-
土壤中过量的盐分会抑制植物光合作用、诱导产生氧化胁迫、渗透胁迫及离子胁迫等,阻碍植物的正常生长发育进程[1-2]。植物通过合成积累游离脯氨酸、氨基酸和可溶性蛋白质等渗透调节物质,并诱导增强植物体内抗氧化酶如过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)等的活性,从而增强了植物的耐盐能力[3-4]。
水分是植物在盐胁迫下维持正常生长的重要条件。液泡膜内在蛋白(TIPs)和质膜内在蛋白(PIPs)作为植物水通道蛋白(AQPs)家族的重要成员[5],通过调节植物水分运输,影响植物逆境应答,促进盐胁迫下植物生长发育[4]。盐胁迫下,转 TsTIP1;1及TsPIP1;1 基因水稻(Oryza sativa L.)的光合能力显著增强、细胞持水能力明显提高[5];过表达PIP2;1增强了拟南芥(Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.)细胞的持水能力[6]。位于液泡膜上的Na+/H+ 逆向转运蛋白NHX1参与调控植物液泡渗透势,可以把细胞质内过量的Na+ 隔离到液泡内,减轻了拟南芥受到的盐胁迫,从而减弱了盐胁迫对其生长的抑制[7]。
刺槐(Robinia pseudoacacia L.)生长迅速、适应性强,具有耐干旱、耐瘠薄、繁殖快等特点,是盐碱地区造林的先锋树种,具有良好的经济和环境效益[8-9]。近年从逆境生理、品种选育等方面对刺槐的耐盐机理进行了一定研究,然而,盐胁迫下各生理指标对刺槐耐盐能力的影响及刺槐体内相关基因转录表达情况的研究较少。本研究以1年生刺槐幼苗为试验材料,综合分析NaCl胁迫对刺槐幼苗生长、生理、离子含量及相关基因表达的影响,初步解析刺槐耐盐机制,从而为建立刺槐抗逆性生态生理指标体系提供理论依据。
-
以1年生刺槐播种苗为试验材料,在中国林业科学研究院科研温室中进行盆栽(花盆规格:盆高×盆口直径=22 cm×20 cm)培养,基质为V珍珠岩∶V蛭石=3∶1。培养条件为:自然光照;昼夜温度:25/20°C;相对湿度:50%~60%。试验开始前,每株幼苗每2 d浇灌1/2 Hoagland 营养液(pH值5.5)100 mL,待苗高约20 cm时,选取生长一致且健壮的幼苗进行试验。
试验分3个处理组,每个处理组10株幼苗,处理浓度分别为0、50、100 mmol·L−1 NaCl溶液。NaCl处理期间,为保证NaCl浓度的一致性,每3 d用含同等浓度NaCl溶液的1/2 Hoagland营养液淋洗花盆基质,处理27 d后,每个处理组选取6株长势基本一致的幼苗进行收获。
-
收获前,每个处理组随机选取3株幼苗,每株选取3片成熟的叶片,在晴天上午 9: 00—11: 00 用 Li 6400光合作用测量系统 ( LI-Cor, Lincoln, Nebraska, USA) 测定刺槐幼苗叶片的光合作用参数;同时,计算刺槐叶片水分利用效率(WUE) = 净光合速率(A)/蒸腾速率(E)[10]和气孔限制值(Ls) = 1− Ci/Ca (Ci为胞间CO2浓度;Ca为空气中CO2浓度,本试验中该值为400 μmol·mol−1) [11]。
光合测定结束后,收获植株。收获时,根、茎、叶分别收获并记录各部分的生物量。所有材料保存在液氮中,并在液氮中使用球磨仪(NM400,Retsch, Haan, Germany)将其研成粉末,于−80°C保存备用。称取各处理组刺槐根、茎和叶片鲜样60 mg,于65°C烘干,计算样品干湿比及干质量。
-
采用烘干称重法测定各处理组刺槐幼苗叶片相对含水量(RWC)。参照Wellburn[12]提出的方法测定刺槐幼苗叶片中叶绿素含量。
-
根据 Hodges等[13]提出的方法测定刺槐样品中丙二醛(MDA)的含量。
-
根据Tamás等[14]的方法测定样品游离脯氨酸含量。使用氨基酸(AA)含量检测试剂盒(索莱宝,北京)测定样品中氨基酸含量。样品中可溶性蛋白含量参照Luo等[15]的方法测定。
-
将烘干的根和叶片样品研磨粉碎后,过0.5 mm筛,称取0.2~0.3 g样品(精确至0.001 g),置于消煮管中,加入8 mL浓硝酸,摇匀后过夜,并做空白对照。消解前加入2 mL H2O2,静置20 min,随后使用Mars高压微波消解仪(Mars-6,CEM Corp.,USA)消解,之后加热赶酸,待消解液剩余约 2 mL 时停止加热,冷却后过滤到50 mL容量瓶中并定容、摇匀。静置 20 min,吸取上清液 10 mL 至离心管中,使用等离子体发射光谱仪 iCAP 6300(Thermo Scientific,USA)测定Na+、K+、Ca2+、Mg2+ 含量,并计算Na+/K+、Na+/Ca2+、Na+/Mg2+比值。
-
使用植物RNA提取试剂盒(DP432,天根)提取刺槐根和叶样品中总RNA,并进行浓度及纯度检测。使用PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047B,TaKaRa)将纯化后的RNA进行反转录,获得cDNA,然后使用荧光定量PCR仪(ABI7500,Applied Biosystems,USA)进行相对荧光定量(qPCR)分析。引物由北京Invitrogen公司合成,具体信息见表1,内参基因为Actin[18]。
表 1 qRT-PCR 引物信息
Table 1. Primers used for qRT-PCR
基因名称
Gene name引物序列
Primers扩增效率/%
PCR efficiencyTIP 1;1 F: 5′-GCCTCCTTGCTCCTCCTCT-3′ 92 R: 5′-ACAATAGCAGGTCCGAATGATAC-3′ PIP 1;1 F: 5′-TGTCCCTCACAAGAGCCCTAT-3′ 96 R: 5′-GCATCAGTGGCGGAGAAGA-3′ PIP 2;1 F: 5′-AAAGACTACCAAGACCCACCTC-3′ 103 R: 5′-GGAACAACCCAAATGTCACAG-3′ NHX 1 F: 5′-TTTGACAGGTCTACTTAGTGCGT-3′ 102 R: 5′-CAGAATGCCACTCAGATAGGTT-3′ Actin F: 5′- TTGCCTTGGATTATGAACA -3′ 97 R: 5′- GATGGCTGGAACAGAACTT -3′ -
采用2−ΔΔCT法获得qPCR的差异表达倍数。对本试验获得的所有数据使用Statgraphics Centurion XVI.I (STN, St, Louis, MO, USA)软件进行分析。数据分析之前,对其进行正态分布检验。所有数据采用单因素进行分析,以NaCl作为自变量因素。采用LSD法进行数据间差异显著性分析,当F检验的P-Value < 0.05时,认为数据间的差异显著。
-
在NaCl处理下,刺槐幼苗根、茎和叶的干质量均出现不同程度的下降,根冠比增加(表2),说明NaCl处理影响了刺槐的正常生长发育。随NaCl浓度的升高,刺槐幼苗叶片相对含水量显著降低,与0 mmol·L−1 NaCl处理组相比,50、100 mmol·L−1 NaCl处理组刺槐幼苗叶片的相对含水量分别减少了7.0%和18.2%。
表 2 NaCl对刺槐幼苗生物量、根冠比及叶片相对含水量的影响
Table 2. The effects of NaCl concentrations on biomass, root to shoot ratio and leaf relative water content of R. pseudoacacia
NaCl浓度/
(mmol·L−1)根
Root/g茎
Shoot/g叶
Leaf/g根冠比
Root to shoot ratio叶片相对含水量
RWC /%0 0.94 ± 0.06 a 2.26 ± 0.07 a 3.75 ± 0.13 a 0.16 ± 0.007 b 0.907 ± 0.005 a 50 0.73 ± 0.06 b 1.75 ± 0.16 b 2.65 ± 0.18 b 0.17 ± 0.004 b 0.844 ± 0.010 b 100 0.69 ± 0.05 b 1.68 ± 0.08 b 1.91 ± 0.07 c 0.20 ± 0.007 a 0.742 ± 0.014 c P-Value * ** ** ** ** 注:数据为平均值±标准误(n=6),同列不同字母代表差异显著( P ≤ 0.05) ; *: P ≤ 0.05; **: P ≤ 0.01。下同。
Notes: The data is the average ±SE (n=6), different letters in the same column mean significant different in P ≤ 0.05 level; **: P ≤ 0.01. The same below.NaCl处理使刺槐幼苗叶中叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)和类胡萝卜素(Car)均呈下降趋势(表3)。与0 mmol·L−1 NaCl处理组相比,100 mmol·L−1 NaCl 处理使刺槐幼苗叶片Chl a、Chl b和Car含量分别降低了29.8%、30.5%和36.6%。刺槐净光合速率(A)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(E)均随着NaCl浓度增加显著减少,而水分利用效率(WUE)和气孔限制值(Ls)出现不同程度的增加(表4)。100 mmol·L−1 NaCl 处理组刺槐的A、Gs、Ci和E仅为0 mmol·L−1 NaCl处理组刺槐的42.3%、40.0%、84.7%和31.1%。50 mmol·L−1 NaCl 处理对刺槐幼苗叶片的WUE和Ls无显著影响;而100 mmol·L−1 NaCl 处理组刺槐幼苗叶片的WUE和Ls 分别比0 mmol·L−1 NaCl 处理组刺槐升高了39.3%和25.0%。
表 3 NaCl对刺槐幼苗光合色素含量及光合作用参数的影响
Table 3. The effects of NaCl concentrations on photosynthetic pigment content of R. pseudoacacia
NaCl浓度/
(mmol·L−1)叶绿素a
Chl a/(mg g−1)叶绿素b
Chl b/(mg·g−1)类胡萝卜素
Car/(mg·g−1)叶绿素a+b
Chl a+b/(mg g−1)0 9.26 ± 0.80 a 2.69 ± 0.21 a 2.02 ± 0.18 a 11.95 ± 1.02 a 50 7.92 ± 0.05 ab 2.27 ± 0.10 ab 1.48 ± 0.04 b 10.19 ± 0.15 ab 100 6.50 ± 0.05 b 1.87 ± 0.05 b 1.28 ± 0.05 b 8.38 ± 0.11 b P-Value * * ** * 表 4 NaCl对刺槐幼苗光合作用参数、水分利用效率及气孔限制的影响
Table 4. The effects of NaCl concentrations on photosynthetic parameters, WUE and Ls of R. pseudoacacia
NaCl浓度/
(mmol·L−1)净光合速率
A/(μmol· m−2·s−1)气孔导度
Gs/(mol ·m−2·s−1)胞间CO2浓度
Ci/(μmol·mol−1)蒸腾速率
E/ (mmol ·m−2·s−1)水分利用效率
WUE/(μmol·mmol−1)气孔限制值
Ls0 9.7 ± 0.16 a 0.10 ± 0.008 a 252.5 ± 6.3 a 1.64 ± 0.12 a 5.98 ± 0.28 b 0.36 ± 0.03 b 50 6.0 ± 0.27 b 0.07 ± 0.006 b 221.8 ± 13.8 b 1.06 ± 0.08 b 6.14 ± 0.30 b 0.43 ± 0.03 ab 100 4.1 ± 0.26 c 0.04 ± 0.004 c 213.8 ± 7.7 b 0.51 ± 0.05 c 8.33 ± 0.41 a 0.45 ± 0.02 a P-Value ** ** ** ** ** * -
表5表明:在50 mmol·L−1 NaCl处理下,刺槐根和叶中MDA含量均是0 mmol·L−1 NaCl处理组的1.2倍;与0 mmol·L−1 NaCl处理相比,100 mmol·L−1 NaCl处理组刺槐幼苗根和叶中MDA含量虽然出现一定程度增加,但差异不显著。
-
表5表明:随NaCl浓度的增加,CAT、APX和GR的活性变化不同;在根中,与0 mmol·L−1 NaCl 处理组刺槐相比,50 mmol·L−1 NaCl处理对CAT和GR活性无显著影响,但使APX活性显著升高;100 mmol·L−1 NaCl处理使CAT、APX和GR活性显著升高。在叶中,50 mmol·L−1 NaCl处理使CAT活性显著升高,但对APX和GR活性无显著影响;100 mmol·L−1 NaCl处理组刺槐CAT、APX和GR活性分别是0 mmol·L−1 NaCl 处理组的3.0、1.8、1.7倍。
表 5 NaCl对刺槐幼苗根和叶丙二醛含量,过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶活性的影响
Table 5. The effects of NaCl on MDA content, CAT, APX and GR activities in roots and leaves of R. pseudoacacia
NaCl浓度/
(mmol·L−1)丙二醛
MDA/(nmol·g−1)过氧化氢酶
CAT/nKat抗坏血酸过氧化物酶
APX/nKat谷胱甘肽还原酶
GR/nKat根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 0 51.8 ± 3.9 b 86.7 ± 0.7 b 208.0 ± 35.0 b 241.6 ± 19.9 c 182.5 ± 21.0 c 269.8 ± 26.0 b 61.6 ± 9.4 b 76.8 ± 10.3 b 50 62.2 ± 2.1 a 102.8 ± 1.7 a 229.2 ± 32.7 b 399.3 ± 34.4 b 265.9 ± 21.1 b 325.4 ± 14.3 b 46.4 ± 1.8 b 79.0 ± 8.5 b 100 57.3 ± 1.3 ab 93.7 ± 5.2 ab 383.5 ± 35.6 a 721.5 ± 7.0 a 373.0 ± 17.3 a 482.1 ± 17.2 a 145.6 ± 5.4 a 130.0 ± 5.4 a P-Value ns * * ** ** ** ** ** -
NaCl处理导致刺槐幼苗根和叶中游离脯氨酸、氨基酸和可溶性蛋白质出现不同程度升高(表6)。在根中,与0 mmol·L−1 NaCl 处理组相比,50 mmol·L−1 NaCl处理使刺槐幼苗游离脯氨酸、氨基酸和可溶性蛋白质分别升高了72.1%、86.4%和63.2%;100 mmol·L−1 NaCl处理使刺槐幼苗游离脯氨酸升高了74.4%,可溶性蛋白质升高了156.7%,但对氨基酸含量影响不显著。在叶中,与0 mmol·L−1 NaCl 处理组相比,50 mmol·L−1 NaCl处理使刺槐幼苗游离脯氨酸和可溶性蛋白质分别升高了136.4%和64.3%;100 mmol·L−1 NaCl处理使刺槐幼苗游离脯氨酸升高了381.8%,氨基酸升高了21.3%。
表 6 NaCl对刺槐幼苗根和叶中游离脯氨酸、氨基酸及可溶性蛋白质含量的影响
Table 6. The effects of NaCl on free proline, amino acid and soluble protein contents in roots and leaves of R. pseudoacacia
NaCl浓度/
(mmol·L−1)游离脯氨酸
Free proline/(mg·g−1)氨基酸
Amino acid/(μmol·g−1)可溶性蛋白质
Soluble protein/(mg·g−1)根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 0 0.43 ± 0.01 b 0.11 ± 0.03 c 702.4 ± 57.5 b 762.5 ± 64.0 b 17.1 ± 3.4 c 66.1 ± 4.5 b 50 0.74 ± 0.08 a 0.26 ± 0.02 b 1309.6 ± 79.5 a 800.1 ± 25.6 ab 27.9 ± 2.8 b 108.6 ± 7.5 a 100 0.75 ± 0.03 a 0.53 ± 0.03 a 908.8 ± 59.8 b 924.7 ± 38.0 a 43.9 ± 1.5 a 81.0 ± 2.2 b P-Value ** ** ** ns ** ** -
表7表明:随NaCl浓度的增加,刺槐幼苗根和叶中Na+ 含量显著升高,50 mmol·L−1 NaCl处理组刺槐根和叶中Na+ 是0 mmol·L−1 NaCl处理组的2.5和3.1倍,100 mmol·L−1 NaCl处理组刺槐根和叶中Na+ 是0 mmol·L−1 NaCl处理组的4.6和5.6倍,且根中Na+含量高于叶中含量。50、100 mmol·L−1 NaCl处理使刺槐幼苗根中K+ 含量比0 mmol·L−1 NaCl处理组分别降低了16.3% 和11.1%,但对叶中K+ 含量影响不显著。NaCl处理使刺槐幼苗根中Mg2+ 含量逐渐升高,而叶中Mg2+含量逐渐降低,与0 mmol·L−1 NaCl 处理组相比,100 mmol·L−1 NaCl 处理使根中Mg2+含量升高了29.7%,使叶中Mg2+含量下降了28.2%。NaCl处理对刺槐幼苗根和叶中Ca2+ 含量影响不显著。
表 7 NaCl对刺槐幼苗根和叶中离子含量的影响
Table 7. The effects of NaCl on ion contents in roots and leaves of R. pseudoacacia
NaCl浓度/
(mmol·L−1)Na+/(mg·g−1) K+/(mg·g−1) Mg2+/(mg·g−1) Ca2+/(mg·g−1) 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 0 1.99 ± 0.17 c 0.18 ± 0.02 c 16.52 ± 0.09 a 25.93 ± 0.71 a 2.59 ± 0.08 b 5.03 ± 0.30 a 4.69 ± 0.11 a 23.31 ± 0.62 a 50 5.04 ± 0.42 b 0.55 ± 0.12 b 13.82 ± 0.85 b 26.42 ± 0.39 a 3.08 ± 0.26 ab 4.45 ± 0.36 ab 4.79 ± 0.12 a 21.77 ± 1.01 a 100 9.11 ± 0.95 a 1.00 ± 0.07 a 14.69 ± 0.07 b 26.05 ± 0.15 a 3.36 ± 0.07 a 3.61 ± 0.38 b 4.42 ± 0.11 a 22.39 ± 2.02 a P-Value ** ** * ns * ns ns ns NaCl处理下,刺槐幼苗根和叶中Na+/K+、Na+/Mg2+ 和Na+/Ca2+ 显著升高,且NaCl浓度越高,比值越大(表8)。50 mmol·L−1 NaCl处理使根中Na+/K+、Na+/Mg2+ 和Na+/Ca2+ 分别升高了200.0%、110.3%和150.0%,使叶中Na+/K+、Na+/Mg2+ 和Na+/Ca2+ 分别升高了100.0%、200.0%和100.0%。与0 mmol·L−1 NaCl处理组刺槐相比,100 mmol·L−1 NaCl处理组刺槐根中Na+/K+、Na+/Mg2+ 和Na+/Ca2+ 分别升高了4.2、2.5和3.9倍,叶中Na+/K+、Na+/Mg2+ 和Na+/Ca2+ 分别升高了3.0、6.0和3.0倍。
表 8 NaCl对刺槐幼苗根和叶中Na+/K+、Na+/Mg2+ 和Na+/Ca2+ 的影响
Table 8. The effects of NaCl on Na+/K+, Na+/Mg2+ and Na+/Ca2+ in roots and leaves of R. pseudoacacia
NaCl浓度/
(mmol·L−1)Na+/K+ Na+/Mg2+ Na+/Ca2+ 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 0 0.12 ± 0.01 c 0.01 ± 0.001 c 0.78 ± 0.09 c 0.04 ± 0.004 c 0.42 ± 0.03 c 0.01 ± 0.001 c 50 0.36 ± 0.01 b 0.02 ± 0.005 b 1.64 ± 0.01 b 0.12 ± 0.017 b 1.05 ± 0.06 b 0.02 ± 0.004 b 100 0.62 ± 0.07 a 0.04 ± 0.003 a 2.70 ± 0.23 a 0.28 ± 0.019 a 2.07 ± 0.27 a 0.04 ± 0.001 a P-Value ** ** ** ** ** ** -
对刺槐幼苗根和叶中编码水通道蛋白(TIP1;1,PIP1;1和PIP2;1)及Na+/H + 逆向转运蛋白(NHX1)的mRNA 的表达水平进行分析,结果(表9)表明:在刺槐幼苗根中,50和100 mmol·L−1 NaCl处理使TIP1;1、PIP1;1、PIP2;1和NHX1基因的mRNA 表达水平显著升高,分别是0 mmol·L−1 NaCl处理组的6.4、11.1、28.6、6.4倍和5.6、6.1、14.6、3.2倍;在叶中,与0 mmol·L−1 NaCl处理组刺槐幼苗相比,50 mmol·L−1 NaCl处理对TIP1;1、PIP1;1和NHX1基因的mRNA 表达水平影响不显著,100 mmol·L−1 NaCl处理使TIP1;1、PIP1;1和NHX1基因的mRNA表达水平增加了3.7、1.6和1.3倍,但NaCl处理使PIP2;1基因的mRNA 表达水平显著降低。
表 9 NaCl处理对刺槐幼苗根和叶中相关基因表达分析
Table 9. The expression of aquaporin and Na+ / H + reverse transporter genes in roots and leaves of R. pseudoacacia under NaCl treatments.
NaCl浓度/
(mmol·L−1)TIP 1;1 PIP1;1 PIP2;1 NHX1 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 0 0.98 ± 0.02 b 0.95 ± 0.10 b 1.25 ± 0.19 c 1.61 ± 0.31 b 1.01 ± 0.01 c 0.85 ± 0.11 a 0.97 ± 0.06 c 1.42 ± 0.25 b 50 6.31 ± 0.38 a 1.11 ± 0.11 b 13.88 ± 1.52 a 2.46 ± 0.23 b 28.88 ± 1.60 a 0.34 ± 0.11 b 6.22 ± 0.78 a 2.29 ± 0.30 ab 100 5.45 ± 0.75 a 4.45 ± 0.31 a 7.60 ± 1.00 b 4.15 ± 0.71 a 14.75 ± 1.57 b 0.16 ± 0.07 b 3.12 ± 0.58 b 3.24 ± 0.71 a P-Value ** ** ** * ** ** ** ns
刺槐幼苗对NaCl胁迫的生理生化响应
Physiological and Biochemical Responses of Robinia pseudoacacia Seedlings to NaCl Stress
-
摘要:
目的 研究刺槐幼苗对不同浓度NaCl的生理生化响应,为建立刺槐抗逆性生态生理指标体系提供理论依据。 方法 以1年生刺槐幼苗为材料,施加不同浓度NaCl(0、50、100 mmol·L−1),分析其生长、生理及水通道蛋白和Na+/H+逆向转运蛋白基因转录表达变化特征。 结果 在NaCl胁迫下,刺槐生长被抑制,叶片相对含水量、光合色素含量、光合作用参数降低,水分利用效率和气孔限制值升高;根和叶中MDA含量、抗氧化酶(CAT、APX和GR)活性及渗透调节物质(游离脯氨酸、氨基酸和可溶性蛋白质)含量升高;NaCl胁迫改变了刺槐体内Na+、K+、Mg2+的离子平衡状态,但是对Ca2+的含量影响不显著。NaCl胁迫诱导了刺槐根中水通道蛋白基因(TIP1;1、PIP1;1和PIP2;1)、叶中水通道蛋白基因(TIP1;1和PIP1;1)及根和叶中Na+/H+逆向转运蛋白基因NHX1的转录表达。 结论 刺槐通过增加叶片水分利用效率、合成并积累抗氧化酶和渗透调节物质及诱导相关基因转录表达,增强了盐适应能力。 Abstract:Objective To study the physiological and biochemical responses of Robinia pseudoacacia seedlings to NaCl stress, and provide a theoretical basis for establishing an ecological physiological index system of R. pseudoacacia resistance. Method One-year-old R. pseudoacacia seedlings were used to observe the effects of different NaCl concentrations (0, 50, 100 mmol·L−1) on the growth, photosynthetic rate, antioxidant enzyme activities, osmoregulatory substances, ion distribution, the transcriptional expression of aquaporins and Na+/H+ reverse transporters. Result The growth of R. pseudoacacia was inhibited under NaCl stress, with the decreases of relative water content, photosynthetic pigment content and photosynthesis parameters of leaves, and the increase of the water use efficiency and stomatal limit value. The MDA content, antioxidant enzyme activities (CAT, APX and GR) and osmotic regulatory substance (free proline, amino acids and soluble protein) increased in roots and leaves of R. pseudoacacia under NaCl stress. Also, the ion equilibrium of Na+, K+ and Mg2+ in roots and leaves of R. pseudoacacia changed, but there was no significant difference in the content of Ca2+ in roots and leaves under different NaCl concentrations. NaCl stress induced the transcription and expression of the aquaporin gene (TIP1;1, PIP1;1 and PIP2;1) in roots, aquaporin gene (TIP1;1 and PIP1;1) in leaves and Na+/H+ antiporter gene NHX1 in roots and leaves of R. pseudoacacia. Conclusion R. pseudoacacia can improve the salt adaptability by increasing leaf water use efficiency, synthesizing and accumulating antioxidant enzymes and osmotic adjustment substances, and inducing transcriptional expression of related genes. -
Key words:
- Robinia pseudoacacia
- / stress
- / physiological metabolism
- / ionic state
- / aquaporins
-
表 1 qRT-PCR 引物信息
Table 1. Primers used for qRT-PCR
基因名称
Gene name引物序列
Primers扩增效率/%
PCR efficiencyTIP 1;1 F: 5′-GCCTCCTTGCTCCTCCTCT-3′ 92 R: 5′-ACAATAGCAGGTCCGAATGATAC-3′ PIP 1;1 F: 5′-TGTCCCTCACAAGAGCCCTAT-3′ 96 R: 5′-GCATCAGTGGCGGAGAAGA-3′ PIP 2;1 F: 5′-AAAGACTACCAAGACCCACCTC-3′ 103 R: 5′-GGAACAACCCAAATGTCACAG-3′ NHX 1 F: 5′-TTTGACAGGTCTACTTAGTGCGT-3′ 102 R: 5′-CAGAATGCCACTCAGATAGGTT-3′ Actin F: 5′- TTGCCTTGGATTATGAACA -3′ 97 R: 5′- GATGGCTGGAACAGAACTT -3′ 表 2 NaCl对刺槐幼苗生物量、根冠比及叶片相对含水量的影响
Table 2. The effects of NaCl concentrations on biomass, root to shoot ratio and leaf relative water content of R. pseudoacacia
NaCl浓度/
(mmol·L−1)根
Root/g茎
Shoot/g叶
Leaf/g根冠比
Root to shoot ratio叶片相对含水量
RWC /%0 0.94 ± 0.06 a 2.26 ± 0.07 a 3.75 ± 0.13 a 0.16 ± 0.007 b 0.907 ± 0.005 a 50 0.73 ± 0.06 b 1.75 ± 0.16 b 2.65 ± 0.18 b 0.17 ± 0.004 b 0.844 ± 0.010 b 100 0.69 ± 0.05 b 1.68 ± 0.08 b 1.91 ± 0.07 c 0.20 ± 0.007 a 0.742 ± 0.014 c P-Value * ** ** ** ** 注:数据为平均值±标准误(n=6),同列不同字母代表差异显著( P ≤ 0.05) ; *: P ≤ 0.05; **: P ≤ 0.01。下同。
Notes: The data is the average ±SE (n=6), different letters in the same column mean significant different in P ≤ 0.05 level; **: P ≤ 0.01. The same below.表 3 NaCl对刺槐幼苗光合色素含量及光合作用参数的影响
Table 3. The effects of NaCl concentrations on photosynthetic pigment content of R. pseudoacacia
NaCl浓度/
(mmol·L−1)叶绿素a
Chl a/(mg g−1)叶绿素b
Chl b/(mg·g−1)类胡萝卜素
Car/(mg·g−1)叶绿素a+b
Chl a+b/(mg g−1)0 9.26 ± 0.80 a 2.69 ± 0.21 a 2.02 ± 0.18 a 11.95 ± 1.02 a 50 7.92 ± 0.05 ab 2.27 ± 0.10 ab 1.48 ± 0.04 b 10.19 ± 0.15 ab 100 6.50 ± 0.05 b 1.87 ± 0.05 b 1.28 ± 0.05 b 8.38 ± 0.11 b P-Value * * ** * 表 4 NaCl对刺槐幼苗光合作用参数、水分利用效率及气孔限制的影响
Table 4. The effects of NaCl concentrations on photosynthetic parameters, WUE and Ls of R. pseudoacacia
NaCl浓度/
(mmol·L−1)净光合速率
A/(μmol· m−2·s−1)气孔导度
Gs/(mol ·m−2·s−1)胞间CO2浓度
Ci/(μmol·mol−1)蒸腾速率
E/ (mmol ·m−2·s−1)水分利用效率
WUE/(μmol·mmol−1)气孔限制值
Ls0 9.7 ± 0.16 a 0.10 ± 0.008 a 252.5 ± 6.3 a 1.64 ± 0.12 a 5.98 ± 0.28 b 0.36 ± 0.03 b 50 6.0 ± 0.27 b 0.07 ± 0.006 b 221.8 ± 13.8 b 1.06 ± 0.08 b 6.14 ± 0.30 b 0.43 ± 0.03 ab 100 4.1 ± 0.26 c 0.04 ± 0.004 c 213.8 ± 7.7 b 0.51 ± 0.05 c 8.33 ± 0.41 a 0.45 ± 0.02 a P-Value ** ** ** ** ** * 表 5 NaCl对刺槐幼苗根和叶丙二醛含量,过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶活性的影响
Table 5. The effects of NaCl on MDA content, CAT, APX and GR activities in roots and leaves of R. pseudoacacia
NaCl浓度/
(mmol·L−1)丙二醛
MDA/(nmol·g−1)过氧化氢酶
CAT/nKat抗坏血酸过氧化物酶
APX/nKat谷胱甘肽还原酶
GR/nKat根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 0 51.8 ± 3.9 b 86.7 ± 0.7 b 208.0 ± 35.0 b 241.6 ± 19.9 c 182.5 ± 21.0 c 269.8 ± 26.0 b 61.6 ± 9.4 b 76.8 ± 10.3 b 50 62.2 ± 2.1 a 102.8 ± 1.7 a 229.2 ± 32.7 b 399.3 ± 34.4 b 265.9 ± 21.1 b 325.4 ± 14.3 b 46.4 ± 1.8 b 79.0 ± 8.5 b 100 57.3 ± 1.3 ab 93.7 ± 5.2 ab 383.5 ± 35.6 a 721.5 ± 7.0 a 373.0 ± 17.3 a 482.1 ± 17.2 a 145.6 ± 5.4 a 130.0 ± 5.4 a P-Value ns * * ** ** ** ** ** 表 6 NaCl对刺槐幼苗根和叶中游离脯氨酸、氨基酸及可溶性蛋白质含量的影响
Table 6. The effects of NaCl on free proline, amino acid and soluble protein contents in roots and leaves of R. pseudoacacia
NaCl浓度/
(mmol·L−1)游离脯氨酸
Free proline/(mg·g−1)氨基酸
Amino acid/(μmol·g−1)可溶性蛋白质
Soluble protein/(mg·g−1)根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 0 0.43 ± 0.01 b 0.11 ± 0.03 c 702.4 ± 57.5 b 762.5 ± 64.0 b 17.1 ± 3.4 c 66.1 ± 4.5 b 50 0.74 ± 0.08 a 0.26 ± 0.02 b 1309.6 ± 79.5 a 800.1 ± 25.6 ab 27.9 ± 2.8 b 108.6 ± 7.5 a 100 0.75 ± 0.03 a 0.53 ± 0.03 a 908.8 ± 59.8 b 924.7 ± 38.0 a 43.9 ± 1.5 a 81.0 ± 2.2 b P-Value ** ** ** ns ** ** 表 7 NaCl对刺槐幼苗根和叶中离子含量的影响
Table 7. The effects of NaCl on ion contents in roots and leaves of R. pseudoacacia
NaCl浓度/
(mmol·L−1)Na+/(mg·g−1) K+/(mg·g−1) Mg2+/(mg·g−1) Ca2+/(mg·g−1) 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 0 1.99 ± 0.17 c 0.18 ± 0.02 c 16.52 ± 0.09 a 25.93 ± 0.71 a 2.59 ± 0.08 b 5.03 ± 0.30 a 4.69 ± 0.11 a 23.31 ± 0.62 a 50 5.04 ± 0.42 b 0.55 ± 0.12 b 13.82 ± 0.85 b 26.42 ± 0.39 a 3.08 ± 0.26 ab 4.45 ± 0.36 ab 4.79 ± 0.12 a 21.77 ± 1.01 a 100 9.11 ± 0.95 a 1.00 ± 0.07 a 14.69 ± 0.07 b 26.05 ± 0.15 a 3.36 ± 0.07 a 3.61 ± 0.38 b 4.42 ± 0.11 a 22.39 ± 2.02 a P-Value ** ** * ns * ns ns ns 表 8 NaCl对刺槐幼苗根和叶中Na+/K+、Na+/Mg2+ 和Na+/Ca2+ 的影响
Table 8. The effects of NaCl on Na+/K+, Na+/Mg2+ and Na+/Ca2+ in roots and leaves of R. pseudoacacia
NaCl浓度/
(mmol·L−1)Na+/K+ Na+/Mg2+ Na+/Ca2+ 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 0 0.12 ± 0.01 c 0.01 ± 0.001 c 0.78 ± 0.09 c 0.04 ± 0.004 c 0.42 ± 0.03 c 0.01 ± 0.001 c 50 0.36 ± 0.01 b 0.02 ± 0.005 b 1.64 ± 0.01 b 0.12 ± 0.017 b 1.05 ± 0.06 b 0.02 ± 0.004 b 100 0.62 ± 0.07 a 0.04 ± 0.003 a 2.70 ± 0.23 a 0.28 ± 0.019 a 2.07 ± 0.27 a 0.04 ± 0.001 a P-Value ** ** ** ** ** ** 表 9 NaCl处理对刺槐幼苗根和叶中相关基因表达分析
Table 9. The expression of aquaporin and Na+ / H + reverse transporter genes in roots and leaves of R. pseudoacacia under NaCl treatments.
NaCl浓度/
(mmol·L−1)TIP 1;1 PIP1;1 PIP2;1 NHX1 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 根 Root 叶 Leaf 0 0.98 ± 0.02 b 0.95 ± 0.10 b 1.25 ± 0.19 c 1.61 ± 0.31 b 1.01 ± 0.01 c 0.85 ± 0.11 a 0.97 ± 0.06 c 1.42 ± 0.25 b 50 6.31 ± 0.38 a 1.11 ± 0.11 b 13.88 ± 1.52 a 2.46 ± 0.23 b 28.88 ± 1.60 a 0.34 ± 0.11 b 6.22 ± 0.78 a 2.29 ± 0.30 ab 100 5.45 ± 0.75 a 4.45 ± 0.31 a 7.60 ± 1.00 b 4.15 ± 0.71 a 14.75 ± 1.57 b 0.16 ± 0.07 b 3.12 ± 0.58 b 3.24 ± 0.71 a P-Value ** ** ** * ** ** ** ns -
[1] 王 宁, 周晓星, 刘俊祥, 等. 盐胁迫对柳树无性系SH31离子含量及光合作用的影响[J]. 林业科学研究, 2015, 28(4):565-569. doi: 10.3969/j.issn.1001-1498.2015.04.017 [2] Munns R, Tester M. Mechanisms of salinity tolerance[J]. Annual Review of Plant Biology, 2008, 59: 651-681. doi: 10.1146/annurev.arplant.59.032607.092911 [3] Parida A K and Das A B. Salt tolerance and salinity effects on plants: a review[J]. Ecotoxicol Environ Saf, 2005, 60(3): 324-349. doi: 10.1016/j.ecoenv.2004.06.010 [4] Zhu J K. Abiotic Stress Signaling and Responses in Plants[J]. Cell, 2016, 167(2): 313-324. doi: 10.1016/j.cell.2016.08.029 [5] 李 伟, 韩 娇, 黄升财, 等. 小盐芥<italic>TsPIP1;1</italic>与<italic>TsTIP1;1</italic>基因增强转基因水稻耐盐性[J]. 植物营养与肥料学报, 2017, 23(4):957-963. doi: 10.11674/zwyf.17063 [6] 胡景铭, 颜培玲, 张文娥, 等. 过表达毛葡萄<italic>PIP2;1</italic>基因对转基因拟南芥幼苗生长的影响[J]. 分子植物育种, 2018, 16(20):169-177. [7] 边晨凯, 龙定沛, 刘雪琴, 等. 桑树Na<sup>+</sup>/H<sup>+</sup>逆向转运蛋白基因 (<italic>MnNHX1</italic>) 的克隆与耐盐力表达[J]. 林业科学, 2015, 51(8):16-25. [8] Luo Y J, Yuan Y F, Wang R Q,<italic> et al</italic>. Functional traits contributed to the superior performance of the exotic species <italic>Robinia pseudoacacia</italic>: a comparison with the native tree Sophora japonica[J]. Tree Physiology, 2016, 36(3): 345-355. doi: 10.1093/treephys/tpv123 [9] Kou M, Garcia-Fayos P, Hu S,<italic> et al</italic>. The effect of <italic>Robinia pseudoacacia</italic> afforestation on soil and vegetation properties in the Loess Plateau (China): A chronosequence approach[J]. Forest Ecology and Management, 2016, 375: 146-158. doi: 10.1016/j.foreco.2016.05.025 [10] Guy R D, Reid D M, Krouse H R. Factors affecting <sup>13</sup>C/<sup>12</sup>C ratios of inland halophytes. II. Ecophysiological interpretations of patterns in the field[J]. Canadian Journal of Botany, 1986, 64(11): 2700-2707. doi: 10.1139/b86-356 [11] Farquhar G D, Sharkey T D. Stomatal Conductance and Photosynthesis[J]. Annual Review of Plant Biology, 1982, 33(1): 317-345. doi: 10.1146/annurev.pp.33.060182.001533 [12] Wellburn A R. The Spectral Determination of Chlorophylls a and b, as well as Total Carotenoids, Using Various Solvents with Spectrophotometers of Different Resolution[J]. Journal of Plant Physiology, 1994, 144(3): 307-313. doi: 10.1016/S0176-1617(11)81192-2 [13] Hodges D M, Delong J M, Prange F R K. Improving the thiobarbituric acid-reactive-substances assay for estimating lipid peroxidation in plant tissues containing anthocyanin and other interfering compounds[J]. Planta, 1999, 207(4): 604-611. doi: 10.1007/s004250050524 [14] Tamás L, Dudíková J, Durceková K,<italic> et al</italic>. Alterations of the gene expression, lipid peroxidation, proline and thiol content along the barley root exposed to cadmium[J]. Journal of plant physiology, 2008, 165(11): 1193-1203. doi: 10.1016/j.jplph.2007.08.013 [15] Luo Z B, Calfapietra C, Scarascia-Mugnozza G,<italic> et al</italic>. Carbon-based secondary metabolites and internal nitrogen pools in <italic>Populus nigra</italic> under Free Air CO<sub>2</sub> Enrichment (FACE) and nitrogen fertilisation[J]. Plant and Soil, 2008, 304(1-2): 45-57. doi: 10.1007/s11104-007-9518-8 [16] Polle A, Chakrabarti K, Schurmann W,<italic> et al</italic>. Composition and Properties of Hydrogen Peroxide Decomposing Systems in Extracellular and Total Extracts from Needles of Norway Spruce (<italic>Picea abies</italic> L., Karst.)[J]. Plant Physiology, 1990, 94(1): 312-319. doi: 10.1104/pp.94.1.312 [17] Gamble P E, Burke J J. Effect of Water Stress on the Chloroplast Antioxidant System: I. Alterations in Glutathione Reductase Activity[J]. Plant Physiology, 1984, 76(3): 615-621. doi: 10.1104/pp.76.3.615 [18] 王金星, 张利军, 廖资亿, 等. 刺槐实时定量PCR分析中内参基因的选择[J]. 林业科学, 2014, 50(9):167-172. [19] 曹帮华, 郁万文, 吴丽云, 等. 盐胁迫对刺槐无性系生长和离子吸收、运输、分配的影响[J]. 山东农业大学学报: 自然科学版, 2005, 36(3):353-358. [20] Kawa D, Magdalena J, Hector M S,<italic> et al</italic>. Phosphate-dependent root system architecture responses to salt stress[J]. Plant Physiology, 2016, 172(2): 690-706. [21] Rodríguez A A, Córdoba A R, Ortega L,<italic> et al</italic>. Decreased reactive oxygen species concentration in the elongation zone contributes to the reduction in maize leaf growth under salinity[J]. Journal of Experimental Botany, 2004, 55(401): 1383-1390. doi: 10.1093/jxb/erh148 [22] 高明远, 甘红豪, 李清河, 等. 外源水杨酸对盐胁迫下白榆生理特性的影响[J]. 林业科学研究, 2018, 31(6):138-143. [23] 王 文. 唐古特白刺对NaCl胁迫的生理响应机制研究[D]. 甘肃: 甘肃农业大学, 2013. [24] 苏 丹, 李红丽, 董 智, 等. 盐胁迫对白榆无性系抗氧化酶活性及丙二醛的影响[J]. 中国水土保持科学, 2016, 14(2):9-16. [25] 朱金方, 刘京涛, 陆兆华, 等. 盐胁迫对中国柽柳幼苗生理特性的影响[J]. 生态学报, 2015, 35(15):5140-5146. [26] 周 旋, 申 璐, 金 媛, 等. 外源水杨酸对盐胁迫下茶树生长及主要生理特性的影响[J]. 西北农林科技大学学报: 自然科学版, 2015, 43(7):161-167. [27] Chen S L, Li J K, Wang S S,<italic> et al</italic>. Effects of NaCl on shoot growth, transpiration, ion compartmentation, and transport in regenerated plants of <italic>Populus euphratica</italic> and <italic>Populus tomentosa</italic>[J]. Canadian Journal of Forest Research, 2003, 33(6): 967-975. doi: 10.1139/x03-066 [28] 陆嘉惠, 吕 新, 梁永超, 等. 新疆胀果甘草幼苗耐盐性及对NaCl胁迫的离子响应[J]. 植物生态学报, 2013, 37(9):839-850. [29] 靳 娟, 王 依, 鲁晓燕, 等. NaCl胁迫对酸枣幼苗离子吸收与分配的影响[J]. 园艺学报, 2015, 42(5):853-862. [30] Li G W, Peng Y H, Yu X,<italic> et al</italic>. Transport functions and expression analysis of vacuolar membrane aquaporins in response to various stresses in rice[J]. Journal of Plant Physiology, 2008, 165(18): 1879-1888. doi: 10.1016/j.jplph.2008.05.002 [31] Guo L, Wang Z Y, Lin H,<italic> et al</italic>. Expression and functional analysis of the rice plasma-membrane intrinsic protein gene family[J]. Cell Research, 2006, 16(3): 277-286. doi: 10.1038/sj.cr.7310035 [32] Zhu C F, Schraut D, Hartung W,<italic> et al</italic>. Differential responses of maize MIP genes to salt stress and ABA[J]. Journal of Experimental Botany, 2005, 56(421): 2971-2981. doi: 10.1093/jxb/eri294 [33] 王文铖, 崔克辉. 非生物逆境对植物水孔蛋白表达调控的研究进展[J]. 植物生理学报, 2016, 52(4):423-430. [34] 刘 岩, 张 薇, 计东风, 等. NaCI胁迫对桑树种子萌发和Na<sup>+</sup>/H<sup>+</sup>逆向转运蛋白基因表达的影响[J]. 蚕业科学, 2013, 39(5):851-857.