Effects of Aluminum on Stress Resistance Physiology and Root Tip Cell Ultrastructure of Mycorrhizal Seedlings of Pinus massoniana

试验选取的外生菌根真菌褐环乳牛肝菌Suillus luteus（SL）采自贵州省龙里林场马尾松人工纯林（107°00′37″ E，26°28′01″ N），菌株保存于贵州省森林资源与环境中心微生物实验室。马尾松种子采自贵州省都匀市马鞍山林场国家马尾松良种基地的优良半同胞家系黄12单株，千粒质量为11.1 g。

以接种褐环乳牛肝菌的马尾松半年生苗为试验组（SL），未接种褐环乳牛肝菌的马尾松半年生苗为对照组（NE）。采用砂培盆栽，石英砂经漂洗、在高压灭菌锅内(压力0.14 MPa，121 ℃ ) 连续灭菌2 h 后，装入营养钵(口底高：21 cm × 15 cm × 18.5 cm) 备用。选取生长基本一致的半年生马尾松幼苗移栽至盆内，每盆3株，先正常生长2周后，用1/2 Hoagland营养液预培养2周后，再开始进行不同外源铝浓度处理。试验采用双因素完全随机区组设计，因素1设接菌（SL）和未接菌（NE）2个处理，因素2为铝离子浓度，设 4个水平（pH 4.1 ± 0.1），分别为：0（无铝SL0、NE0）、0.2（低铝SL02、NE02）、0.4（中铝SL04、NE04）和0.8（高铝SL08、NE08）mmol·L⁻¹ 。铝以AlCl₃ 形式加入Hoagland完全营养液；用0.1 mol·L⁻¹ 的稀HCl和NaOH调节pH值，为了保持铝的活性，在营养液中同时加入0.5 mmol·L⁻¹ CaCl₂，以避免铝离子与溶液中其它离子的相互作用。每周浇处理液1次。实验设3次重复，每个重复15株。

处理60 d后，每处理随机取样 20 株，轻轻抖掉根系表面石英砂，流水冲掉根部附着石英砂，超纯水清洗，选取新鲜混合根样用于抗氧化酶活性和MDA含量测定。将马尾松根先端0～20 mm部分用刀片迅速切下，分别用于根先端亚细胞组分Al含量测定和组织染色，取根尖0～4 mm用于根尖细胞超微结构观测。

分别选取不同处理马尾松幼苗根系鲜样0.1 g，使用苏州科铭生物技术有限公司试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD) 、过氧化物酶(POD) 、过氧化氢酶(CAT) 活性和丙二醛（MDA）含量。

根尖Al含量的测定：分别称取不同处理的烘干植物根样0.3 g左右于消解管中，向管内加入10 mL优级纯浓硝酸，不时振摇，直至无气泡；盖上管盖，浸泡过夜12 h；打开管盖，置于全自动微波消解仪，按以下升温梯度消解：80 ℃加热40 min，130 ℃加热60 min，165 ℃赶酸至管内液体约1 mL。冷却至室温，用超纯水定容至50 mL，待测。用等离子发射光谱仪 Prodigy XP在波长308.21 nm垂直观测。

亚细胞组分Al含量的测定：参考于姣妲等^[21]的方法，采用差速离心法分离不同的细胞组分，依次得到细胞壁组分（F1）、细胞核组分（F2）、线粒体组分（F3）和以液泡为主的含核糖体的可溶组分（F4），全部操作在4 ℃下进行。参照LY/T 1270-1999《森林植物与森林枯枝落叶层全硅、铁、铝、钙、镁、钾、钠、磷、硫、锰、铜、锌的测定》，采用分光光度法测定各组分Al含量。

参考余燕^[24]的方法采用氯化硝基四氮唑蓝（NBT）染色、3,3′-二氨基联苯胺（3,3′-diaminobenzidian，DAB）、荧光探针2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA；Beyotime，Jiangsu，China）和Schiff’s reagent（Sigma-Aldrich）试剂分别对根尖染色，并在智能型体视荧光显微镜（M205FA，德国莱卡）下观察O₂·⁻、H₂O₂、ROS和MDA的分布。

铝处理第60 d，分别采集不同处理的新鲜根尖材料，迅速投进 2.5%戊二醛（0.1 mol·L⁻¹ PBS 配制，pH 值7.0）的固定液里，抽气使材料沉底，在4 ℃冰箱里固定24 h后取出。再经漂洗、再固定、梯度脱水后渗透包埋，样品固化后使用莱卡 EMUC7 超薄切片仪修块、切片（50～70 nm），3% 醋酸铀-枸橼酸铅双染色。使用透射电镜 JEOL JEM-1230（80KV）观察并拍片。

以上数据分析处理及图表在SPSS21.0和Excel表格中完成。

随铝浓度的升高，菌根和非菌根苗根系SOD、CAT活性均呈总体上升趋势，POD活性则呈先降低后升高趋势（图1），且未接菌NE组的抗氧化酶活性均高于接菌组，表明随着铝浓度的提升，根系抗氧化酶活性增强，并且，未接菌NE组受到铝的影响程度更大，接种SL在一定程度上缓解了铝毒害。其中，未接菌NE组在高铝（0.8 mmol·L⁻¹）水平时SOD活性最高，达到201.14 U·g⁻¹，且显著高于其他处理（P<0.05），其他各处理间差异不显著。CAT活性随铝浓度的提高呈上升趋势，在未接菌NE组中，高铝和中铝（0.4 mmol·L⁻¹）水平下的CAT活性与无铝比差异显著，低铝（0.2 mmol·L⁻¹）与无铝比差异不显著，接菌的SL组内，高铝和中铝水平下CAT活性与无铝比差异显著，低铝与无铝比差异不显著。接菌和未接菌组的POD活性均在低铝水平时最低，但与无铝比差异不显著，中铝与无铝比差异不显著，高铝水平下的POD活性显著高于无铝，且在同一铝浓度下，接菌组的POD均低于未接菌组。

Figure 1.  Effects on antioxidant enzyme activity in the root of Pinus massoniana seedlings at different aluminum levels

从组织染色（图2）也可以看出，马尾松未接菌NE组根尖DAB、NBT染色深度和DCHF-DA荧光强度均随着铝浓度的升高而逐渐加深，且各铝处理也使得根尖膨大、变粗、弯曲，表现出明显的铝毒害症状。而接菌SL组的各项染色均不明显，表明接菌后根尖的H₂O₂、O₂·⁻及总活性氧ROS积累的含量不高，明显低于NE组，且各铝浓度间差异也不明显。

Figure 2.  Effect on H₂O₂、O₂·− and ROS production in the root tips of seedlings at different aluminum levels

丙二醛（MDA）是表征植物细胞膜脂过氧化程度的重要指标。从图3a可以看出，随着外源铝浓度的升高，未接菌NE组的MDA含量呈逐渐上升趋势，在高铝（0.8 mmol·L⁻¹）水平时含量最高，达5.10 nmol·g⁻¹。接菌SL组的MDA含量呈现先降低后升高的趋势，在低铝（0.2 mmol·L⁻¹）水平时MDA含量最低，为3.50 nmol·g⁻¹。并且与无铝处理相比，从低铝到高铝，未接菌组MDA的增幅均大于接菌组，表明接菌苗缓解了根系细胞的膜脂过氧化程度，降低了铝对马尾松幼苗根尖的毒害作用。从Schiff’s reagent染色（图3b）的根尖也可以看出，随着铝浓度的升高，未接菌NE组的根尖染色均有不同程度的加深，表明铝处理加剧了马尾松幼苗根系膜脂过氧化程度。而接菌SL组的染色不明显，外源Al³⁺对菌根的膜脂过氧化程度影响较小。

Figure 3.  Effect on MDA content in the root of inoculated and non inoculatedseedlings at different aluminum levels

在马尾松未接菌NE组中（图4A~D），在无铝和低铝（0.2 mmol·L⁻¹）水平下，根尖细胞排列紧密，细胞核、核仁、线粒体、液泡和都清晰可见，在无铝处理中还观察到淀粉粒，液泡较大且多；在低铝时，液泡则变得少且小，线粒体数量明显增加，且膨大变圆，核仁膨大。随着外源Al³⁺浓度的增加，在中铝（0.4 mmol·L⁻¹）时，细胞壁明显增厚，细胞内液泡、细胞核等细胞器的膜结构遭到严重破坏，细胞空泡化现象十分严重，线粒体被挤压堆积在一侧，细胞核核质散入细胞质中。到高铝（0.8 mmol·L⁻¹）时，细胞间隙增大，局部胞间层出现空隙，除细胞内各细胞器遭到严重破坏外，由于大量铝离子的进入而出现大面积黑色斑块。在接菌SL组（图4E~H），无铝处理的根尖边缘细胞较小，由于菌丝侵入皮层细胞间，形成哈蒂氏网，因此胞间层较厚且颜色较深。低铝时，根尖细胞内液泡增多且小，细胞核、核仁、线粒体等均清晰可见，线粒体结构完整。中铝时，细胞内线粒体膨大变圆，同时，由于铝不断向液泡转运，并在液泡中沉淀为黑色不溶颗粒，使液泡内颜色变深，直至结构遭到破坏，细胞质颜色变深。细胞核遭到破坏固缩，核物质凝聚，核膜不清晰，核仁膨大，有解体趋势。高铝时，液泡明显增大增多，细胞壁局部遭到破坏，发生了明显的质壁分离，线粒体数量进一步增加，细胞核膜被破坏，细胞核形状不规则化，核仁解散消失，核内染色质凝集。

Figure 4.  Effects on ultrastructure of inoculated and non inoculated seedlings at different aluminum levels

如图5所示，在马尾松幼苗根尖中，随着外源Al³⁺浓度的提高，SL和NE组的根尖铝含量均呈上升趋势，同一铝浓度，SL组的根系铝含量都高于NE组。低铝下，菌根苗根尖吸收的铝含量显著高于非菌根苗，高出33.44%，中铝水平下，菌根苗根尖吸收的铝含量也高于非菌根苗，但差异不显著，到高铝时，菌根苗吸收的铝含量又显著高于非菌根苗，高出38.55%。表明接种褐环乳牛肝菌能够显著提高马尾松根系吸收铝的能力。

Figure 5.  Aluminium content in the root of inoculated and non-inoculated seedlings at different aluminum levels

从根尖亚细胞组分的铝含量结果（表1） 可以看出，不同外源Al³⁺浓度处理下，铝在马尾松幼苗根尖的细胞壁组分(F1) 中含量最高，有铝处理时，平均铝含量在240.89～451.72 mg·kg⁻¹ 之间，在线粒体组分(F3) 中分布最少，表明铝在马尾松幼苗根系内主要分布在细胞壁，这可能是由于细胞壁对铝的滞留作用强，而使得其在线粒体内分布较少，而且由于菌根的吸附作用，使菌根苗的细胞壁吸收的铝更多。随Al³⁺浓度升高，铝在细胞壁组分(F1) 、细胞核组分(F2)和线粒体组分(F3)中富集均呈上升趋势，但在未接菌NE组中，铝在以液泡为主的可溶性组分(F4) 中的含量随铝浓度的升高反而减少，这可能是由于在高浓度的铝处理下，NE组的细胞核膜被破坏，核仁解体，染色质溶解在胞质中，在提取细胞核组分时，大部分的铝被提取至细胞核(F2)组分，而使可溶性组分中的铝含量下降。结果表明，铝胁迫使得马尾松幼苗根系将大部分铝吸附在细胞壁上，随着外源Al³⁺浓度的升高，马尾松幼苗根系亚细胞组分对铝的吸收总体呈增加趋势，随着铝胁迫的加强，由于细胞器受损，亚细胞组分中铝含量出现动态变化。

从铝在根尖亚细胞组分的分布（图6）可以看出，接菌和未接菌组在不同铝浓度处理下，铝的亚细胞分布的比例总体差异不大，其中，细胞壁(F1) 吸附的铝占据的比例最大，接菌SL组细胞壁(F1)所占比例在45.95%～59.98%之间，明显高于未接菌NE组。同时，SL组的细胞核组分(F2)和线粒体组分(F3)中所占比例则低于NE组。SL组的可溶性组分所占比在10.25%～20.80%之间，NE组所占比例8.77%～27.35%之间，差异较大，这可能与细胞器的结构破坏而导致的分布失调有很大关系。

Figure 6.  Subcellular distribution of aluminum in root tips

本研究中，随着铝胁迫的增强，马尾松根系吸附的Al³⁺含量增加，根系的抗氧化酶活性增强，ROS增加，并进一步引起了MDA含量的增加，膜脂过氧化程度加重，表明铝对根细胞膜透性产生了不利影响，这是因为铝具有分别与细胞壁和膜的羧基和磷酸基结合的能力^[25]。植物在铝胁迫下会引起线粒体和过氧化物酶体中活性氧（ROS）的产生^[26]，由于抗氧化机制失衡，又进一步引发细胞成分的氧化损伤^[27-28]。铝引起的ROS系统失衡和细胞壁性质的改变是造成铝毒害的两个内在因素^[23]。

Yamamoto等^[29]揭示了大量的铝会导致细胞内过多的活性氧（ROS）积累，最终导致细胞死亡。而在本研究中，接菌SL后，丙二醛含量和抗氧化酶活性相对较低，表明SL缓解了马尾松中与ROS相关的损伤，降低了铝毒性，而接菌组SL和未接菌组NE之间的差异不明显，则是由于植物对逆境的生理响应往往发生在逆境初期，经过60 d的处理，植物体内的铝含量和根系介质中的铝含量达到了一个动态平衡状态，植物通过前期的各种生理调节而逐渐适应了现有的铝浓度，形成新的生理稳定状态，因而两组处理中的抗氧化酶活性和MDA含量往往差异不显著。褐环乳牛肝菌（SL）是一种广泛存在于松林中的外生菌根真菌。大量研究表明SL是一种耐铝真菌^[30-31]，有利于铝污染地区松苗的再生和种植。本项研究的结果完全证实了前人的发现，接种SL的马尾松能够更好地耐受铝胁迫。

细胞壁是有害金属进入植物根系的第一道屏障^[32]。Kopittke 等^[33]发现，植物暴露在铝环境下，铝立即与根表面的细胞外壁结合，因此认为铝的主要病变是质外体。本研究中，铝在马尾松幼苗根系细胞壁(F1) 中分布最多，这也证明铝与细胞壁的结合是马尾松耐铝毒的重要机制之一。铝离子主要与细胞壁的果胶基质、带负电荷的羧基及质膜的外表面结合^[34-35]，结合区主要位于根尖的铝敏感根区，从而损害质外体和共质体的细胞功能。此外，由于细胞壁含有蛋白质和多糖以及大量配位基团(羟基、羧基、醛基、氨基等) ，容易吸附Al^3+[21]。马尾松根尖带负电的细胞壁能够大量吸附带正电的Al³⁺。本研究通过细胞超微结构观察也清晰证实了Al在细胞壁周围聚集。在铝胁迫下，铝离子在细胞壁上强烈而快速的结合破坏了细胞壁的结构和机械性能，降低了细胞壁的延展性，从而抑制了根系的伸长。

除细胞壁组分F1外，细胞核组分F2的铝含量最高，由根尖细胞超微结构可见，随着铝浓度升高，细胞核膜、核仁和染色质都受到了明显的破坏，细胞核内核酸等大分子物质外渗，细胞结构被严重破坏，细胞功能丧失。细胞核是细胞遗传代谢的调控中心，铝离子渗入细胞核内，易与核酸大分子物质结合，造成凝集，染色体断裂畸变，核酸代谢失常，细胞核损伤必然严重影响植物正常基因的调控及细胞分化^[21]。铝对细胞核结构影响的同时，也会对DNA组成、模板活性和染色质结构产生不利影响^[36]。铝还通过增加双螺旋上的刚性来限制DNA的复制^[36-38]。

本研究中，未接菌NE组在高铝水平下，核膜、质膜、线粒体和液泡等的结构和形态都发生明显改变，植株表现出了明显的受害症状。细胞内的膜系统因铝离子的结合造成了破坏，其机制可能是由于铝离子与生物膜有着强烈的亲和力，可以导致膜的僵化变形，破坏细胞膜的结构和功能，改变膜的流动性，从而使膜功能散失。铝还通过与脂类、糖类和蛋白质作用而破坏膜的延展性，改变膜透性使细胞内物质向外渗漏作用加强，干扰细胞的各种调节过程，从而影响植株正常生长。由于生物膜受到破坏，大量线粒体肿胀，空泡增多，质膜破坏。凋亡前的核结构破坏被大多学者认为是铝胁迫的细胞特征，并认为铝信号遵循细胞死亡的线粒体途径^{[36, 39]}。线粒体是细胞进行有氧呼吸制造能量的主要场所，线粒体等细胞器的消失或破坏会造成根的呼吸受阻，呼吸效率降低，不利于根的生长和对水分及营养的吸收^[40]，这也是本研究中马尾松幼苗根系抗氧化酶活性增强和MDA含量增加的原因。同时，其他生理代谢因受铝胁迫发生的变化也可能是细胞内部基因表达受到抑制或改变而产生的。在本研究中，NE组在高浓度铝水平下，由于细胞膜被破坏，无法阻隔Al³⁺侵入细胞核等细胞器，使植物明显受到铝毒害。而接种SL后，由于菌根对铝的吸附作用，侵入细胞内的铝离子含量相对较低，从而使得SL组细胞内细胞核组分(F2)和线粒体组分(F3)中的铝含量维持在较低水平，保护了亚细胞器结构，维持了细胞的基本功能，从而缓解了铝毒性。同时，植物可以通过液泡的区室化作用将重金属吸收在液泡中，降低重金属毒害，从图4G的细胞超微结构可以明显看出，接种SL在0.4 mmol·L⁻¹铝水平下，液泡中吸收了大量的Al³⁺，因而根尖细胞受到的铝毒害作用明显较未接菌组小，受害症状也更小。

铝离子被马尾松幼苗根系吸收后，对根尖细胞的结构和功能产生了一系列的影响。Al³⁺与带负电的细胞壁结合，并被大量吸附而沉积，破坏细胞壁的结构和机械性能，降低了细胞壁的延展性，从而抑制了马尾松幼苗根系的伸长。进入细胞内的Al³⁺与生物膜有着强烈的亲和力，破坏了以蛋白质为主要成分的细胞膜的结构和功能，改变了膜的流动性和透性，使细胞器物质向外渗漏作用加强，干扰细胞的各种调节过程。核膜的破坏导致大量铝离子渗入细胞核内，Al³⁺与核酸大分子物质结合，造成凝集，染色体断裂畸变，核酸代谢失常。同时，Al³⁺使线粒体消失或破坏，造成根的呼吸受阻，在生理水平上造成根系抗氧化酶活性增强和MDA含量增加。而接种SL后，由于菌根对铝的吸附作用，侵入细胞内的铝离子含量相对较低，使细胞内细胞核和线粒体组中的铝含量维持在较低水平，并通过液泡的区室化作用将Al³⁺隔离在液泡中，保护了亚细胞器结构，维持了细胞的基本功能，从而缓解了铝毒性。进一步证明菌根可以通过吸附大量的铝而达到减少根尖铝毒害和提高植物耐铝能力的目的，这很可能是马尾松菌根苗的一个重要外部抗性机制。