• 中国中文核心期刊
  • 中国科学引文数据库(CSCD)核心库来源期刊
  • 中国科技论文统计源期刊(CJCR)
  • 第二届国家期刊奖提名奖

留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

红脊长蝽感觉神经元膜蛋白基因克隆及组织表达谱分析

宋月芹 白小军 陈庆霄 吕琪卉 孙会忠

引用本文:
Citation:

红脊长蝽感觉神经元膜蛋白基因克隆及组织表达谱分析

    通讯作者: 孙会忠, huizhong66@163.com
  • 中图分类号: Q966

Cloning and Expression Pattern of Sensory Neuron Membrane Protein Genes of Tropidothorax elegans

    Corresponding author: Sun Hui-zhong, huizhong66@163.com
  • CLC number: Q966

  • 摘要: 目的 感觉神经元膜蛋白(SNMP)是至关重要的次要嗅觉蛋白,能够作为信息素识别的标记,而红脊长蝽(Tropidothorax elegans)作为一个重要的农林害虫,这方面的研究还很少。 方法 利用PCR方法对红脊长蝽SNMP基因进行克隆,并通过荧光定量PCR对该基因的表达情况进行分析。 结果 首次克隆和鉴定了红脊长蝽的2个SNMPs基因,并命名为TeleSNMP1TeleSNMP2。序列分析表明,TeleSNMP1编码区开放阅读框长1 497 bp,编码498 aa;而TeleSNMP2编码区开放阅读框长1 686 bp,编码561 aa,这2个基因的等电点分别为8.26和7.05。同源性分析发现,同目昆虫同类SNMP序列一致性较高,不同目昆虫不同类SNMP序列一致性较低。TeleSNMP1TeleSNMP2之间的序列一致性极低。进化树结果也表现同目昆虫同类SNMP基因进化关系最近。定量PCR结果显示,TeleSNMP1主要在雌雄触角中表达,而TeleSNMP2在非触角组织中也有表达。 结论 该结果为今后对红脊长蝽SNMPs基因功能的研究提供了有用的参考。
  • 图 1  红脊长蝽TeleSNMP1和TeleSNMP2与其他昆虫SNMPs的序列比对

    Figure 1.  Alignment of Tropidothorax elegans SNMP1 and SNMP2 with SNMPs from other insects

    图 2  红脊长蝽SNMPs与其他昆虫SNMPs氨基酸序列的系统进化树

    Figure 2.  Phylogenetic tree of the SNMPs of Tropidothorax elegans and other insects based on amino acid sequences by using neighbor-joining method

    图 3  红脊长蝽SNMPs在不同组织中的相对表达量

    Figure 3.  Expression level of SNMPs in different tissues of Tropidothorax elegans

  • [1]

    Kaupp U B. Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities[J]. Nature Reviews Neuroscience, 2010, 11(3): 188-200. doi: 10.1038/nrn2789
    [2]

    Sun L, Xiao H J, Gu S H, et al. Perception of potential sex pheromones and host-associated volatiles in the cotton plant bug, Adelphocoris fasciaticollis (Hemiptera: Miridae): morphology and electrophysiology[J]. Applied Entomology and Zoology, 2014, 49(1): 43-57. doi: 10.1007/s13355-013-0223-1
    [3]

    Zhang J, Walker W B, Wang G. Pheromone reception in moths: from molecules to behaviors[J]. Progress in Molecular Biology and Translational Science, 2015, 130: 109-128.
    [4]

    Benton R, Vannice K S, Gomez-Diaz C, et al. Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila[J]. Cell, 2009, 136(1): 149-162. doi: 10.1016/j.cell.2008.12.001
    [5]

    Leal W S. Odorant reception in insects: roles of receptors, binding proteins, and degrading enzymes[J]. Annual Review of Entomology, 2013, 58: 373-391. doi: 10.1146/annurev-ento-120811-153635
    [6]

    Brito N F, Moreira M F, Melo A C A. A look inside odorant-binding proteins in insect chemoreception[J]. Journal of Insect Physiology, 2016, 95: 51-65. doi: 10.1016/j.jinsphys.2016.09.008
    [7]

    de Fouchier A, Walker W B III, Montagné N, et al. Functional evolution of Lepidoptera olfactory receptors revealed by deorphanization of a moth repertoire[J]. Nature Communications, 2017, 8: 15709. doi: 10.1038/ncomms15709
    [8]

    Yang K, Huang L Q, Ning C, et al. Two single-point mutations shift the ligand selectivity of a pheromone receptor between two closely related moth species[J]. eLife, 2017, 6: e29100. doi: 10.7554/eLife.29100
    [9]

    Rogers M E, Sun M, Lerner M R, et al. Snmp-1, a novel membrane protein of olfactory neurons of the silk moth Antheraea polyphemus with homology to the CD36 family of membrane proteins[J]. Journal of Biological Chemistry, 1997, 272(23): 14792-14799. doi: 10.1074/jbc.272.23.14792
    [10]

    Rogers M E, Krieger J, Vogt R G. Antennal SNMPs (sensory neuron membrane proteins) of lepidoptera define a unique family of invertebrate CD36-like proteins[J]. Journal of Neurobiology, 2001, 49(1): 47-61. doi: 10.1002/neu.1065
    [11]

    Febbraio M, Silverstein R L. CD36: implications in cardiovascular disease[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2007, 39(11): 2012-2030.
    [12]

    Levy E, Spahis S, Sinnett D, et al. Intestinal cholesterol transport proteins: an update and beyond[J]. Current Opinion in Lipidology, 2007, 18(3): 310-318. doi: 10.1097/MOL.0b013e32813fa2e2
    [13]

    Vogt R G, Miller N E, Litvack R, et al. The insect SNMP gene family[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2009, 39(7): 448-456. doi: 10.1016/j.ibmb.2009.03.007
    [14]

    Martin C, Chevrot M, Poirier H, et al. CD36 as a lipid sensor[J]. Physiology & Behavior, 2011, 105: 36-42.
    [15]

    Rogers M E, Steinbrecht R A, Vogt R G. Expression of SNMP-1 in olfactory neurons and sensilla of male and female antennae of the silkmoth Antheraea polyphemus[J]. Cell and Tissue Research, 2001b, 303(3): 433-446. doi: 10.1007/s004410000305
    [16]

    Forstner M, Gohl T, Gondesen I, et al. Differential expression of SNMP-1 and SNMP-2 proteins in pheromone sensitive hairs of moths[J]. Chemical Senses, 2008, 33(3): 291-299. doi: 10.1093/chemse/bjm087
    [17]

    Jin X, Ha T S, Smith D P. SNMP is a signaling component required for pheromone sensitivity in Drosophila[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, 105(31): 10996-11001. doi: 10.1073/pnas.0803309105
    [18]

    Nichols Z, Vogt R G. The SNMP/CD36 gene family in Diptera, Hymenoptera and Coleoptera: Drosophila melanogaster, D. pseudoobscura, Anopheles gambiae, Aedes aegypti, Apis mellifera, and Tribolium castaneum[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2008, 38(4): 398-415. doi: 10.1016/j.ibmb.2007.11.003
    [19]

    Hu Y Y, Xu S F, Wubie A J, et al. Molecular characterization and tissue localization of sensory neuron membrane protein from Chinese honey bee, Apiscerana cerana (Hymenoptera: Apidae)[J]. Applied Entomology and Zoology, 2013, 48(4): 533-545. doi: 10.1007/s13355-013-0215-1
    [20]

    Zhang H J, Xu W, Sun L N, et al. Functional characterization of sensory neuron membrane proteins (SNMPs)[J]. BioRxiv. 2018, Available at: https://doi. org/10.1101/262154.
    [21]

    Zhang H J, Xu W, Chen Q M, et al. A phylogenomics approach to characterizing sensory neuron membrane proteins (SNMPs) in Lepidoptera[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2020, 118: 103313. doi: 10.1016/j.ibmb.2020.103313
    [22]

    Song Y Q, Sun H Z, Du J. Identification and tissue distribution of chemosensory protein and odorant binding protein genes in Tropidothorax elegans Distant (Hemiptera: Lygaeidae)[J]. Scientific Reports, 2018, 8: 7803. doi: 10.1038/s41598-018-26137-6
    [23]

    Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-∆∆CT method[J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408. doi: 10.1006/meth.2001.1262
    [24]

    Huang X L, Liu L, Fang Y Q, et al. Expression of a sensory neuron membrane protein SNMP2 in Olfactory Sensilla of codling moth Cydia pomonella (Lepidoptera: Tortricidae)[J]. Journal of Economic Entomology, 2016, 4(109): 1907-1913.
    [25]

    Sun L, Wang Q, Zhang Y, et al. Expression patterns and colocalization of two sensory neurone membrane proteins in Ectropis oblique Prout, a geometrid moth pest that uses Type-II sex pheromones[J]. Insect Molecular Biology, 2019, 28(3): 342-354. doi: 10.1111/imb.12555
    [26]

    Yang H Y, Ning S Y, Sun X, et al. Identification and characterization of two sensory neuron membrane proteins from Onion Maggot (Diptera: Anthomyiidae)[J]. Journal of Economic Entomology, 2020, 113(1): 418-426.
    [27]

    Herboso L, Talamillo A, Pérez C, et al. Expression of the scavenger receptor class B type I (SR-BI) family in Drosophila melanogaster[J]. International Journal of Developmental Biology, 2011, 55(6): 603-611. doi: 10.1387/ijdb.103254lh
    [28]

    Pregitzer P, Greschista M, Breer H, et al. The sensory neuron membrane protein SNMP1 contributes to the sensitivity of a pheromone detection system[J]. Insect Molecular Biology, 2014, 23(6): 733-742. doi: 10.1111/imb.12119
    [29]

    Gu S H, Yang R N, Guo M B, et al. Molecular identification and differential expression of sensory neuron memebrane proteins in the antennae of the black cutworm moth Agrotis ipsilon[J]. Journal of Insect Physiology, 2013, 59: 430-443. doi: 10.1016/j.jinsphys.2013.02.003
    [30] 胡颖颖, 徐书法, 李 微, 等. 中华蜜蜂感觉神经元膜蛋白基因克隆、组织表达分析及原核表达[J]. 昆虫学报, 2013, 56(1):9-17.

    [31]

    Leal W S, Ishida Y, Pelletier J, et al. Olfactory proteins mediating chemical communication in the navel orangeworm moth, Amyelois transitella[J]. PLoS One, 2009, 4(9): e7235. doi: 10.1371/journal.pone.0007235
    [32]

    Liu C, Zhang J, Liu Y, et al. Expression of SNMP1 and SNMP2 genes in antennal sensilla of Spodoptera exigua (Hübner)[J]. Archives of Insect Biochemistry and Physiology, 2014, 85(2): 114-126. doi: 10.1002/arch.21150
    [33]

    Shan S, Wang S N, Song X, et al. Molecular characterization and expression of sensory neuron membrane proteins in the parasitoid Microplitis mediator (Hymenoptera: Braconidae)[J]. Insect Science, 2020, 27: 425-439. doi: 10.1111/1744-7917.12667
    [34]

    Benton R, Vannice K S, Vosshall L B. An essential role for a CD36-related receptor in pheromone detection in Drosophila[J]. Nature, 2007, 450(7167): 289-293. doi: 10.1038/nature06328
    [35]

    Li P Y, Qin Y C. Molecular cloning and characterization of sensory neuron membrane protein and expression pattern analysis in the diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae)[J]. Applied Entomology and Zoology, 2011, 46(497): 497-504.
    [36]

    Liu S, Qiao F, Liang Q M, et al. Molecular characterization of two sensory neuron membrane proteins from Chilo suppressalis (Lepidoptera: Pyralidae)[J]. Annals of the Entomological Society of America, 2013, 106(3): 378-384. doi: 10.1603/AN12099
    [37]

    Liu S, Zhang Y R, Zhou W W, et al. Identification and characterization of two sensory neuron membrane proteins from Cnaphalocrocis medinalis (Lepidoptera: Pyralidae)[J]. Archives of Insect Biochemistry and Physiology, 2013, 82(1): 29-42. doi: 10.1002/arch.21069
    [38]

    Montell C. A taste of the Drosophila gustatory receptors[J]. Current Opinion in Neurobiology, 2009, 19(4): 345-353. doi: 10.1016/j.conb.2009.07.001
  • [1] 肖政李纪元范正琪殷恒福 . 荔波连蕊茶肌动蛋白基因全长cDNA的克隆及其表达分析. 林业科学研究, 2014, 27(3): 374-380.
    [2] 黄国文管天球赵雨云陈莫林刘宏辉 . 油茶转录因子基因CoSOC1-like的克隆和表达分析. 林业科学研究, 2022, 35(2): 129-139. doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2022.02.015
    [3] 赵天田王贵禧梁丽松马庆华陈新 . 平榛ChWRKY2转录因子的克隆及在低温胁迫下的表达分析. 林业科学研究, 2012, 25(2): 144-149.
    [4] 陈鸿鹏朱凤云吴志华谢耀坚 . 赤桉GAPDH家族基因的克隆及其序列分析. 林业科学研究, 2014, 27(1): 120-127.
    [5] 崔丽莉杨汉奇杨宇明 . 版纳龙竹CONSTANS同源基因的克隆与序列分析. 林业科学研究, 2010, 23(1): 1-5.
    [6] 肖政李纪元范正琪李辛雷殷恒福 . 荔波连蕊茶GA2ox1基因的克隆及表达分析. 林业科学研究, 2016, 29(1): 41-47.
    [7] 赵天田梁丽松马庆华王贵禧 . 平榛ChWRKY28基因克隆及表达模式分析. 林业科学研究, 2016, 29(2): 250-255.
    [8] 万友名马宏刘雄芳张序安静刘秀贤李正红 . 馥郁滇丁香LgFKF1基因的克隆及节律表达分析. 林业科学研究, 2020, 33(1): 99-106. doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2020.01.013
    [9] . 毛竹苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及组织特异性表达分析. 林业科学研究, 2009, 22(3): -.
    [10] . 中国水仙ZDS基因的克隆及表达分析. 林业科学研究, 2009, 22(1): -.
    [11] 孙迎坤李纪元殷恒福范正琪周兴文 . 重瓣山茶花器官发育相关基因CjAPL1的全长克隆与表达分析. 林业科学研究, 2013, 26(4): 473-479.
    [12] 刘攀峰杜红岩乌云塔娜杜兰英孙志强 . 杜仲HDR基因全长cDNA克隆与序列分析. 林业科学研究, 2013, 26(4): 447-453.
    [13] 孙涛王雪庆赵遵岭于淑慧陈晓鸣刘魏魏亓倩杨璞 . 白蜡虫热激蛋白序列分析. 林业科学研究, 2016, 29(5): 778-783.
    [14] 程水源杜何为许锋陈昆松 . 银杏苯丙氨酸解氨酶基因的克隆和序列分析. 林业科学研究, 2005, 18(5): 573-577.
    [15] 刘攀峰杜红岩乌云塔娜黄海燕朱高浦 . 杜仲1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因cDNA全长克隆与序列分析. 林业科学研究, 2012, 25(2): 195-200.
    [16] 周兴文李纪元范正琪 . 金花茶查尔酮异构酶基因全长克隆与表达的初步研究. 林业科学研究, 2012, 25(1): 93-99.
    [17] 范正琪李纪元田 敏李辛雷陈东亮卢孟柱 . 麻疯树磷酸烯酮式丙酮酸羧化酶em>pepc基因全长cDNA克隆及序列分析. 林业科学研究, 2010, 23(3): 349-354.
    [18] 李雪平高志民彭镇华岳永德高健蔡春菊牟少华 . 绿竹咖啡酸-O-甲基转移酶基因(COMT)的克隆及相关分析. 林业科学研究, 2007, 20(5): 722-725.
    [19] 翟立峰张美鑫赵行邓佳成 . 重庆樟树溃疡病病原菌的鉴定及序列分析. 林业科学研究, 2019, 32(3): 18-25. doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2019.03.003
    [20] 冯锦霞王敏杰闫伟 . 乳牛肝菌属分离株分子鉴定及其遗传关系的研究. 林业科学研究, 2008, 21(6): 825-831.
  • 加载中
图(3)
计量
  • 文章访问数:  3527
  • HTML全文浏览量:  2578
  • PDF下载量:  43
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2020-01-07
  • 录用日期:  2020-01-19
  • 网络出版日期:  2021-07-26
  • 刊出日期:  2021-10-20

红脊长蝽感觉神经元膜蛋白基因克隆及组织表达谱分析

    通讯作者: 孙会忠, huizhong66@163.com
  • 1. 河南科技大学林学院,河南 洛阳 471000
  • 2. 宜阳县林业技术指导站,河南 洛阳 471600

摘要:  目的 感觉神经元膜蛋白(SNMP)是至关重要的次要嗅觉蛋白,能够作为信息素识别的标记,而红脊长蝽(Tropidothorax elegans)作为一个重要的农林害虫,这方面的研究还很少。 方法 利用PCR方法对红脊长蝽SNMP基因进行克隆,并通过荧光定量PCR对该基因的表达情况进行分析。 结果 首次克隆和鉴定了红脊长蝽的2个SNMPs基因,并命名为TeleSNMP1TeleSNMP2。序列分析表明,TeleSNMP1编码区开放阅读框长1 497 bp,编码498 aa;而TeleSNMP2编码区开放阅读框长1 686 bp,编码561 aa,这2个基因的等电点分别为8.26和7.05。同源性分析发现,同目昆虫同类SNMP序列一致性较高,不同目昆虫不同类SNMP序列一致性较低。TeleSNMP1TeleSNMP2之间的序列一致性极低。进化树结果也表现同目昆虫同类SNMP基因进化关系最近。定量PCR结果显示,TeleSNMP1主要在雌雄触角中表达,而TeleSNMP2在非触角组织中也有表达。 结论 该结果为今后对红脊长蝽SNMPs基因功能的研究提供了有用的参考。

English Abstract

  • 昆虫的化学感受系统在其生存和繁殖过程中起着极其重要的作用[1-3]。在过去10多年的时间里,研究者对昆虫触角嗅觉信号传导的分子机制研究有了突出的进步。在昆虫嗅觉识别时,气味分子从触角感器孔渗入,然后被气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)或化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)识别和转移,最后激活位于嗅觉感觉神经元(olfactory sensory neurons,OSNs)树突膜上的嗅觉受体(odorant receptors,ORs)或离子型受体(ionotropic receptors,IRs),产生电位,指导昆虫做出相应的行为反应[4-8]。此外,还有一些蛋白如感觉神经元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins,SNMPs)在昆虫气味识别过程中也扮演着至关重要的作用[5]

    昆虫SNMPs也是一种膜蛋白,与脊椎动物CD36家族为同源基因,具有2个跨膜区域,其功能主要是识别和转运亲脂性气味分子如脂肪酸和脂类化合物等[9-14]。昆虫第一个SNMP基因在多音天蚕(Antheraea polyphemus Cramer)中被鉴定,并命名为ApolSNMP1[9]。随后在烟草天蛾(Manduca sexta L.)中发现SNMP的第二个亚类型,即命名为MsexSNMP2[10, 15]。紧接着SNMP的同源基因在鳞翅目Lepidoptera[10, 15-16]、双翅目Diptera[17]、鞘翅目Coleoptera[18]、直翅目Orthoptera[13]和膜翅目Hymenoptera[19]等昆虫中都有发现。一直以来被认为SNMP基因家族就2个成员,即SNMP1和SNMP2。最近昆虫SNMP家族的第三个成员SNMP3在鳞翅目中被鉴定[20-21],但认为该基因的主要功能与昆虫的免疫反应有关,这还需要进一步的去证明。

    红脊长蝽(Tropidothorax elegans Distant)属半翅目(Hemiptera)长蝽科(Lygaeidae),主要为害刺槐(Robinia pseudoacacia L.)、辣椒(Capsicum annuum L.)、葫芦(Lagenaria siceraria Molina)、油菜(Brassica napus L.)、大白菜(Brassica pekinensis Lour.)和小麦(Triticum aestivum L.)等多种植物,食性较杂。关于红脊长蝽的嗅觉基因研究较少,本研究通过前期红脊长蝽触角转录组测序结果[22],鉴定了红脊长蝽的2个SNMP基因,即TeleSNMP1TeleSNMP2,并通过荧光定量PCR技术对红脊长蝽TeleSNMP1TeleSNMP2在不同组织中的表达情况进行分析,为进一步探索红脊长蝽SNMPs的化学通讯功能奠定基础。

    • 红脊长蝽来自河南科技大学林学院昆虫实验室,该群体为自2014年7月在洛阳周边(112˚26′ E,34˚43′ N)蔬菜地采集的成虫,然后在温室内继代饲养至今。温室条件为:温度25 ± 2℃,相对湿度60% ± 5%,光周期14L∶10D。

    • 选取红脊长蝽羽化后第3 d的雌雄成虫,收集触角各100头、头部各30头、胸部各20头、腹部各5头、足各50头、翅各50头,每个样品收集材料重复3次。将红脊长蝽各部分组织解剖后立即放入浸在液氮中的1.5 mL离心管内,然后保存于−80℃中。

      总RNA的提取采用RNAiso Plus Kit(TaKaRa,北京)试剂盒进行,并使用RNase-free DNase I(TaKaRa,北京)对提取的RNA进行除DNA处理。采用1%的琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000c分光光度计(Thermo Scientific)进行质量检测。采用PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa,北京)试剂盒对RNA进行反转录。

    • 从本实验室前期对红脊长蝽触角转录组测序注释结果中[21]搜素到2个SNMP基因。根据该序列设计特异性引物,TeleSNMP1-F:5′-ATGGCTGCACCACTGAGG-3′,TeleSNMP1-R:5′- CTAGTACTTTGCCGGGGGTG-3′;TeleSNMP2-F:5′-ATGACGAAGGTGCTGTTCCC-3′,TeleSNMP2-R:5′-TTAGCTTGTGAGAGTCCTTTTGA-3′,进行PCR扩增。PCR反应体系为20 μL:雌蛾触角cDNA模板1 μL,上下游引物各1.5 μL(10 μmol·L−1),dNTPs混合液1.6 μL(2.5 μmol·L−1),Ex Taq DNA聚合酶0.2 μL(TaKaRa,大连),10 × Ex Taq buffer 2 μL,ddH2O为12.2 μL。PCR反应条件为:94℃ 5 min;94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s,35个循环;最后72℃ 10 min。胶回收目的片段,将目的片段克隆到pMDTM19-T载体上,转化DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆培养过夜,送去测序。

    • 核酸序列采用在线工具(http://www.bio-soft.net/sms/)翻译;采用(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)在线工具进行跨膜区域预测;利用在线工具(https://web.expasy.org/protparam/)对蛋白序列特性进行分析;蛋白亲疏水性采用在线工具(https://web.expasy.org/protscale/)分析;序列比对采用线下DNAMAN进行多重序列比较;进化树采用线下MEGA 6.0构建。

    • 通过荧光定量PCR检测红脊长蝽SNMPs基因在不同组织中的表达情况。根据红脊长蝽SNMPs基因的开放阅读框和荧光定量引物设计原则设计特异性引物,TeleSNMP1-F:TCACCATCCCTCATCCA,TeleSNMP1-R:TCTTCGCCGTCTTTCAT,TeleSNMP2-F:TGTGGGAACGGAACTCT,TeleSNMP2-R:GCACCTTGGCACTTTG。内参基因为红脊长蝽Actin基因(基因登陆号为MG322127),引物为:TeleActin-F:CAAGGACGAAACAATCA;TeleActin-R:GAGAATACACTCCCAGAAC。

      荧光定量PCR被执行在ABI 7500 PCR仪(ABI,Carlsbad,CA,USA)上进行,每个反应体积20 μL,包括10 μL的2 × SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa,大连)、0.8 μL的正反向引物(10 μmol·L−1)、2 μL的cDNA模板(200 ng)和6.4 μL的DEPC水。PCR循环遵循95℃ 30 s,然后95℃ 5 s,53℃ 31 s,共循环40个周期。试验重复3次。

    • 红脊长蝽SNMPs基因在不同组织中的相对表达量采用公式2−∆∆CT[23]计算。利用SPSS 17.0软件中的ANOVA方法对TeleSNMPs在红脊长蝽不同组织中的表达量进行显著性差异比较(新复极差法检验,P ≤ 0.05)。

    • 将测序结果在NCBI上进行同源性搜索,结果表明所测序列与多种昆虫的SNMP基因序列高度同源,证明这2个基因就是红脊长蝽的SNMP基因,并分别命名为TeleSNMP1TeleSNMP2,在NCBI基因登陆号分别为MW442946和MW442947。

      这2个SNMPs基因都具有全长的开放阅读框,TeleSNMP1长度为1 497 bp,编码498个氨基酸(图1);而TeleSNMP2长度为1 686 bp,编码561个氨基酸。这2个基因都是酸性,TeleSNMP1的等电点是8.26,蛋白分子量是55.59 kD;TeleSNMP2的等电点是7.05,蛋白分子量是63.37 kD。

      TeleSNMP1TeleSNMP2在氨基酸序列的N-端和C-端各有一个跨膜区域,其中TeleSNMP2在氨基酸第158和180之间还有一个跨膜区域。在膜外区域6个保守的半胱氨酸残基位点被预测(图1),这6个保守的半胱氨酸位点与CD36基因家族相似。

      图  1  红脊长蝽TeleSNMP1和TeleSNMP2与其他昆虫SNMPs的序列比对

      Figure 1.  Alignment of Tropidothorax elegans SNMP1 and SNMP2 with SNMPs from other insects

    • 将红脊长蝽TeleSNMP基因与已报道的其他昆虫SNMP基因的氨基酸序列在NCBI中的Blastp在线搜索工具进行同源性分析,发现TeleSNMP基因与不同种类昆虫SNMP基因一致性差别较大。与同目昆虫SNMP基因一致性较高,如TeleSNMP1与茶翅蝽 (Halyomorpha halys Stal) HhalSNMP1序列一致性在81.33%;与苜蓿盲蝽 (Adelphocoris lineolatus Goeze) AlinSNMP1序列一致性在68.54%;与不同目昆虫SNMP基因一致性较低,如TeleSNMP1与斑痣悬茧蜂 (Meteorus pulchricornis Wesmael) MpulSNMP1序列一致性在43.44%。但TeleSNMP2与所有昆虫SNMP基因一致性都不高,如与茶翅蝽HhalSNMP2序列一致性在48.68%;与苜蓿盲蝽AlinSNMP2序列一致性在41.18%;与德国小蠊 (Blattella germanica Linnaeus) BgerSNMP1序列一致性在46.22%。TeleSNMP2与玉带凤蝶 (Papilio polytes L.) PpolSNMP2序列一致性在30.94%;与亚洲小车蝗 (Oedaleus asiaticus Bei-Bienko) OasiSNMP2序列一致性在34.76%。红脊长蝽TeleSNMP1TeleSNMP2之间序列一致性仅有29.66%。

      使用MEGA6.0对9个目的36种昆虫SNMP同源基因进行进化树比较。SNMPs基因被分成2个亚组,即SNMP1和SNMP2(图2),每亚组中同目昆虫SNMP基因同源性最高。红脊长蝽的TeleSNMP1TeleSNMP2基因分别被集聚到这2个亚组,并且与同为半翅目昆虫的苜蓿盲蝽、茶翅蝽和黑肩绿盲蝽SNMP基因进化关系最近,与其他目昆虫SNMP关系较远。

      图  2  红脊长蝽SNMPs与其他昆虫SNMPs氨基酸序列的系统进化树

      Figure 2.  Phylogenetic tree of the SNMPs of Tropidothorax elegans and other insects based on amino acid sequences by using neighbor-joining method

    • 使用荧光定量PCR对红脊长蝽TeleSNMP1TeleSNMP2在不同组织中的表达情况进行分析,结果发现:TeleSNMP1TeleSNMP2在雌雄蛾触角中高度表达,TeleSNMP1在雄蛾触角中的表达量明显高于雌蛾,TeleSNMP2的表达情况刚好相反,即TeleSNMP2在雌蛾触角中的表达量明显高于雄蛾。除触角外,TeleSNMP1几乎不在其他组织中表达或表达量甚微。TeleSNMP2除在触角中表达量丰富外,在足和翅中也有少量表达(图3)。

      图  3  红脊长蝽SNMPs在不同组织中的相对表达量

      Figure 3.  Expression level of SNMPs in different tissues of Tropidothorax elegans

    • 本研究根据前期红脊长蝽触角转录组的数据,通过BLASTX在线搜索和同源性比较鉴定出2个SNMPs基因,即TeleSNMP1TeleSNMP2。这2个基因与其他昆虫SNMPs具有类似的特征,如在氨基酸序列N端和C端附近有2个保守的跨膜区域,并且由6个保守的半胱氨酸残基形成二硫键组成一个大的胞外环,此结构也与CD36基因家族极其相似[24-26]。根据对这2个跨膜蛋白结构投影预测,这部分的功能是转运和结合脂类分子[27-28],我们可推测红脊长蝽SNMPs的2个跨膜区具有同样的功能。但红脊长蝽TeleSNMP2在氨基酸序列第158和180之间多了1个跨膜区域,目前关于SNMPs基因具有3个跨膜区域的报道还没有,可能是鉴定的SNMPs数量还不够庞大,也可能长期进化形成的。

      红脊长蝽TeleSNMP基因同源性搜索发现TeleSNMP基因与不同种类昆虫SNMP基因一致性差别较大。与同目昆虫SNMP基因一致性较高,与不同目昆虫SNMP基因一致性较低。红脊长蝽TeleSNMP1TeleSNMP2之间分歧也比较大。进化树结果也显示,红脊长蝽TeleSNMP1TeleSNMP2分别被集聚到SNMP1和SNMP2两个亚组,在同一组内同目昆虫的SNMP基因进化关系最近,与其他目昆虫SNMP关系较远。此结果与大多数昆虫SNMP基因特性相同[26,29-30]。在鳞翅目中曾经鉴定出SNMP3亚家族基因[20],而在红脊长蝽触角转录组数据中没有发现该基因,可能是这个基因在幼虫肠中高度表达的原因。

      组织特异性表达可以为功能预测提供可靠性的参考。我们研究发现红脊长蝽SNMP1主要表达在雌雄蛾的触角中,此结果与多音蚕蛾[9]、脐橙螟(Amyelois transitella Walker)[31]、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Htibner)[32]和中红侧沟茧蜂(Microplitis mediator Haliday)[33]等多种昆虫SNMP1的表达模式相同。Benton等[34]在果腹黑蝇(Drosophila melanogaster wDm)中发现,DmelSNMP1能够识别集合信息素cVA,激活受体HR13。Pregitzer等[28]在烟芽夜蛾(Heliothis virescens Fabricius)中也发现,HvirSNMP1能明显增强HR13对信息素Z11-16:Ald的结合力。以上研究都暗示昆虫SNMP1的功能是调节信息素的识别和通过SNMP-OR互作转运信息素。相对于TeleSNMP1TeleSNMP2的表达相对广泛,除嗅觉感器触角外,在非嗅觉感器足中也有少量表达,此结果与小菜蛾(Plutella xylostella L.)[35]、二化螟(Chilo suppressalis Walker)[36]、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis G.)[37]、甜菜夜蛾[31]和中红侧沟茧蜂[32]一致。昆虫身体上分布有大量的味觉感器[38],而CD36蛋白的主要功能是转运脂类化合物,因此可推测TeleSNMP2和GRs在这些组织中共同表达,识别脂类分子完成味觉过程。

    • 本研究首次克隆和鉴定了红脊长蝽的2个SNMPs基因,即TeleSNMP1TeleSNMP2。同目昆虫同类SNMP同源序列一致性较高,反之,不同目昆虫不同类SNMP同源序列一致性较低。同样,TeleSNMP1TeleSNMP2之间的序列一致性也极低。TeleSNMP1主要在雌雄触角中特异性表达,而TeleSNMP2除触角外,在非触角组织中也有表达。

参考文献 (38)

目录

    /

    返回文章
    返回