves 处理T 12.92±1.00 8.01±0.13A 3.87±0.56a 38.39±4.12 29.90±2.23c 对照CK 11.88±0.61B 8.12±5.19 圆柏枝 Sabina chinensis branches 处理T 32.50±0.33 16.81±1.27A 8.22±1.32b 48.29±2.26 25.28±3.84bc 对照CK 25.03±0.66B 23.03±4.43 连翘枝叶Forsythia suspensa branches and leaves 处理T 24.17±0.81 11.60±0.49A 3.82±0.45a 52.17±2.81 15.77±1.39a 对照CK 15.42±0.38B 35.21±3.64 注:同列不同大写字母表示同一试验材料内处理与对照组间差异显著,同列不同小写字母表示材料间差异显著(P < 0.05)。
Note: Different capital letters in same column mean significant difference between treatment and control among same material. Different lowercase letters in same column mean significant difference among those materials(P < 0.05). -
[1] 梁晶, 马光军, 郝冠军, 等.绿化植物废弃物对土壤中Cu、Zn、Pb和Cd形态的影响[J].农业环境科学学报, 2010, 29(3):492-499. [2] Nowak J, Nowak D, Chevallier P, et al. Analysis of composite structure and primordial wood remains in petrified wood.[J]. Applied Spectroscopy, 2007, 61(8):889-895. doi: 10.1366/000370207781540141 [3] 杨晖.园林废弃物的资源化利用探讨[J].安徽农学通报(上半月刊), 2010, 16(15):181-182. [4] Reyes T M, Oviedo E R, Dominguer I, et al. A systematic review on the composting of green waste: Feedstock quality and optimization strategies[J]. Waste Management, 2018, 77:486-499 doi: 10.1016/j.wasman.2018.04.037 [5] 刘景海, 张萍, 吴春水, 等.园林废弃物覆盖对北京市林地土壤养分和团聚体的影响[J].中国水土保持, 2016(6):54-58, 77. doi: 10.3969/j.issn.1000-0941.2016.06.019 [6] 张登晓, 周惠民, 潘根兴, 等.城市园林废弃物生物质炭对小白菜生长、硝酸盐含量及氮素利用率的影响[J].植物营养与肥料学报, 2014, 20(6):1569-1576. [7] 张强, 孙向阳, 任忠秀, 等.园林绿化废弃物堆肥用作花卉栽培基质的效果评价[J].中南林业科技大学学报, 2011, 31(9):7-13. doi: 10.3969/j.issn.1673-923X.2011.09.002 [8] 张强, 孙向阳, 任忠秀, 等.调节C/N及添加菌剂与木酢液对园林绿化废弃物堆肥效果的影响[J].植物营养与肥料学报, 2012, 18(4):990-998. [9] Zhang, L, Sun Xiang-yang, Tian, Y et al. Biochar and humic acid amendments improve the quality of composted green waste as a growth medium for the ornamental plant Calathea insignis[J]. Scientia Horticulturae, 2014, 176:70-78. doi: 10.1016/j.scienta.2014.06.021 [10] 田赟, 王海燕, 孙向阳, 等.添加竹酢液和菌剂对园林废弃物堆肥理化性质的影响[J].农业工程学报, 2010, 26(8):272-278. doi: 10.3969/j.issn.1002-6819.2010.08.046 [11] 李超, 李潞滨, 杨凯, 等.竹伐桩促腐微生物的分离筛选[J].林业科学研究, 2008, 21(2):253-257. doi: 10.3321/j.issn:1001-1498.2008.02.022 [12] Terhi K H, Lundell T, Galkin S, et al. Manganese peroxidases, laccases and oxalic acid from the selective white-rot fungus Physisporinus rivulosus grown on spruce wood chips[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2005, 36(4):461-468. doi: 10.1016/j.enzmictec.2004.10.004 [13] 吴晓丽, 顾小平, 苏梦云, 等.离体毛竹笋纤维素和木质素含量及POD和PAL活性研究[J].林业科学研究, 2008, 21(5):697-701. doi: 10.3321/j.issn:1001-1498.2008.05.019 [14] Songulashvili G, Elisashvili V, Wasser S P, et al. Basidiomycetes laccase and manganese peroxidase activity in submerged fermentation of food industry wastes[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2007, 41(1):57-61. [15] 张金萍, 王敬文, 姜景民, 等.灵芝属木质素降解高效菌株筛选[J].林业科学研究, 2005, 18(1):106-108. doi: 10.3321/j.issn:1001-1498.2005.01.023 [16] 晋果果, 翁海波, 李萍萍, 等.高温木质素降解菌Geobacillus caldoxylosilyticus J16的筛选及其产酶发酵性质研究[J].中国农学通报, 2011, 27(8):334-339. [17] 郭晓威, 王秀然, 解长睿, 等.木质素降解菌株的分离及其降解玉米秸秆过程中产酶特点[J].微生物学报, 2017, 57(12):1806-1816. [18] 周宇光.菌种目录(第四版)[M].北京:科学技术文献出版社, 2012:694. [19] 李雪玲, 姚一建.基于28S rDNA序列构建侧耳属系统发育树[J].菌物报, 2004, 23(3):345-350. [20] 田林双.木质素降解相关酶类测定标准方法研究[J].畜牧与饲料科学, 2009, 30(10):13-15. doi: 10.3969/j.issn.1672-5190.2009.10.005 [21] Gong X Q, Li S Y, Sun X Y, et al. Maturation of green waste compost as affected by inoculation with the white-rot fungi Trametes versicolor and Phanerochaete chrysosporium[J]. Environ. Technol, 2017, 38(1):872-879. [22] Alexander N K, Korneichik T V, Hatakka A, et al. Oxidizability of unsaturated fatty acids and of a non-phenolic lignin structure in the manganese peroxidase-dependent lipid peroxidation system[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2009, 46(2):136-140. [23] 刘海静.小麦秸秆高效降解菌的筛选及应用效果研究[D].北京: 中国农业科学院, 2012. [24] 尹立伟, 池玉杰, 王雪童.灰树花的系统发育分析和主要木质素降解酶的测定[J].林业科学研究, 2010, 23(4):574-580. [25] 习兴梅, 曾光明, 郁红艳, 等.黑曲霉Aspergillus niger木质纤维素降解能力及产酶研究[J].农业环境科学学报, 2007, 26(4):1506-1511. doi: 10.3321/j.issn:1672-2043.2007.04.061 [26] 陈建军, 刘梁涛, 曹香林.高效木质素降解菌的筛选及产漆酶条件的研究[J].甘肃农业大学学报, 2018, 53(4):130-136. doi: 10.3969/j.issn.1003-4315.2018.04.020 [27] 张年磊.霉菌Aspergillus sp.F-1降解木质素化合物及其处理造纸废水的研究[D].湘潭: 湘潭大学, 2017. [28] 周莉娜, 毛晖, 曲东.全氟辛酸和雌二醇对黄孢原毛平革菌过氧化物酶活性的影响[J].农业环境科学学报, 2013, 32(6):1134-1142. [29] Stefan J. G, Frederick C. M, Yitzhak H, et al. Similarity of bacterial communities in sawdust- and straw-amended cow manure composts[J]. FEMS Microbiology Letters, 2004, 233(1):115-123. doi: 10.1016/j.femsle.2004.01.049