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了解昆虫内生殖器官结构和发育, 有助于深入了解昆虫生殖与繁殖的生物学和生理学, 对分类、行为和化学生态的研究有极其重要的意义。目前关于鳞翅目昆虫蛾类的内生殖器官结构和发育研究比较深入, 蛾类内生殖器官通常是由几部分不同结构组成, 例如, 小菜蛾Plutella xylostella(Linnaeus)雌蛾内生殖系统包含1条受精囊腺、1对附腺、1个受精囊、1对中输卵管、1对侧输卵管、8根卵巢管和1个交配囊[1]。此外, 对于蛾类雌成虫卵巢发育研究亦非常透彻, 通常根据卵巢形态及发育特征、卵的形态及发育特征、脂肪体消耗情况等特征, 将卵巢发育分为5~6级[2-4]。依据其卵巢发育分级, 可以判断稻纵卷叶螟的种群性质, 迁飞型与居留型[4]。对于蝶类, 内生殖系统的发育分级研究较少, 研究主要聚焦于内生殖器官的结构组成。例如, 黄粉蝶亚科的内生殖器包括1对卵巢、2根侧输卵管、1根中输卵管、受精囊、附腺、外生殖腔及产卵孔, 卵巢管8根, 属于多滋式; 外生殖器、包括交配囊及其附属结构、导精管、前后表皮突和腔突; 可通过交配囊、受精囊腺和卵巢等的形态差异来作为不同属间的鉴定特征[5]。另外, 除鳞翅目昆虫外, 半翅目、双翅目、同翅目和鞘翅目昆虫的内生殖器官结构[6-7]与发育[8-12]的相关研究也较多。
综上所述, 目前对于蝶类昆虫仅有关于内生殖器官组成的研究, 尚缺少蝶类雌性卵巢发育过程及分级的研究。因此, 了解蝶类内生殖系统有助于繁殖生理学的研究, 为具有经济价值的蝴蝶的人工繁育与利用提供理论指导。青斑蝶Tirumala limniace(Cramer)属于鳞翅目(Lepidoptera)斑蝶科(Danaidae), 由于其美丽的外观和优美的飞行姿态, 青斑蝶具有较高的观赏价值和经济价值[11]。因此, 成为了节庆放飞、观赏旅游和工艺品制作的优秀品种[12]。规模化养殖是农民实现创收的主要途径之一, 符合农民经济利益。但是目前针对青斑蝶生殖与繁殖的研究较少, 无法为青斑蝶规模化繁殖提供必要的理论参考。本研究通过解剖1~12日龄的青斑蝶雌成虫, 并分别观察和测量了雌性内生殖器官形态和组成结构尺寸, 同时根据各组成结构形态学特征和尺寸大小对雌蝶的卵巢发育进度进行了分级, 以期为青斑蝶的人工培育提供理论依据。
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青斑蝶蛹购于昆明中林观赏昆虫科技开发有限公司, 蝴蝶羽化后在实验室饲养(温度26±1 ℃, 相对湿度70%~80%, 光周期L∶D=14∶10)。将蛹悬挂于固定在圆柱形罩网(高: 65 cm, 直径: 50 cm)顶部毛巾上羽化, 以方便其羽化后展翅。羽化后, 雌虫挑出饲养在正方体养虫笼(50 cm×50 cm×50 cm)内, 每天用15%的洋槐蜂蜜喂2次。1~12日龄成虫作为供试虫源。
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上午9:30将成虫浸泡于40%乙醇中, 使成虫晕厥后, 置于0 ℃蒸馏水中备用。在自制的圆形蜡盘(直径: 15 cm)中倒入0.7%的生理盐水进行虫体的解剖。解剖时将蜡盘置于体视显微镜(Leica MZ16A, Leica有限公司, 德国)的载物台上, 在10×目镜和1×物镜下进行。
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将雌成虫内生殖器官置于超景深三维显微镜(VHX-1 000, KEYENCE, 日本)载物台下进行拍照采集图片。由于青斑蝶雌成虫内生殖器官尺寸较大, 采集到的是内生殖器官的不同组成结构的局部图片。利用显微镜的实时2D图像合成功能, 在放大20倍的情况下, 将局部图片合成为内生殖器官的完整图片。然后, 利用显微镜自带的XY测量系统, 在合成的完整图片上测量各结构的物理参数(实验测定的各生殖器官大小的样本量与解剖的雌蝶样本量不一致是由于解剖过程部分器官会出现破损的情况, 而对于有破损的器官没有进行测定)。
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雌成虫内生殖器官测定了卵巢小管长度、卵巢小管中部直径和侧输卵管直径, 不测量出现破损的卵巢小管和侧输卵管, 1~12日龄各参数分别测定的成虫数量见表 1。根据图片, 统计卵巢小管中成熟卵与未成熟卵母细胞数量。成熟卵呈乳白色、表面均匀分布着纵嵴(图 1A); 未成熟卵为卵黄沉积处于50%~100%, (图 1B)。对于卵巢小管出现破损的雌蝶, 不统计卵的数量。由于1日龄并未发现有卵黄沉积, 因此未有1日龄相关统计数据。2~12日龄雌蝶卵巢小管中卵数量分别统计的头数见表 1。
日龄
Age/d雌蝶成虫数量Number of female adult Tirumala limniace 卵巢小管长度
Length of ovariole卵巢小管直径
Diameter of ovariole卵巢内的卵
Number of oocyte in the ovaries侧输卵管直径
Diameter of lateral oviducts1 7 6 — 6 2 8 7 5 8 3 5 3 5 3 4 6 4 6 3 5 8 8 14 7 6 6 3 9 4 7 6 6 5 7 8 8 4 6 4 9 5 4 8 6 10 3 3 3 4 11 4 3 5 3 12 8 3 6 3 Table 1. The sample capacity for measuring the characteristic parameters of female adult Tirumala limniace
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不同日龄间雌成虫卵巢小管长度与直径、精巢纵轴长与横轴长、以及侧输卵管直径的差异采用One-Way ANOVA进行检验, 当差异达到显著时, 则采用Duncan’s multiple-range test进行检验。不同日龄间雌成虫卵巢小管内未成熟卵和成熟卵数量的差异采用One-Way ANOVA进行检验, 当差异达到显著时, 则采用Duncan’s multiple-range test进行检验。同日龄雌成虫卵巢小管未成熟卵与成熟卵数量间差异, 采用Student’s t test进行检验。所有统计分析均在SAS 9.4中进行。