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杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)是杜仲科杜仲属落叶乔木,为我国特有名贵经济树种。杜仲皮是名贵中药材,具有补肝肾、强筋骨以及安胎等作用[1]。另外,杜仲是世界上适应范围最广的重要胶源树种[2-3],也是温带最具开发潜力的胶源树种[4]。杜仲胶不仅具有橡(胶)塑(料)二重性,可开发兼具热塑性、热弹性和高弹性的功能材料,如高质量的轮胎、高尔夫球、假肢套等产品[5],杜仲胶还具有绝缘性好,耐酸碱且不易腐蚀等特点,是制造海底电缆绝缘带的理想材料[6]。研究表明,杜仲的根、茎、叶、花、果实的韧皮部薄壁细胞中分布有细长、两端膨大、内部充满胶颗粒的特化丝状单细胞[7-9],它是杜仲植株体内合成和储藏硬性橡胶的场所[10]。研究发现,杜仲果实中含胶率高达12%以上,居杜仲树各部位含胶量之首,比杜仲叶片高46倍[11]。杜仲橡胶也称古塔波胶或巴拉塔胶[12],分子构象测定表明杜仲胶为反式-聚异戊二烯[13],与巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell. Arg.),银胶菊(Parthenium aryentatuim L.)等合成的顺式-聚异戊二烯橡胶互为同分异构体[14]。早期研究者对巴西橡胶研究发现,橡胶树树皮韧皮部含有网络分布的乳汁管可分泌出胶乳,而胶乳中又含有大量包裹有几个到上千个橡胶分子的胶颗粒[15-16],胶颗粒的主要功能是合成和贮藏天然橡胶[17]。显微观察表明,胶颗粒是一类不连续的亚细胞器,内部由橡胶分子组成疏水核心区,外部则由脂类和蛋白质组成的“半单位膜”包裹[18-19]。与橡胶树不同,杜仲树皮韧皮部不含网络状乳汁管,胶颗粒主要存在于含胶细胞中,分离提取及纯化条件相对较为复杂。2003年,王敏杰等[20]采用反复漂洗/离心法对杜仲叶胶颗粒进行了提取纯化,并从杜仲叶胶颗粒上分离鉴定出两种丰度最高膜结合蛋白,EuRPP56和EuRPP30,之后更多参与杜仲胶合成的相关蛋白基因被报道[21-22]。王惠[23]通过改进提取方法,从叶中获得纯度更高的杜仲胶颗粒,但该法仅适用于胶含量累积最高时期的杜仲组织中胶颗粒的提取。因此,探索可适用于杜仲不同生长期各器官中胶颗粒的提取工艺条件,为深入研究杜仲胶颗粒的功能具有重要意义。本研究通过对已有杜仲胶颗粒提取工艺进行改良、优化,并结合胶颗粒形态观察,形成可适用于杜仲各生长期不同组织器官中杜仲胶颗粒的提取条件,进而为研究杜仲胶粒的分化形成机制、杜仲胶分子的累积规律以及杜仲胶合成的分子机制奠定基础。
杜仲胶颗粒提取纯化及胶颗粒显微观察研究
Extraction, Purification and Microscopic Observation of Rubber Particles Extracted from Eucommia ulmoides
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摘要:
目的 建立快速、简便、重复性好、得率高的杜仲胶颗粒提取技术,为进一步分析胶颗粒膜蛋白、脂肪酸、糖脂等组成及杜仲橡胶分子量奠定基础。 方法 以杜仲叶片和翅果为材料,利用不同离心条件及研磨次数探究杜仲胶颗粒得率,并结合光镜与电镜观察结果,探讨适合从不同杜仲组织器官中提取胶颗粒的最优条件。 结果 杜仲组织(叶片或翅果)液氮经速冻、反复研磨捣碎6次过滤10次,在4℃条件下以5 000 g离心力,45度定角离心10 min,并反复漂洗8次得到的杜仲胶颗粒含量最高。在此条件下,以10月采摘的杜仲叶和翅果为材料,提取的杜仲胶颗粒含量可分别达3.70 g·kg-1叶片、5.37 g·kg-1翅果。进一步观察发现,不论是杜仲叶片或翅果随着其发育的成熟,组织中胶颗粒粒径大小和积累量均呈现先增加后稳定的变化趋势。杜仲胶颗粒在光镜和电镜下呈球形,胶颗粒间粒径大小差异较大。以10月杜仲叶、翅果及树皮为例,小胶颗粒(1~4 μm)分别占39%,53%,98.38%,中等胶颗粒(4~7 μm)分别占38%,34%,0.12%,大胶颗粒(7~11 μm)分别占23%,13%,0.05%。 结论 本研究建立的杜仲胶颗粒提取技术较为快捷,得率高,可快速对不同时期不同组织器官的杜仲胶颗粒进行提取。 Abstract:Objective To establish a rapid, simple, reproducible and high yield extraction method of Eucommia ulmoides gum particle in order to investigate its plasma membrane components, including membrane protein, fatty acid, glycolipid and the molecular weight of E. ulmoides gum. Method The leaf and samara of E. ulmoides were selected as extracted materials for analyzing the extraction ratio of E. ulmoides gum particle by changing centrifugal condition and number of grinding, combining with the results of light microscope and electron microscope observation. Result The results showed that the liquid nitrogen quick-frozen E. ulmoides samples (leaf or samara) via 6 times grind, 10 times filter, 5 000 g centrifugal force (45°constant angle) at 4℃ for 10 minutes and 8 times rinse with washing buffer could produce higher extraction yield. Under this condition, the extraction ratios of gum particle from E. ulmoides leaf and samara collected in October, 2018 were 3.70 g·kg-1 and 5.37 g·kg-1, respectively. Further, the morphological observations indicated the size and accumulated content of E. ulmoides gum particle appeared the change rule of increasing at first and then stabilizing and there were significant difference in grain diameter between these gum particles. The results from electron microscopy observation found that small gum particles (1 4 μm) and medium gum particles (4 7 μm) respectively from E. ulmoides leaf, samara and bark (collected in October, 2018) accounted for 39%, 53%, 98.38% and 38%, 34%, 0.12%, while the content of the large gum particles (7 11 μm) were 23%, 13%, 0.05%, respectively. Conclusion A modified approach is proposed to improve the extract efficiency of E. ulmoides gum particles which could be extensively applicable to extraction of gum particles from different organs and tissues of E. ulmoides. -
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