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柿(Diospyros kaki Thunb.)为柿科(Ebenaceae)柿属(Diospyros L.)落叶乔木或灌木, 生态幅广、适应性极强[1], 是我国主要的木本粮食树种, 近年来随着国家对木本粮油产业的重视[2], 柿重新受到了人们的关注, 炭疽病是柿树上发生的主要侵染性病害, 严重制约了柿产业的发展[3]。
该病主要发生在柿树叶片、枝条、果蒂和果实上, 不同品种及同一品种的不同部位发病情况不同[4]。叶片发病时叶柄、叶脉变成黑色, 形成坏死病斑, 这也是柿炭疽病区别于其它柿叶部病害的明显标志; 枝条发病时, 主要表现在柿树的幼梢, 严重时病斑互相融合, 从而引起叶片脱落, 甚至导致枝条死亡[5]; 柿蒂发病时, 表现为黑色坏死现象; 果实发病时变红变软, 提前脱落。柿炭疽病的病菌主要以菌丝体在幼龄枝条病组织及芽眼中越冬, 也可在病果、叶痕和冬芽中越冬, 翌年条件适宜时以孢子的形式借风雨和昆虫传播, 主要侵染新梢及幼果。一般新梢6月上旬开始发病, 雨季发病较为严重, 果实6月下旬至7月中下旬发病。Weir等基于分子生物学和形态学的差异将柿树炭疽病菌的表位型界定为柿盘长孢菌Gloeosporium kaki Hori, 而分类学上将其归类为柿树炭疽菌Colletotrichum horii nom. nov [6]。
炭疽病在多种果树、农作物上均有发生和研究报道[7-11], 柿炭疽病的研究相对较少, 主要集中在部分品种炭疽病菌的分离鉴定和分子序列分析[12-14]、侵染过程、发生发展规律及综合防治技术[5, 15], 对于柿炭疽病防治药剂的筛选还处于初步研究阶段[16-17], 研究涉及的药剂种类较少或者为早期药剂, 加之炭疽病在多种植物上发生, 所以生产中使用的防治药剂种类繁杂、效果不一、安全性不确定, 因此对柿炭疽病防治药剂的筛选显得格外重要。本文针对柿炭疽病菌选择了10类22种杀菌剂, 室内测定各种药剂对柿炭疽病菌的抑制作用, 筛选出抑制力强的药剂进行田间防治试验。
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选取采集于山东青州、广西恭城、河南栾川及陕西富平的4个具有代表性的菌株; 杀菌剂包括苯并咪唑类、三唑类、二甲酰亚胺类等10类22种。(1)MIC值测定: 将供试菌株接种在含1、5、10 μg·mL-1杀菌剂的PSA平板上, 不含药的PSA平板为对照, 每皿2个菌株, 每处理2次重复, 25℃培养4 d后, 采用十字交叉法测量各处理的菌落直径, 求平均值后, 计算抑制率, 得出药剂对炭疽病菌的最低抑制浓度(Minimum inhibitory concentration, MIC)。抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径/(对照菌落直径-5)×100%;(2)EC50值测定: 采用菌丝生长速率法[18]进行测定, 采用MIC测定中的抑制率公式求出各个药剂浓度对菌丝生长抑制率, 所得数据经Finney概率分析后用DPS v12.01统计软件求出毒力回归方程式及EC50。实验步骤包括: 1)配置杀菌剂母液。将备试原药用丙酮溶解, 配制成10 g·L-1的母液备用。2)炭疽菌株进行活化。把炭疽的菌丝接种于培养皿的PSA培养基平面中央, 培养4 d左右待用。3)制备带毒培养基。依据前期各杀菌剂对柿炭疽病菌MIC值的测定结果, 设置系列浓度梯度(表 1), 根据浓度梯度加入一定量的杀菌剂母液, 制备系列浓度的带毒培养基。4)炭疽病菌接种。将活化后的炭疽病菌用打孔器在菌落边缘打出直径为0.5 cm的菌饼, 然后接种于含药剂系列浓度的PSA培养基上。5)病菌抑制效果观测。炭疽病菌于25℃培养箱中培养6 d左右, 观察菌丝生长状况, 测量菌落直径, 算出抑制率。以不加药剂的PSA平板为空白对照, 每个药剂浓度3个重复。
杀菌剂Fungicides 生产厂商Manufacturer 浓度梯度Concentration gradient /(μg·mL-1) 苯醚甲环唑
Difenoconazole山东潍坊双星农药有限公司
Shandong Weifang Shuangxing Pesticide Co., Ltd.0、0.156 2、0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0 戊唑醇
Tebuconazole江苏克胜股份有限公司
Jiangsu Kesheng Co., Ltd.0、0.156 2、0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0 噻菌灵
Thiabendazole浙江绿州生物技术有限公司
Zhejiang Lvzhou Biotechnology Co., Ltd.0、0.015 6、0.031 2、0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0 多菌灵
Carbendazim山东禾宜生物科技有限公司
Shandong Heyi Biotechnology Co., Ltd.0、0.015 6、0.031 2、0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0 甲基托布津
Methylthiophanate南京柏蓝科技有限公司
Nanjing Bailan Technology Co., Ltd.0、0.031 2、0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0 苯菌灵
Benomyl南京柏蓝科技有限公司
Nanjing Bailan Technology Co., Ltd.0、0.031 2、0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0 速克灵
Procymidone日本住友化学株式会社
Japan Sumitomo Chemical Corp0、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0、10.000 0、20.000 0 扑海因
Rovral拜耳作物科学(中国)有限公司
Bayer Crop Science (China) Co., Ltd.0、0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0、10.000 0 嘧菌酯
Azoxystrobin中国农科院植保所农药厂
The Pesticide Factory of IPP of CAAS0、0.468 8、0.937 5、1.875 0、3.750 0、7.500 0、15.000 0 噻呋酰胺
Thifluzamide利民化工股份有限公司
Limin Chemical Co. Ltd.0、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0、10.000 0、20.000 0 氟酰胺
Amide拜耳作物科学(中国)有限公司
Bayer Crop Science (China) Co., Ltd.0、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0、10.000 0、20.000 0 乙霉威
Diethofencarb海利尔药业集团股份有限公司
Hailier Pharmaceutical Group Co., Ltd.0、2.500 0、5.000 0、10.000 0、15.000 0、20.000 0、40.000 0 嘧霉胺
Pyrimethanil中国农科院植保所农药厂
The Pesticide Factory of IPP of CAAS0、10.000 0、20.000 0、40.000 0、50.000 0、60.000 0、80.000 0 吡唑醚菌酯
Pyraclostrobin德国巴斯夫公司
German Basf Inc0、0.468 8、0.937 5、1.875 0、3.750 0、7.500 0、15.000 0 丙环唑
Propiconazole陕西标正作物科学有限公司
Shaanxi Biaozheng Crop Science Co., Ltd.0、0.078 1、0.156 3、0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0 烯唑醇
Diniconazole江苏剑牌农化股份有限公司
Jiangsu Sword Agricultural Co., Ltd.0、0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0、10.000 0 三唑酮
Ketotriazole江苏剑牌农化股份有限公司
Jiangsu Sword Agricultural Co., Ltd.0、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0、10.000 0、20.000 0 甲基立枯磷
Tolclofos-methyl青岛瀚正益农生物科技有限公司
Qingdao Hanzhengyinong AgroSciences Biotechnology Co. Ltd.0、0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0、10.000 0 咯菌腈
Fludioxonil瑞士先正达作物保护有限公司
Syngenta Crop Protection Co. Ltd.0.004 9、0.009 8、0.019 5、0.039 1、0.078 1、0.156 3 百菌清
Chlorothalonil利民化工股份有限公司
Limin Chemical Co. Ltd.0、0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0、10.000 0 福美双
Thiram河北赞峰生物工程有限公司
Hebei Zanfeng Biological Engineering Co., Ltd.0、0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0、10.000 0 代森锰锌
Mancozeb美国杜邦公司
DuPont Engineering Polymers0、0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0、10.000 0 注: 以上杀菌剂均按有效成分计算质量浓度, 按照每种农药的说明用量范围而定。
Note: The concentration of above fungicides are calculated according to the effective composition, in accordance with the scope of the description of each pesticide dosage.Table 1. Sources of fungicides and gradient concentration of the treatment
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试验在广西平乐县(110°38'35.91″ E, 24°38'0.32″ N)沙子镇一个10年生水柿园进行, 株行距为3.5 m×4 m。柿园地形为平地, 红壤, pH值6.2, 肥力中等, 管理水平中等, 整个园区发病情况基本一致。
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结合已经得到的室内防治药剂筛选结果, 选择其中效果较好和未做室内试验但较新型药剂共5种进行柿炭疽病室外防治药剂的筛选试验, 设5个药剂处理(表 2)和1个清水对照, 每处理3次重复, 共18个小区, 每小区3株柿树, 每个处理9棵树喷1喷雾器药液(22 kg)。施药时间为2015年8月10日、9月1日、9月20日和10月8日, 皆为晴天或多云, 喷药后3 d内均未下雨。前两次施药时间为下午4:00左右, 后两次施药时间为下午3:00左右。
处理
Treatment生产厂商
Manufacturer剂型
Dosage forms使用浓度
Concentration苯醚甲环唑
Difenoconazole山东潍坊双星农药有限公司
Shandong Weifang Shuangxing Pesticide Co., Ltd.30%
WG1 500倍
1 500 times噻呋酰胺
Thifluzamide利民化工股份有限公司
Limin Chemical Co. Ltd.240 g·L-1
SC2 000倍
2 000 times吡唑醚菌酯
Pyraclostrobin德国巴斯夫公司
German Basf Inc240 g·L-1
EC1 000倍
1 000 times咪鲜胺
Prochloraz湖南大乘医药化工有限公司
Hunan Dacheng Pharmaceutical Chemical Co. Ltd.25%
EC2 000倍
2 000 times咯菌腈
Fludioxonil瑞士先正达作物保护有限公司
Syngenta Crop Protection Co. Ltd.25 g·L-1
SC1 000倍
1 000 timesTable 2. Information about the fungicides of field treatment
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在每株调查柿树的树冠中等偏上部位东、西、南、北4个方向定枝4个, 每枝果数不少于10个(广西水柿发生该病主要表现在果实上, 所以本试验不调查叶片及果蒂), 于每次喷药前调查病果率(由于柿果发生炭疽病导致的果实过早脱落和病斑的大小无关, 所以本试验调查时只调查病果率, 不调查发病等级), 考虑到每次病果率调查时由于发生炭疽病导致的果实脱落情况, 病果率的计算方法为: 病果率=[调查当次树上病果数+(初次调查果实总数-当次调查果实总数)-其它因素落果数]/初次调查果实总数。最后一次调查时间为喷药后的第10天即10月18日。防治效果=(对照病果率-处理病果率)/对照病果率×100%。
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应用Microsoft Excel 2007、SPSS19.0和DPS v12.01统计软件对数据进行处理和制表、制图等。
1.1. 常见杀菌剂对柿炭疽病病菌室内毒力测定
1.2. 药剂田间防治试验
1.2.1. 试验地情况
1.2.2. 试验方法
1.2.3. 调查方法
1.3. 数据处理
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供试的10类22种杀菌剂对采集于山东青州、广西恭城、河南栾川及陕西富平的4个菌株的抑制作用见表 3, 对柿炭疽病菌菌丝生长抑制效果较好的杀菌剂有苯并咪唑类、脱甲基抑制剂类(三唑类、DMIs)、苯吡咯类3类杀菌剂, 它们有的品种已应用在柿炭疽病的化学防治上, 有的则正在作为复配剂进行开发。琥珀酸脱氢酶抑制剂类(SDHIs)及甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂(QoIs)对柿炭疽病菌毒力差异较大, 需作进一步的探索。其中琥珀酸脱氢酶抑制剂类(SDHIs)中的噻呋酰胺对于广西水柿炭疽病病菌抑制作用较强, 所以选用该药进行室外试验。三唑类药物虽然对于柿炭疽病病菌抑制作用较强, 但其代表性药剂多菌灵、苯菌灵等能诱发病原菌的抗性, 同类品种间有正交互抗性, 应注意与其它类型杀菌剂混用或轮换使用, 所以室外试验未选择三唑类药剂。结合表 2与市场上的新型杀菌剂使用情况, 室外试验选择了苯醚甲环唑、咪鲜胺、咯菌腈、吡唑醚菌酯、噻呋酰胺5种杀菌剂。
药剂类别Type of fungicides 药剂名称Name of fungicides MIC/(μg·mL-1) EC50/(μg·mL-1) 苯并咪唑类Benzimidazoles group 噻菌灵Thiabendazole 1 0.100~90.194 0 多菌灵arbendazim 1 0.160~00.298 7 苯菌灵Benomyl e 1 0.088~40.244 3 甲基托布津Methylthiophanat 1 0.211~10.520 3 氨基甲酸酯类Carbamate group 乙霉威Diethofencarb >10 37.569~8174.927 DMIs group 苯醚甲环唑Difenoconazole 10 0.101~00.311 4 戊唑醇Tebuconazole 10 0.143~50.375 3 烯唑醇Diniconazole ≥10 0.311~00.684 7 三唑酮Ketotriazole >10 17.951~733.146 9 丙环唑Propiconazole 5 0.093~80.178 4 SDHIs group 噻呋酰胺Thifluzamide >10 0.071~7665.484 8 氟酰胺Amide 0.115~240.661 0 二甲酰亚胺类Dicarboximide group 扑海因Rovral 5 30.294~3104.517 1 速克灵Procymidone >10 19.904~934.583 8 苯吡咯类Phenyl group 咯菌腈Fludioxonil 10 0.011~20.041 0 QoIs group 嘧菌酯Azoxystrobin >10 21.338~354.580 6 醚菌酯Kresoxim-methyl 36.064~945 687.779 6 苯胺基嘧啶类Aniline group 嘧霉胺Pyrimethanil >10 38.319~569.209 6 有机磷类Organophosphorus group 甲基立枯磷Tolclofos-methyl >10 0.981~14.180 6 保护性杀菌剂Protectant fungicides group 75%百菌清制剂75% chlorothalonil 271.454 2216~874.661 5 70%代森锰锌制剂70% mancozeb 10 μg·mL-1时抑制率不到5%
The inhibition rate of 10 μg·mL-1
was less than 5%50%福美双制剂50% thiram 10μg·mL-1时抑制率不到5%
The inhibition rate of 10 μg·mL-1
was less than 5%Table 3. Inhibition effects of different fungicides on pathogens of anthracnose of persimmon
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由表 4可以看出, 除噻呋酰胺以外其余4种药剂对柿果炭疽病的防治效果均较好, 5种药剂的防治效果基本上呈现出先上升后下降的趋势, 但不同药剂发挥效果的时间有差异, 其中苯醚甲环唑和噻呋酰胺起效较慢, 咪鲜胺起效较快。总体来看咪鲜胺和咯菌腈起效较快且最终防治效果较好, 吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑次之, 噻呋酰胺效果最不理想; 病果率基本呈现上升的趋势, 尤其是清水对照, 发病率上升较为明显, 10月18日最后一次调查时对照发病率达到63.5%, 其它几种处理发病率为30%~50%, 不同处理之间均达到极显著差异。
药剂
Fungicides调查日期(月-日)Survey date (month-day) 08-25 09-21 10-18 病果率
Diseased fruit rate/%防治效果
Control effects/%病果率
Diseased fruit rate/%防治效果
Control effects /%病果率
Diseased fruit rate/%防治效果
Control effects /%咪鲜胺Prochloraz 5.23a 64.07e 13.41a 62.11e 33.24a 47.76d 苯醚甲环唑Difenoconazole 14.22c 2.33a 25.13d 28.99b 42.72b 32.86c 咯菌腈Fludioxonil 9.34b 35.85d 18.66b 47.27d 32.39a 49.10d 噻呋酰胺Thifluzamide 13.85c 4.88b 29.38e 16.98a 51.72d 18.72a 吡唑醚菌酯Pyraclostrobin 10.52b 27.75c 22.62c 36.08c 46.81c 26.43b 清水对照Clear water control 14.56c - 35.39f - 63.63e - 注: 不同小写字母表示P≤0.05水平下显著性差异。
Note: The different small letters represent significant difference of P level less than or equal to 0.05.Table 4. Inhibition effects of different fungicides on anthracnose of persimmon in field treatment