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短枝木麻黄(Casuarina equisetifolia L.)为木麻黄科(Casuarinaceae)木麻黄属(Casuarina)常绿乔木,原产于澳大利亚、太平洋诸岛以及亚洲东南部,喜高温多湿气候,适生于海岸的疏松沙地[1-2]。木麻黄生长迅速、耐干旱,并具有防风固沙、耐盐碱和生物固氮等特殊功能,被广泛用于热带和亚热带沿海防护林的建设,是我国东南和华南沿海地区不可替代的沿海防护林树种和当家树种,同时也是重要的经济林和园林绿化树种[2-6]。近年来,由于抗病品种缺乏、栽培经营措施不当以及自然灾害等因素的影响,木麻黄病虫害的发生也日趋严重,其中,青枯病是发生规模最大、危害最严重的病害[7]。木麻黄青枯病是由劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种系统性维管束病害,被称为木麻黄的“癌症”或“绝症”,青枯病也是目前世界范围内传播广泛、危害严重、最难防治的重大细菌性病害之一,可危害54个科的450余种植物[2, 8]。木麻黄青枯病的大面积发生,严重制约着沿海木麻黄防护林的健康发展,对我国东南沿海的生态环境和生态安全构成了严重威胁,目前尚无有效的防控措施[4, 9-10]。
根际微生物是受植物影响最大的土壤微生物类群,蕴含着极其丰富的微生物资源[11]。根际土壤中的有益微生物可通过直接或间接的方式促进植物生长、防治由病原菌引起的多种植物病害[12-13]。因此,根际微生物是重要生物活性产物的来源,探究和开发根际微生物为生物防治病虫害问题以及提高农林业的经济价值提供了广阔前景[14]。放线菌是根际微生物中一类重要的微生物资源,目前基于微生物源活性先导化合物而研发的抗生素、免疫抑制剂、抗真菌、抗肿瘤以及抑制炎症等药物绝大多数来源于放线菌[15-16]。Elshafie等[17]从金合欢(Vachellia farnesiana (L.) Wight & Arn.)和油橄榄(Canarium oleosum (Lam.) Engl.)中分离到2株根际放线菌可以很好的保护番茄(Solanum lycopersicum L.)免受核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的侵染;方正等[18]从金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)根际土壤中分离出164株放线菌,其中,部分放线菌对多种供试细菌均表现出抑菌活性;叶景静等[19]从红树林根际土壤中分离出88株放线菌,其中,7株放线菌对至少一种供试细菌具有抗菌活性;吴佳等[20]从缬草(Valeriana officinalis L.)根际土壤中共分离出118株放线菌,其中,33株放线菌对病原菌有较好的抑制效果;Kumari等[21]发现,植物根际放线菌的粗提物对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、变形杆菌(Proteus vulgaris)以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表现出明显的抑制作用。放线菌可产生次生代谢产物抑制某些病原菌生长,促进植物生长发育,一些放线菌还可以侵染植物诱导其产生大量的活性次生代谢产物[22-23]。木麻黄是一种特殊类型的共生营养型植物,对木麻黄共生固氮菌和菌根菌的研究一直是木麻黄研究的热点[24]。Gunasekera等[25]从木麻黄固氮根瘤中分离到Frankia sp.、Micromonospora sp.和新的共生放线菌链霉菌属(Streptomyces sp.),其中,链霉菌属放线菌能明显促进木麻黄侧根的生长。而目前对于木麻黄根际土壤放线菌的报道较少,Abhijit等[26]从印度不同地区的木麻黄根际土壤中共分离到14株链霉菌属放线菌,其中部分放线菌对3种供试细菌(Bacillus subtilis、Escherichia coli和Xanthomonas citri)中的1种或2种表现出抑菌活性,所有放线菌对供试植物病原真菌(Fusarium oxysporum)都表现出抑制活性。本研究通过采集短枝木麻黄根际土壤,分离鉴定根际土壤中的放线菌,并测定短枝木麻黄根际放线菌次生代谢产物的抗细菌活性,从中筛选出抗劳尔氏菌的活性菌株,进一步采用HPLC分析活性菌株次生代谢产物的情况,以期为木麻黄青枯病的生物防治以及放线菌资源的综合开发和利用提供理论依据。
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通过菌落形态观察,对从短枝木麻黄根际土壤中分离到的放线菌进行初步合并,最终从木麻黄根际土壤中共分离得到12株不同的放线菌,其菌落形态见图1。从图1中可看出:在相同的生长时间内,大多数放线菌单菌落为白色、圆形,但菌落的大小有所差别,菌株Ceaf-6的单菌落最大,生长速度较快;菌株Ceaf-9、Ceaf-19和Ceaf-23的单菌落相对较小,且菌株Ceaf-23后期培养基颜色会变深。
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基于短枝木麻黄根际放线菌16S rRNA基因序列构建的系统发育树(图2)表明:菌株Ceaf-9、Ceaf-19、Ceaf-20、Ceaf-21、Ceaf-22和Ceaf-23与菌株S. luteogriseus聚在同一大支上,亲缘关系较近,但自展值只有89,且遗传距离也不相同,进一步通过序列比对发现并不是同一菌株,因此,以上菌株未鉴定到种。菌株Ceaf-15与S. hawaiiensis(登录号为MZ389914.1)聚在同一支上,且自展值为98,最大相似度为99.65%,因此,菌株Ceaf-15最终鉴定为S. hawaiiensis(登录号为MK764957)。按照同样的分类依据,综合菌落形态以及构建的系统发育树,短枝木麻黄根际放线菌的最终鉴定结果见表1。BLAST结果显示:所有菌株与最大相似菌株的相似性均在97%以上。分离到的12株短枝木麻黄根际放线菌均为链霉菌属(Streptomyces sp.)放线菌,说明链霉菌属放线菌为短枝木麻黄根际土壤中的优势菌群。
Figure 2. Phylogenetic tree of rhizospheric actinomycetesin Casuarina equisetifolia based on gene sequences of 16S rRNA
菌株
Strains登录号
Accession number鉴定结果
Identification results最大相似菌株
Closest related species相似度
Similarity/%Ceaf-1 MK764943 S. seoulensis FJ486370.1 S. seoulensis 99.93 Ceaf-4 MK764946 S. spinosus MZ901362.1 S. spinosus 99.44 Ceaf-6 MK764948 S. murinus NR041414.1 S. murinus 99.72 Ceaf-9 MK764951 Streptomyces sp. MG547740.1 S. luteogriseus 99.37 Ceaf-12 MK764954 S. chattanoogensis KM573812.1 S. chattanoogensis 99.93 Ceaf-15 MK764957 S. hawaiiensis MZ389914.1 S. hawaiiensis 99.65 Ceaf-16 MK764958 S. angustmyceticus MZ317444.1 S. angustmyceticus 99.86 Ceaf-19 OP714397 Streptomyces sp. ON623507.1 S. luteogriseus 99.16 Ceaf-20 OP714398 Streptomyces sp. GQ985454.1 S. luteogriseus 99.36 Ceaf-21 OP714399 Streptomyces sp. OP679872.1 S. luteogriseus 98.66 Ceaf-22 OP714400 Streptomyces sp. OM362926.1 S. luteogriseus 99.44 Ceaf-23 OP714401 Streptomyces sp. NR041128.1 S. luteogriseus 97.90 Table 1. Identification results of rhizospheric actinomycetes isolated from Casuarina equisetifolia
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短枝木麻黄根际放线菌次生代谢产物对4种供试细菌的抑制活性见表2。4种供试细菌中,木麻黄青枯病菌和大肠杆菌为革兰氏阴性菌,枯草芽孢杆菌和溶血葡萄球菌为革兰氏阳性菌。由表2可知:不同放线菌次生代谢产物对4种供试细菌的抑制活性差异较大,但对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑制活性未表现出明显差异。菌株Ceaf-9和Ceaf-23提取物均未表现出任何抑菌活性,其他提取物均表现出一定的抑菌活性,但对不同供试细菌的抑菌活性差异较大;菌株S. spinosus Ceaf-4提取物对木麻黄青枯病菌、大肠杆菌及溶血葡萄球菌的抑菌斑直径均大于10 mm,表现出较强的抑菌活性;菌株S. chattanoogensis Ceaf-12对木麻黄青枯病菌的抑菌斑直径也大于10 mm,但菌株Ceaf-4抑菌斑的Rf值为0.30~0.57,而菌株Ceaf-12抑菌斑的Rf值为0.45~0.58,说明菌株Ceaf-4对青枯病菌的抑制活性更强;Rf越小,化合物的极性越大,多数放线菌抑菌斑的Rf值为0.30~0.50,说明具有活性的化合物多为极性中等偏大的化合物。综上所述,菌株S. spinosus Ceaf-4和S. chattanoogensis Ceaf-12对木麻黄青枯病菌表现出较强的抑制活性。
供试样品
Tested samplesRf值(抑菌斑直径)
Rfvalue (Inhibition spot diameter)木麻黄青枯病菌
R.solanacearum枯草芽孢杆菌
B. subtilis大肠杆菌
E. coli溶血葡萄球菌
S.haemolyticusCeaf-1 — 0.48~0.52+ 0.52~0.53++ 0.22~0.27+; 0.32~0.37+ Ceaf-4 0.30~0.57+++ 0.40~0.52++ 0.37~0.53+++ 0.00~0.53+++ Ceaf-6 0.18~0.38++; 0.48~0.50++ — 0.53~0.55++ — Ceaf-9 — — — — Ceaf-12 0.45~0.58+++ 0.15~0.23+; 0.28~0.37++ 0.32~0.43++ 0.25~0.37++ Ceaf-15 0.47~0.50+ 0.32~0.37+ — — Ceaf-16 — 0.32~0.35+ — — Ceaf-19 0.33~0.45+ — — — Ceaf-20 0.45~0.55++ 0.42~0.52++ 0.47~0.50++ 0.33~0.53+++ Ceaf-21 0.45~0.58++ 0.40~0.45++ 0.48~0.53++ 0.33~0.52++ Ceaf-22 0.38~0.52+ 0.23~0.43++ 0.28~0.42++ — Ceaf-23 — — — — 硫酸链霉素 +++ +++ +++ +++ 注:“—”表示无抗菌活性; “+”表示抑菌斑最大直径d<5 mm,“++ ”表示5 mm≤d<10 mm,“+++”表示d ≥10 mm;阳性对照硫酸链霉素仅在原位点样。
Notes: —: Inhibition spot was not observed;+: Maximum inhibition spot diameter (d)<5 mm;++ : 5 mm≤ d <10 mm;+++: d ≥10 mm;Thepositive control streptomycin sulfate was only sampled on TLC plate.Table 2. Antibacterial activity of the crude extract from the rhizospheric actinomycetes of C. equisetifolia against different tested bacteria
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12株短枝木麻黄根际放线菌乙酸乙酯层次生代谢产物的HPLC-UV色谱图见图3。从图3可看出:12株放线菌均含有一定数量的次生代谢产物,但不同化合物的相对含量(峰高)差别较大。抗细菌活性结果(表2)表明,菌株S. spinosus Ceaf-4和S. chattanoogensis Ceaf-12对木麻黄青枯病菌表现出较强的抑制活性,但图3表明这2株放线菌的次生代谢产物具有明显的区别,S. spinosus Ceaf-4中的各个次生代谢产物相对含量差别不大,保留时间(Rt)集中在10~15 min,通过紫外吸收分析发现为结构类似的化合物;而S. chattanoogensis Ceaf-12在Rt = 20 min左右有一个明显的吸收峰,说明此化合物的含量较高。此外菌株Ceaf-1、Ceaf-6和Ceaf-20也含有丰富的次生代谢产物,但抗菌活性一般。综合考虑抗菌活性和次生代谢产物的情况,菌株S. spinosus Ceaf-4和S. chattanoogensis Ceaf-12可作为候选菌株进一步分离其中的活性成分。
Antibacterial Activities of Rhizospheric Actinomycetes Associated with Casuarina equisetifolia
- Received Date: 2023-01-02
- Accepted Date: 2023-04-14
- Available Online: 2023-08-20
Abstract: