Correlation Analysis between Physiological Scorch and Mineral Elemental Contents in Walnut Leaves

试验于2021年6月在河北省临城县河北绿岭果业有限公司示范园核桃基地进行。该基地位于临城县城北6 km处，114°31′38.13″ E，37°31′49.79″ N，海拔96 m。年均日照2 653 h，年均气温13.0 ℃，年均降水量521 mm。

以叶片不同焦枯程度的‘绿岭’核桃树为试材，按焦枯程度占整片叶的百分比对核桃树进行分级（图1，CK：0.0%，0.0%<Ⅰ级≤25.0%，25.0%<Ⅱ级≤50.0%，50.0%<Ⅲ级≤75.0%，75.0%<Ⅳ级≤100.0%），共设5个级别。随机排列。每个级别2株为1小区，3次重复，共30株试验树。于2021年6月20日、7月21日、8月20日采样，每株从东、西、南、北4个方向分别取叶2片，部位为结果枝上复叶的顶叶，每小区各处理分别采集16枚叶片。

Figure 1.  Apparent morphology of ‘Lyuling’ walnut leaves with different scorching levels

用6 mm孔径的手握式打孔机在叶片中部（距主叶脉3～5 mm）和叶缘部分（距叶片边缘1～2 mm）取新鲜植物叶片0.1 g，利用乙醇提取法进行测定。

全N：凯氏定氮法；全P：钼锑钪比色法；全K、Na、Ca、Mg：稀释一定的浓度后，用原子吸收分光光度计直接测定；Fe、Mn、Cu、Zn：原子吸收分光光度计直接测定；B：姜黄素比色法。

数据处理采用Microsoft Excel，用SPSS22.0统计软件对数据进行分析：组间差异显著性采用单因素方差分析，用Duncan法对各组数据平均值进行多重比较；Pearson相关性分析和多元有序Logistic回归分析。采用GraphPad Prism、origin软件作图。

通过对‘绿岭’核桃树生长形态进行观察并拍照，核桃叶片形态出现不同程度的焦枯（图2 ）。病树的新生叶片均发现有焦枯现象。病叶表现为叶片边缘发黄连成波纹型向主叶脉方向延伸，直至整个叶片发黄焦枯，叶片的正背面无霉状物、菌脓等病征，为非侵染性病害（图2a~f ）。随着时间和焦枯程度的增加，叶片边缘逐渐由黄变褐，最后枯萎脱落（图2f、h）。随时间增加，各级病叶占全树比例未发现有明显变化。

Figure 2.  Tree morphology of ‘Lyuling’ walnut trees with different scorching levels

在叶片中部（表1），随着焦枯程度的增加，各月份叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量大体呈下降的趋势。6、7月份Ⅳ级的类胡萝卜素含量，8月份Ⅳ级的叶绿素a、叶绿素b含量下降最为显著，与对照相比，分别降低了26.7%、24.4%，24.4%、31.9%。6、7月份叶绿素a、叶绿素b含量，8月份类胡萝卜素含量无显著性差异。随时间的推移，各级别叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量呈现下降的趋势。8月〇、Ⅰ、Ⅳ级叶绿素a含量，Ⅰ级叶绿素b含量与6月份相比分别降低了23.9%、31.7%、33.0%，31.4%。6月到7月份，各级别光合色素含量无显著性差异。

在叶缘部分（表2），随着焦枯程度和时间的增加，叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量呈下降的趋势。各月份Ⅲ、Ⅳ级叶绿素b、类胡萝卜素含量与对照相比均有显著性差异。6月份Ⅳ级叶绿素a含量，8月份Ⅳ级叶绿素b、类胡萝卜素含量与对照相比下降最为明显，分别降低了60.0%，76.8%、79.5%。各月份〇、Ⅰ级的叶绿素a含量无明显差异。6月到7月份，各级别光合色素含量无显著性差异。8月份Ⅰ级的叶绿素a，Ⅱ级叶绿素b含量，Ⅳ级类胡萝卜素含量与6月份相比下降最为明显，分别降低了44.4%，63.1%，75.0%。

不同焦枯程度核桃叶片大量元素含量变化如图3所示，随焦枯程度的增加，叶片N、P含量大致呈上升的趋势，K、Na、Ca含量变化情况比较复杂，Mg含量变化相对稳定。6月份Ⅱ、Ⅲ级，7月份Ⅰ、Ⅳ级N含量显著高于对照，最高高出26.1%；8月份各级别与对照无显著差异。6月、8月份Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级以及7月份Ⅱ、Ⅲ级P含量显著高于对照，7月份Ⅳ级与对照有差异但不显著。6月份Ⅱ、Ⅲ级，7月份Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级K含量显著高于对照，8月份各级别与对照无显著差异。6、8月份Ⅰ级Na含量最高，分别为0.33 g·kg⁻¹、0.22 g·kg⁻¹，7月份对照Na含量最高，为0.26 g·kg⁻¹。6月份对照Ca含量最高，7月份Ⅳ级Ca含量最高，8月份Ⅲ级Ca含量最高。Mg含量各级别与对照均无显著差异。

Figure 3.  Contents of major elements in leaves of ‘Lyuling’ walnut at different scorching levels

随时间的推移，N、K、Na含量大致呈逐渐下降的趋势，P、Ca、Mg含量大致呈先下降后升高的趋势。8月份Ⅱ、Ⅲ级N含量显著低于6月份。7月份Ⅳ级P含量显著低于6、8月份，8月份各级别P含量与6月份无显著差异。7、8月份Ⅱ、Ⅲ级K含量显著低于6月份。7、8月份对照、Ⅰ、Ⅳ级Na含量显著低于6月份。8月Ⅲ级叶片Ca含量最高，为40.89 g·kg⁻¹，7月Ⅱ级叶片Ca含量最低，为18.18 g·kg⁻¹。

不同焦枯程度核桃叶片微量元素含量变化如图4所示，随焦枯程度的增加，叶片Fe、Cu、Zn含量变化情况比较复杂，Mn、B含量大致呈下降的趋势。6月份对照Fe含量显著高于Ⅰ、Ⅱ级，7月份对照与各级别Fe含量无显著差异，而8月份对照Fe含量显著低于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ级。6月份Mn含量各级别与对照无显著差异，7、8月份对照Mn含量与各级别差异显著，分别为185.34 mg·kg⁻¹、180.01 mg·kg⁻¹。6月份对照Cu含量最低，Zn含量最高，分为30.61 mg·kg⁻¹、38.96 mg·kg⁻¹；8月份对照Cu含量最高，为68.20 mg·kg⁻¹；Ⅲ级Zn含量最低，为16.38 mg·kg⁻¹。除6月份Ⅰ级与对照B含量无显著差异外，各月份对照与各级别B含量均有显著差异，最大降低了57.1%。

Figure 4.  Contents of trace elements in leaves of ‘Lyuling’ walnut at different scorching levels

随时间的推移，叶片对照、Ⅱ、Ⅲ级Fe含量大致呈逐渐下降的趋势，Ⅰ、Ⅳ级Fe含量大致呈先下降后上升的趋势，Mn含量大致呈先上升后下降的趋势，B含量变化相对稳定。7、8月份对照、Ⅳ级Fe含量显著低于6月份。7、8月份对照、Ⅱ级Mn含量，对照、Ⅰ、Ⅱ级Cu含量显著高于6月份。8月份对照、Ⅲ、Ⅳ级Zn含量显著低于6月份。8月份Ⅲ级B含量显著高于6月份，Ⅳ级B含量最低，为46.79 mg·kg⁻¹，且显著低于6月份。

不同焦枯叶片矿质元素间的相关性见图5，叶片N与K含量呈极显著正相关，相关系数为0.66；与Mn、B含量呈显著负相关，相关系数分别为-0.62、-0.58。叶片P与Mn、B含量呈极显著负相关，相关系数分别为−0.72、−0.69。叶片K与Cu含量呈显著负相关，相关系数为−0.53。叶片Na与Mg含量呈显著正相关，相关系数为0.57；与Zn含量呈极显著正相关，相关系数为0.66。叶片Mg与B含量呈显著正相关，相关系数为0.59。叶片Fe与Zn含量呈显著正相关，相关系数为0.52；与Cu含量呈显著负相关，相关系数为−0.58；与Mn含量呈极显著负相关，相关系数为−0.67。叶片Mn与Cu、B含量呈极显著正相关，相关系数分别为0.66、0.71。

Figure 5.  Correlation between mineral elements in different scorched leaves

将病情程度进行赋值（〇∶0、Ⅰ∶1、Ⅱ∶2、Ⅲ∶3、Ⅳ∶4）后，与矿质元素进行相关性分析，结果见表3，病情程度与N含量呈显著正相关，相关系数为0.63，与P含量呈极显著正相关，相关系数为0.76，与Mn、B含量呈极显著负相关，相关系数分别为−0.73、−0.91。

将测定的11个连续变量与病情程度（分类变量）进行多元有序Logistic回归处理，并满足平行线检验后，得到的回归结果见表4。综合以上分析，K、Ca含量虽然呈现出0.05水平的显著性（0.034、0.043<0.050），但与病情程度的相关性不显著，故不做考虑。B含量回归系数值为−0.872，且呈现出0.05水平的显著性（0.028<0.050），说明B元素含量对焦枯程度有显著的负向影响关系。

为进一步验证缺B导致的叶片焦枯，选择发生焦枯的‘绿岭’核桃进行叶面喷硼肥试验，于2022年6、7和8月份喷施0.0%（对照）、0.2%和0.4%的硼砂，成熟期采集叶片测定相关生理指标。

喷硼后叶片的光合色素含量如表5所示，总体上，喷施不同浓度的B肥可以提高叶片的光合色素含量，随着喷B浓度的增加，叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量呈上升的趋势。喷B浓度为0时，Ⅰ级叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量均显著高于Ⅲ、Ⅳ级。当喷B浓度为0.2%和0.4%时，各级别叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量均无显著性差异，且均高于喷B浓度为0时的光合色素含量。

喷硼后叶片的大量元素含量如表6所示，喷施B肥各元素含量的变化情况比较复杂，大致降低了叶片N、P、K元素含量。随着喷B浓度的增加，Ⅰ级P、Ca元素、Ⅱ级K、Na元素和Ⅲ、Ⅳ级Mg元素含量呈现出先上升后下降的趋势，而Ⅲ级N、P元素含量、Ⅳ级N、Na元素含量、Ⅰ级Mg元素含量呈现出先下降后上升的趋势。喷B浓度为0.0%时，各级别N、Mg元素含量均无显著性差异。喷B浓度为0.4%时，各级别P、K、Ca元素含量均无显著性差异。

喷硼后叶片的微量元素含量如表7所示，喷施B肥后，叶片Mn、Zn、B元素含量呈现出增加的趋势。喷B浓度为0.2%时，各级别Mn、Cu元素含量均无显著性差异，各级别B元素含量分别比喷B浓度为0.0%时高出52.1%、36.5%、45.7%、140.8%。喷B浓度为0.4%时，各级别B元素含量分别比喷B浓度为0.0%时高出70.9%、55.7%、50.5%、108.3%。

除了N、P、K等大量元素外，微量元素也是植物正常生长、发育、开花和结果所必需的^[13]。Fe、Mn、Cu、Zn和B等元素参与了植物所有的新陈代谢和细胞功能。对植物生长（光合作用、色素和蛋白质、酶活性、合成和细胞分裂）起到至关重要的作用^[14]。本试验研究了核桃叶片生理性焦枯与矿质元素的关系，具有重要的现实意义，但因品种与栽培区的不同，叶片发生焦枯的因素有很多，且各种元素又常常相互影响^[15]，情况比较复杂。本试验以Olsen J^[16]的核桃叶片分析解释所示元素的正常临界范围为依据，综合不同焦枯叶片矿质元素间、病情程度与矿质元素间的相关性分析和矿质元素与病情程度的多元有序Logistic回归分析，并通过喷肥试验验证，为找出核桃叶片焦枯发生的原因以及精准施肥提供了参考。

Fe虽然不是叶绿素的成分，但在叶绿素的卟啉环形成中起作用，直接参与光系统I、光系统II和细胞色素复合物的形成^[17-18]。植物缺Fe时，叶绿体结构发育不完整，长度和厚度下降，片层结构异常和模糊，基粒数目减少。严重缺Fe时叶绿体会变小、甚至解体或液泡化，因此Fe含量与叶绿素含量成正相关，缺Fe直接导致植物失绿黄化，严重时，除靠近叶柄处的部分呈绿色外，其它均呈黄色至白色，叶片逐级失去光泽，叶缘也易发生破裂，甚至枯死^[19-20]。本研究中，Fe含量在临界范围内波动，且与病情程度与相关性不显著，认为Fe对核桃叶片光合色素含量的降低没有明显影响。

Mn是植物叶绿体的组成部分，它维护叶绿体膜结构叶片，直接参与植物的光合作用，光系统II中有一种锰蛋白，参与催化水分解反应，催化氧的释放，并向类囊体偶联的电子传递链提供电子，因此缺Mn会导致叶片的光合能力降低^[21-22]，叶片失绿、脉间黄化，叶脉仍为绿色；有时出现一系列的黄褐色或黑褐色斑点；有时叶片发皱、卷曲，甚至凋萎^[23]。本研究中，病情程度与Mn含量呈极显著负相关，但Mn含量在临界范围内波动且回归结果不显著，在一定程度上或许可认为光合色素含量的下降与Mn含量的下降有关。

Cu在光合作用、呼吸作用和防止氧化应激方面发挥着重要作用。质体蓝蛋白是最丰富的铜蛋白，参与细胞色素b6f复合物与类囊体腔中的光系统I之间的电子传递。由于缺乏质体蓝素，缺Cu会导致光合电子传递缺陷。植物表现出叶部焦化枯萎和皱缩落叶。表皮逐渐出现深褐色，枝条回退枯萎，枝条附近的树皮上出现小黑褐色病斑^[24]。

B在植物中的主要功能是维持细胞壁的结构和功能，这种元素形成鼠李糖乳糖醛酸-II-B（RG-II-B）复合物，稳定果胶网络并调节细胞壁孔的大小^[25]；B还参与核酸和糖的代谢、蛋白质的合成、磷代谢、苯酚和含氮化合物代谢以及激素调节等^[26]。B缺乏叶片生长发育迟缓，尖端肿胀，卷曲发黄，严重情况下死亡；B过量则表现为褪绿或坏死斑块，通常出现在成熟叶片的边缘和尖端^[27-28]。本研究中，病情程度与B含量呈极显著负相关，而B随焦枯程度的增加，其含量呈逐渐下降且低于正常临界范围，对焦枯程度有显著的负向影响关系，且呈现出0.05水平的显著性。B含量显著下降，可能是核桃果实在膨大期的需B量较大，B转运到了果实中而叶片又不能土壤中得到有效补充，叶片B的生理功能出现紊乱^[29]，从而出现缺B的症状。使叶片的光合色素含量下降，发生焦枯现象。

为进一步验证缺B导致的叶片焦枯，选择发生焦枯的‘绿岭’核桃进行叶面喷硼肥试验后发现，喷施不同浓度的B肥后，叶片的光合色素含量、Mn、Zn、B元素含量增加，叶片N、P、K元素含量降低，各矿质元素含量均在临界范围内波动，叶片表观形态正常无焦枯现象发生，焦枯症状得到了有效缓解，与姜存仓等^[30]对脐橙的研究相似。

本研究分析‘绿岭’核桃焦枯叶片11种矿质元素含量的关系，并进行喷肥试验后证实缺B是导致‘绿岭’核桃叶片焦枯的最主要原因，为核桃生产栽培管理提供了理论参考。