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植原体(Phytoplasma, 原称Mycoplasma-like organism简称MLO), 是一类类似植物病原细菌但无细胞壁的原核生物。能引起许多重要的粮食作物、蔬菜、观赏植物和果树等经济林木的严重病害。目前, 在国际上已经报道的植原体相关病害多达1 000余种, 在我国发生的也有100多种[1]。由于植原体暂时还不能实现体外培养, 针对该类病害的高度抗性品种又很难获得, 实际生产中该类病害的防治措施主要是依靠清除染病的植株, 杜绝侵染来源。因而及早的发现感病植物中植原体的存在, 及时采取相应的措施, 将带毒植物予以铲除, 对该类病害的防治具有重要意义[2]。因此, 建立快速、高效、准确的植原体鉴定检测体系变得尤为重要, 这方面的研究经历了前期主要依靠生物学、电镜观察、抗生素试验相结合的传统方法进行检测, 到后期随着生物技术的发展, 基于酶联免疫反应、核酸杂交以及PCR技术的检测方法也相继建立, 检测的灵敏度和准确性不断提高[3-6]。
基因芯片又称DNA芯片或DNA微阵列, 是指固着在载体上的高密度DNA微点阵。其原理是根据核酸的分子杂交衍生而来, 即应用已知序列的核酸作为探针, 对未知序列的核酸序列进行杂交检测[7]。基因芯片根据不同的载体类型以及用途可以分为不同的类型, 如基因表达芯片、测序芯片、诊断芯片等。同时针对不同的芯片类型, 又建立了不同的芯片技术平台, 比较成熟的有Affymentrix公司的Gene-Chip系列、Agilent公司的aCGH芯片系列、BioPrime公司的ArrayCGH系列、博奥生物的晶芯系列以及Alere公司的ArrayTube系列等。相比于传统的核酸杂交技术, 基因芯片具有快速、平行、高效、高通量、高灵敏度、可自动化操作等特点, 自被发明以来, 在医学、生命科学、农业、林业及环境科学等领域得到了广泛的应用[8-10]。
生物芯片的核心是核酸杂交技术, 早在20世纪末期, 已经有不少学者将核酸杂交技术应用于植原体的研究中[11]。2004年Herdia等[12]对DNA芯片在植物病毒、类病毒及植原体病原检测上的应用潜力进行过报道。2007年Bertolini[13]将PCR与dot blot相结合成功的实现了16SrX组植原体的检测。同年, Nicolaisen等[14]针对植原体的16Sr DNA基因设计特异性引物, 在BioPrime Array平台上建立了可以鉴别和检测大部分16Sr亚组的植原体芯片检测方法。2011年Lenz等[15]报道了用植原体16S-23S间区为靶标的寡核苷酸芯片区分不同植原体, 获得了与上述16Sr DNA基因芯片类似的分辨效果; 至2015年, Lenz等[16]又选取植原体核糖体蛋白基因rps3, rpl22和rps19作为靶标基因, 设计特异性探针, 同样实现了植原体不同亚组间的芯片鉴别和检测, 并尝试对田间和混合感染样品的检测。其中, Nicolaisen所采用的方法, 由于对PCR产物使用Cy3-dCTP进行标记、且需对标记反应产物进行纯化, 而且杂交反应需过夜, 导致检测过程和时间过长, 操作较为繁琐。Lenz的方法, 简化了杂交的过程, 可以在2小时内完成检测, 但是其所需设备比较庞大、昂贵。相比于Lenz所使用的芯片扫描平台Tyhoon 900, Alere公司的ATR 03 Reader芯片扫描平台, 具有设备简单, 方便携带、快速反应的特点, 可以实现在2小时内完成杂交, 非常适合野外和现场试验。
我国植原体病害发生严重, 而且存在不同亚组的植原体共同危害的现象。为了调查分析我国植原体的分类情况, 我们将Nicolaisen针对16Sr DNA所设计的探针结合Alere公司定制的管芯片对所收集到的植原体进行应用研究, 以期筛选出适用于我国不同组植原体分类鉴定的特异性探针组, 并在此基础上建立适合于野外使用的管芯片鉴定和检测植原体的方法。与此同时, 我们也将此方法应用于我国一些疑似植原体病害的鉴别和分类研究。
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试验所使用的植原体材料及其健康对照, 采集自我国不同的地区, 其编号及分类信息详见表 1。CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒(DN14)购自北京艾德莱生物科技有限公司。PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、以及感受态细胞E.coli DH5α、克隆载体pMD18-T均购自宝生生物(大连)有限公司。管芯片杂交试剂盒购自德国Alere生物技术有限公司。
编号Code 组织样品Samples 来源地Origin 编号Code 组织样品Samples 来源地Origin PaWB-HBBD 泡桐丛枝 河北保定 JH-BJHD 健康枣树 北京海淀 PaH-BJHD 健康泡桐 北京海淀 BiWB-ANHF 重阳木丛枝 安徽合肥 CWB-ZJCA 苦楝丛枝 浙江淳安 BiH-ANHF 健康重阳木 安徽合肥 CH-JSNJ 健康苦楝 江苏南京 CeLY-SCMN 樱桃致死黄化 四川冕宁 MD-AHHF 桑树萎缩 安徽合肥 CeH-BJHD 健康樱桃 北京海淀 MH-JSZJ 健康桑树 江苏镇江 CnYC-BJHR 板栗黄化皱缩 北京怀柔 LY-FJSM 莴苣黄化 福建三明 CnH-BJHR 健康板栗 北京怀柔 LH-FJYA 健康莴苣 福建永安 PsYC-BJMTG 牡丹皱叶黄化 北京门头沟 PnWB-FJQZ 花生丛枝 福建泉州 PsH-BJHD 健康牡丹 北京海淀 PnH-BJHD 健康花生 北京海淀 SaWB-NMBT 柳树丛枝 内蒙古包头 SpWB-FJQZ 甘薯丛枝 福建泉州 SaH-BJHD 健康柳树 北京海淀 SpH-FJQZ 健康甘薯 福建泉州 RoWB-HNPY 红花槐丛枝 河南濮阳 ClWB-HNSY 臭矢菜丛枝 海南三亚 RoH-BJHD 健康槐树 北京海淀 ClH-HNSY 健康臭矢菜 海南三亚 PePWB-FJFZ 长春花黄化丛枝 福建福州 JWB-HNNY 枣疯病 河南南阳 PeH-BJHD 健康长春花 北京海淀 Table 1. Origin and information of phytoplasma samples
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称取1~2 g新鲜植物材料, 用液氮冷冻并充分研磨, 取0.15 g研磨后的粉末, 参照CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒(DN14)说明书提取总DNA。提取的总DNA -20℃保存备用。利用植原体通用引物R16mF2/R16mR1对提取的植物总DNA进行PCR扩增。PCR扩增体系及反应条件参考李永[17]的方法进行。25 μL扩增反应体系中含有制备的DNA模板1 μL, 正反向引物各0.5 μL(10 μM), 2 × PCR预混液(0.05 U/μL Taq DNA聚合酶, 4 mM MgCl2和0.4 mM dNTPs)12.5 μL, ddH2O补至25 μL。反应程序: 94℃5 min; 94℃ 45 s, 52℃ 45 s, 72℃ 1 min, 共35个循环; 72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测, PCR产物结果送北京华大基因有限公司测序。
测序获得序列与NCBI上下载的植原体各组代表序列利用MEGA软件构建系统发育树, 建树采用N-J法, Bootstrap值为1 000, 非固醇甾原体(Acholeplasma laidlawii)和螺原体(Spiroplasmachrysopicola)作为外类群, 确定所采集植原体的分类地位。
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参考Nicolaise等[14]针对植原体的16Sr DNA设计的探针组, 包含了一对通用引物Pp-fwd(5’-AGTGGCGAACGGGTGAGTAAC-3’)和Pp-rev (5’-CGTTTACGGCGTGGACTACCAG-3’)以及一组针对不同组植原体特异性的探针(见表 2)。管芯片的制作委托德国Alere生物技术有限公司进行, 将人工合成的探针序列, 经点样机按设计的排布点在管芯片中。探针序列及阳性对照在载体上的分布情况(见图 1)。
探针编号
Probe code探针序列(5'-3')
Probe sequences(5'-3')GenBank
收录号
GenBank
accessionsPpI-465 TATTAGGGAAGAATAAATGATGGAAAAATC AF222064 PpII-471 CGAACCATTTGTTTGCCGGTA AF028813 PpII-629 CGTTGTCCGGCTATTGAAACTGC - PpIII-478 GTGGAAAAACTCCCTTGACGGTACTTAAT AF173558 PpIV-630 CTTAACGTTGTCCTGCTAGAGAAACTGTT AF361020 PpV-221 AGACCTTCTTCGGAGGGTATGCTTAA AY072722 PpVI-276 TTAGTTGGTAGAGTAAAAGCCTACCAAGAC AF190224 PpVII-621 TATAGAAACTACCTTGACTAGAGTTAGATAGAG AF105315 PpVIII-634 ACGCTTAACGTTGTTTTGTTATAGAAACTG AF248956 PpIX-609 AACGCTGTAsCGCTATAGAAACTGTCTG AF515637 PpX-183 GGATAGGAAGTTTTAAGGCATCTTGAAAC AF248958 PpX-224 AGGGTATGCTAAGAGATGGGCTTGC - PpXII-465 GGGAAGAAAAGATGGTGGAAAAACC AF248959 PpXII-480 GTGGAAAAACCATTATGACGGTACCT - PpXIV-585 GAAACTATCAGACTAGAGTGAGATAGAGGCAAG AF509321 Pp-148 TTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGAC AY741532 Pp-502 AGGCGGCTyrCTGGGTCTTTACT - Table 2. Probe sequences
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本实验采用生物素标记靶标基因, 方法是在合成设计的通用探针的引物Pp-fwd/Pp-rev时, 在引物Pp-rev的5’端进行生物素修饰。并以此带有标记的引物组对样品进行PCR扩增, PCR扩增程序: 25 μL扩增反应体系中含有制备的DNA模板1 μL, 正反向引物各0.5 μL(10 μM), 2 × PCR预混液(0.05 U/μL Taq DNA聚合酶, 4 mM MgCl2和0.4 mM dNTPs)12.5 μL, ddH2O补至25 μL。反应程序: 94℃ 3 min; 94℃ 15 s, 62℃ 30 s, 72℃ 1 min, 共35个循环; 72℃延伸10 min。管芯片的杂交和洗涤过程, 将PCR产物、纯水和杂交缓冲液C1按照1∶9∶90配制Heatmap图(图 4)可以看出, Nicolaisen等所设计的杂交混合液, 其余参照Alere公司杂交试剂盒的操作说明进行。将芯片扫描的信号强弱按等级进行划分, 并赋值。最强信号为Biotin-Marke赋值为10, 无信号赋值为0, 按照杂交信号的强弱借助软件Heml 1.0制作杂交结果的Heatmap图。
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按照管芯片检测步骤, 分别对已经确立了分类地位的16SrⅠ组、16SrⅡ组、16SrⅤ组和16SrXIX组的植原体组织和对应的健康组织进行检测。同时对采集的疑似植原体病害的植物材料和健康对照进行检测验证。
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将样品PaWB-HBBD用引物R16mF2/R16mR1进行PCR扩增, 扩增产物经纯化试剂盒纯化后, 与克隆载体pMD18-T 16℃连接过夜, 转化到感受态细胞E.coli DH5α中。在含有IPTG和X-gal的LB筛选平板上挑取白色菌落并摇菌培养。用质粒纯化试剂盒(Takara Mini BEST Ver.2.0)从上述培养液中提取重组质粒DNA, 并送北京华大基因进行测序验证。
将上述提取的重组质粒DNA, 10倍梯度稀释, 并作为模板进行PCR扩增和管芯片检测。比较琼脂糖凝胶电泳和管芯片杂交的检测灵敏度。
1.1. 材料
1.2. 方法
1.2.1. 植物总DNA提取与PCR扩增检测
1.2.2. 特异性探针设计及管芯片定制
1.2.3. 靶标基因的生物素标记及管芯片杂交
1.2.4. 管芯片探针特异性验证和疑似植原体病害材料检测
1.2.5. 管芯片鉴定和检测植原体灵敏度测定
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应用植原体16Sr DNA基因的通用引物R16mF2/R16mR1对15种植原体侵染植物样品及其健康对照的DNA进行PCR扩增, 凝胶电泳检测结果显示所有的健康植物对照均未出现阳性扩增结果。一些疑似植原体病害的发病组织DNA也未扩增出阳性的结果。包括牡丹皱叶黄化(PsYC-BJMTG)和柳树丛枝(SaWB-NMBT)。剩下的13种具有典型症状的发病组织DNA, 均获得阳性扩增结果。将具有阳性结果的PCR产物送北京六合华大基因测序, 测序结果与GenBank中已报道的[18]植原体不同组的序列构建系统发育树(见图 2)。结果显示所收集的植原体材料分布在四个组, 分别是16SrⅠ组、16SrⅡ组、16SrⅤ组和16SrXIX组。
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按照所建立的管芯片检测和鉴定植原体的方法对所收集到的我国发生的16Sr不同组植原体的DNA及其健康对照进行管芯片杂交, 从杂交结果的针对16Sr DNA基因的探针, 与健康植物对照皆无杂交信号, 而分别与不同组植原体有强弱不同的杂交信号。其中17号探针(Pp-502)作为植原体通用探针能与我国不同地区采集的、已系统鉴定的不同组的所有植原体都有很强的杂交信号, 可以成为各种植原体病害初步诊断的理想探针。但另一通用探针16号(Pp-148)按现有的检测方法与条件, 其所产生杂交信号较弱。15号探针(PpXIV-585), 原是针对16S rXIV组所设计的组特异性探针, 但是实验结果却显示其可以和16SrⅠ组、16SrⅤ组和16SrXIX组植原体产生相对较强的杂交信号。
16SrⅠ组的泡桐丛枝、苦楝丛枝、桑树萎缩和莴苣黄化四种已知分类地位的植原体材料的管芯片杂交结果来看, 针对16SrⅠ组所设计的组特异性的1号探针(PpⅠ-465)有很好的特异性。4种16SrⅠ组的样品均出现较强的杂交信号, 同时其他组的样品不出现杂交信号。同样, 针对16SrⅡ组所设计的组特异性3号探针(PpⅡ-629)也表现出了良好的组间特异性, 所有16SrⅡ组的花生丛枝、甘薯丛枝和臭矢菜丛枝3个植原体样品可产生较强的杂交信号, 并且其他组的样品不出现杂交信号。但是同样针对16SrⅡ组设计的另外一个特异性探针2号(PpⅡ-471), 却没能出现任何杂交信号。
16SrⅤ组的枣疯、樱桃致死黄化和重阳木丛枝三个植原体样品所产生的杂交信号谱较为复杂且相似, 除了通用探针17号(Pp-502)外和15号探针(PpXIV-585)出现了较强的杂交信号外, 6号探针(PpV-221)、8号探针(PpⅦ-621)、9号探针(PpⅦⅠ-634)以及16号探针(Pp-148)均出现了中等强度的杂交信号。其中只有6号探针是设计的16SrⅤ组特异性探针, 与属于B亚组的枣疯病和樱桃致死黄化有中等强度的杂交信号, 但属于H亚组的重阳木丛枝则未出现杂交信号, 较难判断为阳性结果。
类似的情况也出现在板栗黄化皱缩植原体样品中, 即除与通用引物16和17号分别产生中等和很强的杂交信号外, 也与16SrIV和16SrXIV探针有中等强度信号。根据Lin[19]的报道其属于16SrXIX组, 但是Nicolaisen在设计探针时, 并没有针对16SrXIX组设计特异性的探针, 不过从系统发育上看16SrXIX组的植原体与16Sr Ⅳ组的植原体关系较近, 因此在板栗黄化皱缩植原体样品的管芯片杂交结果中, 16Sr Ⅳ组的特异性探针5号(PpIV-630)出现了较弱的信号。
另外, 我国发生的4个组共13个植原体皆与所设计的针对与16SrⅢ、Ⅵ、Ⅹ和Ⅻ四个组的所有探针无任何杂交信号, 表明不存在于这些组的交叉反应问题, 也意味着这些植原体样品不存在与这四个组植原体的混合感染。
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将通过测序获得的各个组的序列与所有具有杂交信号的探针序列进行比对, 计算各组序列与探针序列的匹配率(见表 3)。可以看出, 通用探针Pp-148和Pp-502与测定的四个组植原体的对应序列几乎完全匹配, 仅16SrⅡ组样品序列与Pp-502探针有一个碱基的差别。16SrI组样品序列与PpⅠ-465探针序列完全匹配。16SrⅡ组样品序列与PpⅡ-629探针序列完全匹配。从而确证了所设计的这几个探针鉴定植原体的特异性和准确性。然而也发现虽然16SrⅤ组植原体样品的序列与所设计的组特异性探针PpV-221探针序列完全匹配, 。但是从杂交的结果上来看, 杂交信号的强弱并不跟其序列的匹配率成完全的正相关(参见图 4);, 如通用探针Pp-148与四个组样品的序列都完全匹配, 但是其杂交的信号强度显著弱于通用探针Pp-502。而且同样, 16SrⅤ组样品序列与PpV-221探针序列完全匹配, 与PpⅦ-621探针序列有3个碱基的错配, 与PpⅧ-634探针序列有4个碱基的错配, 与PpXIV-585探针序列有3个碱基的错配, 但是该组植原体与PpⅦ-621、PpⅧ-634和PpXIV-585探针所对应的杂交信号却都明显强于PpV-221探针。甚至, 16SrI组样品序列与PpXIV-585探针序列错配碱基达到了7个, 但是也出现了较很强的杂交信号。因而, 我们认为, 在现行的Alere公司提供的试剂和杂交条件下, Nicolaisen等设计的针对16SrⅤ、Ⅷ、XIV等组的探针并非检测和鉴定相应组植原体的特异性理想探针。另外尚不清楚为什么虽然通用探针Pp-148与测定的四个组植原体样品的序列也都完全匹配, 但是其杂交的信号强度总是显著弱于通用探针Pp-502。
PpⅠ-465 PpⅡ-629 PpⅣ-630 PpⅤ-221 PpⅦ-621 PpⅧ-634 PpⅨ-609 PpⅩⅣ-585 Pp-148 Pp-502 16SrI 100%(0) 69.56%(7) 79.31%(6) 65.38%(9) 78.79%(7) 76.67%(7) 71.43%(8) 78.79%(7) 100%(0) 100%(0) 16SrII 56.66%(13) 100%(0) 86.20%(4) 69.23%(8) 81.82%(6) 83.33%(5) 71.43%(8) 78.79%(7) 100%(0) 95.24% (1) 16SrV 73.33%(8) 73.91%(6) 82.76%(5) 100%(0) 90.91%(3) 86.67%(4) 79.31%(6) 91.18%(3) 100%(0) 100%(0) 16SrXIX 73.33%(8) 78.26%(5) 82.76%(5) 100%(0) 78.79%(7) 80.00%(6) 82.75%(5) 81.82%(6) 100%(0) 100%(0) 注: 括号内为错配的碱基数, 匹配率: (探针碱基总数-错配碱基数)/探针碱基总数
Note: The number of mispairing base was indicated in brackets, matching ratio: (total number of probe bases-the number of mispairing base)/Total number of probe basesTable 3. Matching ratio between different sample sequences and probes
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将泡桐丛枝样品PaWB-HBBD的16Sr DNA基因扩增后, 连接到克隆载体pMD18-T上后组建重组质粒, 提取重组的质粒, 纯化后进行10倍梯度稀释, 并作为模板分别进行PCR检测和管芯片检测。实验结果显示, 以植原体通用引物R16mF2/R16mR1的传统PCR检测, 在质粒浓度稀释到10-4倍时, 达到凝胶电泳的检测限度(见图 5)。但是管芯片检测在质粒稀释到10-7倍时, 仍可出现较好的杂交信号(见图 6)。因此可以表明相比于传统PCR检测, 管芯片检测植原体的方法的灵敏度提高了1 000倍。并且采用管芯片检测的方法, 不仅能实现灵敏度的提高, 还能实现植原体不同组的鉴定。而且当稀释度达到10-7时, 与16SrXIV组探针的交叉杂交信号也明显减弱, 而16SrI专化性探针和通用探针的信号仍较强。
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近年来, 我国不同地方出现了一些园林绿化树种的未知病害, 如发生在北京市门头沟戒台寺的牡丹黄化皱叶病害, 其具有典型的植原体病害特征, 如皱叶、黄化、丛枝、巨芽等。发生在内蒙古包头市的柳树丛枝病害, 同样出现小叶、丛枝等典型症状。以及河南濮阳发生的红花槐丛枝、福建福州出现的长春花黄化丛枝均为第一次发现。
我们将新建立的管芯片鉴定与检测植原体的方法应用于这些未知疑似植原体病害的检测与鉴定中。从实验结果看, 牡丹黄化皱叶和柳树丛枝样品, 均没能出现阳性杂交信号。红花槐丛枝产生了很好的杂交信号, 并且杂交结果和16SrⅤ组的枣疯病、重阳木丛枝等结果相一致。因此可以判定引起河南濮阳红花槐丛枝的病原是属于16SrⅤ组的植原体。同样长春花黄化丛枝的杂交结果与16SrI组的泡桐丛枝病、苦楝丛枝病等相一致, 因此判定出现在福建福州的长春花黄化丛枝的病原菌为16SrI组的植原体。