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松墨天牛(Monochamus alternatus Hope)属鞘翅目(Coleoptera)天牛科(Cerambycidea)墨天牛属(Monochamus)，是一种严重危害马尾松(Pinus massoniana Lamb.)、湿地松(Pinus elliottii Engelm.)等林木的害虫，其成虫也是松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus (Steiner&Buhrer) Nickle)的主要传播媒介[1-2]。目前，松墨天牛的引诱剂应用广泛，主要为植物源物质，以(+)-α-蒎烯、(-)-β-蒎烯为主[3-4]，此外松墨天牛产生的聚集信息素2-十一烷氧基-1-乙醇也能很好引诱雌雄成虫，配合植物源信息化合物有显著增效作用[5]。
昆虫信息素配合植物源引诱剂制成诱芯，能够在生产上很好地达到大量诱捕害虫和干扰害虫交配的目的[6]。但是，实践证明这类诱芯存在着防治持续时间短，受外界环境影响大，稳定性差等缺点[7-8]，阻碍了诱芯的大面积推广应用。因此有必要在仿生诱芯的制作中，引入或改良现有的缓释技术，选择适宜的缓释载体，保护信息化合物免受环境降解并能保持长期稳定释放，以最大发挥诱芯的生物活性。
目前主要有两大类缓释技术，一类是将活性物质溶解、包埋或者分散在缓释材料中以减少扩散速率的物理缓释法，报道应用多的有硅橡胶诱芯[9]、性信息素微胶囊[10]、空心纤维[11]、迷向丝、蜡滴[12]等；另一类是通过化学反应将引诱活性物质和缓释剂进行反应，形成以化学键相连的释放体系，该体系能有效延长缓释时间[13]。通过物理材料进行缓释是主要的延长引诱剂使用时间的方法，缓释载体本身的特性常会对引诱剂造成一定影响，比如蜡滴常因夏季的高温而缩短使用寿命[14]，橡胶载体中因存在交联剂硫会影响昆虫信息化合物的稳定性[15]等，这些都容易造成某种材质的载体不容易推广使用。目前生产上应用较多的缓释载体是橡胶塞和迷向丝。
本研究选用4种缓释材料作为诱芯，分别为低密度聚乙烯材料(LDPE)、高密度聚乙烯材料(HDPE)、聚乙烯管(PE)和灯芯瓶(PP)。低密度聚乙烯材料(LDPE)又称高压聚乙烯，由于其材质具有较低的分子密度、良好的延伸性、电绝缘性、化学稳定性，使得它能广泛应用于农膜、包装膜以及管材等制品，在生产上有重要作用。高密度聚乙烯材料(HDPE)是乙烯经聚合制得的一种热塑性树脂，该材料无毒，无臭，具有良好的耐热性和耐寒性，而且化学稳定性较好，能耐大多数酸碱的侵蚀。聚乙烯管(PE)常用来制作迷向丝，目前已经有很多企业进行工业化生产和防治应用，这种缓释技术为物理缓释，性信息素每小时从迷向丝的释放速率是处于召唤期雌蛾的600~1 000倍[16]。灯芯瓶的材质为普通塑料，内部有一根连接液体和外部的棉灯绳，用以帮助挥发内部物质。APF-Ⅰ型引诱剂是松墨天牛高效引诱剂，具有诱捕效率高、靶标专一、使用剂量低的特点，在天牛的防治及松材线虫病的防控中有重要的作用[17]。研究松墨天牛信息化合物在4种缓释载体上的释放模式及释放动态特征，寻找合适的缓释载体材料，近而提高松墨天牛诱芯的引诱效果(图 1)。
Figure 1. Four dispenser types
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松墨天牛信息化合物。植物源引诱剂：(+)-α-蒎烯、(-)-β-蒎烯(北京百灵威科技有限公司，纯度98%以上)。松墨天牛聚集信息素：2-十一烷氧基-1-乙醇(北京中捷四方生物科技股份有限公司提供，纯度95%以上)。对照组诱芯：APF-Ⅰ型诱芯(厦门三涌生物科技有限公司)。
缓释材料。聚乙烯缓释瓶A(LDPE材质，3 mL，壁厚0.067±0.016 mm，质量0.621 7±0.008 7 g)、聚乙烯缓释瓶B(HDPE材质，13 mL，壁厚0.407± 0.054 mm，质量1.682 1±0.013 6 g)、聚乙烯管(PE材质，长120 cm，壁厚0.322±0.025 mm，质量2.236 8±0.008 6 g)及灯芯瓶(PP材质，14 mL，壁厚0.771±0.046 mm，质量5.014 3±0.025 3 g)。
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将(+)-α-蒎烯、(-)-β-蒎烯、2-十一烷氧基-1-乙醇按照9∶1∶1的比例配制成松墨天牛信息化合物混合液，用移液枪将信息化合物混合液转移到缓释瓶中, 加至瓶口处。聚乙烯管由于管孔较小，用进样针注射2 mL信息化合物混合液，两端用打火机封口。每样品设置7组进行试验，其中2组用于GC分析混合物比例，另5组用于称重计算损失量。模拟野外诱芯放置状态，将不同载体诱芯悬挂于同一撞击型松墨天牛诱捕器(北京中捷四方生物科技股份有限公司)同一位置。
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称重法主要测定不同缓释材料中松墨天牛信息化合物的释放速率，松墨天牛信息化合物的释放量和其相对比例都会影响其对松墨天牛的引诱效果。本实验采用精密电子天平称量缓释载体内信息化合物的挥发量(电子天平精度：0.000 1 g，AL204-1C，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。称量采用每种缓释载体的3~7号样品，每5 d称量重量，记录样品的总量和损失量及天气情况，每次称量结束，将样品放回原位置以便继续试验。
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气相色谱分析法主要检测(+)-α-蒎烯、(-)-β-蒎烯和2-十一烷氧基-1-乙醇3种信息化合物释放速率是否同步，随着时间延长，剩余的引诱剂中3种化学物质的比例是否有较大的变化。采用7820A气相色谱仪(气相色谱仪7820A，Agilent公司)进行分析，色谱柱为DB-5 MS非极性毛细血管色谱柱(30 m× 0.25 mm× 0.25 μm)。分析条件：升温程序80℃保持1 min，然后5℃/min上升到230℃，保持5分钟。将每种缓释载体的1、2号样用于分析，用进样针吸取1 μL信息化合物，正己烷稀释1 000倍后取1 μL稀释液进样分析，每次GC分析后都将缓释载体的取样口密封。
谱图定性方法：将(+)-α-蒎烯、(-)-β-蒎烯和2-十一烷氧基-1-乙醇单独进样进行GC分析，得到三种信息化合物峰的保留时间，根据物质的保留时间确定混合信息化合物中的物质峰；谱图定量方法：对检测的引诱剂按面积归一法进行定量分析，分别求得各信息化合物的相对百分含量。
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数据以mean±SE在曲线图上表示，所有数据均采用SPSS 22软件进行数据处理，采用ANOVA进行方差分析，Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。
1.1. 信息化合物成分、缓释载体
1.2. 方法
1.2.1. 引诱剂配制
1.2.2. 缓释速率的测定
1.2.3. 气相色谱(GC)分析
1.3. 数据分析
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对于3种信息化合物在聚乙烯缓释瓶A中释放模式试验表明(图 2)，3种信息化合物在初期处于较低释放水平，日均挥发量随着时间显著提高，第19天达到最大释放量(85.84±2.54 mg·d-1)，然后日均挥发量呈现显著下降趋势，直到第33天，日均挥发量缓慢下降，并达到一个极低的释放状态，在观测末期第68天，释放量仅为(2.57±0.21)mg·d-1。经过多重比较分析(Duncan, α=0.05)发现第19天释放速率显著高于其他时间。
Figure 2. Dynamic release rates of three semiochemicals in LDPE bottle
在释放初期第8 d，3种信息化合物的比例接近初始比9∶1∶1，(+)-α-蒎烯、(-)-β-蒎烯和2-十一烷氧基-1-乙醇的相对含量分别为84.45%，9.18%，6.35%。从第28天开始，3种信息化合物组分比出现显著变化，具体表现在(+)-α-蒎烯挥发量增大，2-十一烷氧基-1-乙醇的比例显著升高，到观测末期第68 d，3者的相对含量为2.20%，0.07%，95.82%。对比68 d内的释放模式，松墨天牛信息化合物(+)-α-蒎烯在聚乙烯缓释瓶A中释放较快，不能长期保持信息化合物初始有效配比。
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三种松墨天牛信息化合物在聚乙烯缓释瓶B中的日均释放量有一定的波动性(图 3)，但波动变化不明显。在第34天达到最大释放速率为(50.48± 5.54)mg·d-1。
Figure 3. Dynamic release rates of three semiochemicals in HDPE bottle
在观察初期第10天(+)-α-蒎烯，(-)-β-蒎烯和2-十一烷氧基-1-乙醇的相对含量分别为75.13%，12.02%，12.80%，在60天左右，三者相对含量分别为12.90%，1.21%，83.84%。(+)-α-蒎烯，(-)-β-蒎烯在10~60天内的相对含量下降率分别为82.83%，89.93%，2-十一烷氧基-1-乙醇的相对含量上升率为555.00%。期间，在前20天，(+)-α-蒎烯相对含量在65%以上，在40天左右，下降为23.39%。
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3种松墨天牛信息化合物在聚乙烯管中的日均释放速率呈逐渐下降的趋势(图 4)。表现在初始释放时3种信息化合物就达到释放高峰，第4~14天释放速率迅速下降，此后日均释放速率减缓，第33天后保持低释放速率状态。经过多重比较分析(Duncan, α=0.05)发现第43~68天，释放速率差异变化不显著，第4、8天平均释放速率高于其他测试时间，分别为120.10± 8.17 mg·d-1，70.96± 5.49 mg·d-1。
Figure 4. Dynamic release rates of three semiochemicals in PE tube
3种松墨天牛信息化合物在聚乙烯管中相对含量变化量较大(图 4)。第8天左右，(+)-α-蒎烯，(-)-β-蒎烯和2-十一烷氧基-1-乙醇相对含量分别为82.27%，8.52%，9.14%，第68天，三者相对含量分别为37.49%，6.62%，53.63%，(+)-α-蒎烯，(-)-β-蒎烯的相对含量下降率分别为54.43%，22.30%，2-undecyloxy-1-ethanol的相对含量上升率高达486.76%。期间，前20天左右，(+)-α-蒎烯占组分比例75%以上，2-十一烷氧基-1-乙醇占组分比例在15%以下，但在40天左右，(+)-α-蒎烯相对含量下降到了49.10%，2-十一烷氧基-1-乙醇的组分比例达到在40%以上。
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3种松墨天牛信息化合物的日均释放速率如图 4，对于灯芯瓶中损失量的计算发现，在第5天初次测试时释放量较高，然后释放速率迅速下降直至第10天，而后直到观测末期，3种信息化合物的释放量一直处于极低的释放水平。在进行Duncan多重比较分析时发现三种信息化合物在第69天的释放速率显著低于第34天(P＜0.05)；第5天释放速率最大为24.11± 0.56 mg·d-1。但由于该材料本身没有缓释效果，其缓释方式依赖于棉灯绳，该材料的总体释放速率较低。
在灯芯瓶缓释载体中，在第10天左右，(+)-α-蒎烯，(-)-β-蒎烯和2-十一烷氧基-1-乙醇的相对含量分别为85.69%，9.28%，3.75%，第60天左右，三者相对含量分别为85.67%，9.23%，5.06%。(+)-α-蒎烯，(-)-β-蒎烯的相对含量下降率分别为0.02%，0.54%，2-十一烷氧基-1-乙醇的相对含量上升率为34.93%。三者组分比例变化不明显。
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引诱剂中信息化合物的释放曲线与聚乙烯管相类似，即在初次测试时释放量最高，第4天释放速率显著高于其他测试时间点(P＜0.05)，达到97.12±1.57 mg·d-1，第4~8天释放速率迅速下降，8~38天时，呈有规律的浮动变化，并在38天时达到第8天后的第一次最大释放量(图 5)。之后，释放量又逐渐回到低速率释放状态(P＜0.05)。
Figure 5. Dynamic release rates of three semiochemicals in PP bottle
APF-Ⅰ型引诱剂在第8天初始GC分析时，(+)-α-蒎烯，(-)-β-蒎烯和2-十一烷氧基-1-乙醇三者的相对含量分别为97.84%，1.55%，0.61%，在观测末期，三种组分的比例分别为15.48%，0.35%，84.17%，(+)-α-蒎烯，(-)-β-蒎烯相对含量下降率分别为61.24%，1.9%，但2-十一烷氧基-1-乙醇的比例偏高。第48天时，保持在75%以上的相对含量。第60天以后，(+)-α-蒎烯已经下降到20.66%，此时诱芯需要更换。
Figure 6. Dynamic release rates of three semiochemicals in APF-Ⅰ attractant
2.1. 3种信息化合物在聚乙烯缓释瓶A(LDPE)中的释放模式
2.2. 三种信息化合物在聚乙烯缓释瓶B(HDPE)中的释放模式
2.3. 3种信息化合物在聚乙烯管(PE)中的释放模式
2.4. 3种信息化合物在灯芯瓶(PP)中的释放模式
2.5. APF-Ⅰ型引诱剂中三种松墨天牛信息化合物的释放模式
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昆虫信息化合物的释放速率与缓释载体的特性有关，包括缓释载体的厚度、长度、是否开口以及开口的孔径大小等因素[18]。灯芯瓶作为缓释载体信息化合物的释放速率差异不显著，灯芯瓶的瓶身材质为普通塑料(PP)，物质穿透性较差，内部引诱物质主要通过发散的棉灯绳扩散到外部。由于灯芯瓶缓释载体挥发物从灯芯部位向外挥发，容易堵塞，因而挥发速率也慢。昆虫信息化合物同样可以通过管(瓶)壁的微小孔中释放，调节壁厚可使引诱剂的释放量改变[8, 19]，因此可以适当选择薄壁材质缓释载体。
聚乙烯缓释瓶A和聚乙烯缓释瓶B的缓释模式有一定相似性，表现在松墨天牛信息化合物释放的高峰期不在初次测试时，两者的最高缓释速率分别在第19天和33天，这可能是由于内部引诱物质需要逐渐渗透缓释载体瓶壁，故在初次测试时释放量较低，缓释速率的高峰期也有延迟，并且聚乙烯缓释瓶A中松墨天牛引诱物质的释放速率高于聚乙烯缓释瓶B，这可能是LDPE缓释材料壁薄，内部信息化学物质透过性较好。Wang等通过观察α-蒎烯在微球载体中的缓释情况，发现α-蒎烯初始阶段释放速率增加快，后期释放缓慢，猜测可能是后期芯材物质大量外涌释放，堵住了壁材的小孔，所以释放变的缓慢[20]。本缓释实验用的聚乙烯缓释瓶可能在实验末期也有一定的管壁缓释孔堵塞的情况，加之缓释瓶野外放置有一定的老化，所以导致实验后期缓释效果不佳。灯芯瓶和APF-Ⅰ型材料在初次测试时就达到缓释效果最大值，这与刘奎伟等在研究中发现性信息素在复合橡胶载体初试阶段的释放量显著大于其他测试阶段现象相似[21]。另外，Bradley等[22]指出信息素成分在聚乙烯管载体中的缓释曲线呈现对数状下降，本试验测试中聚乙烯管中的松墨天牛信息化合物有相同的缓释模式，在观测末期，松墨天牛化学信息物质缓释效果不佳的原因可能是内部信息化学物质的异构化。
不同缓释材料之间保持内部昆虫信息化合物协调释放的能力也有较大差异。聚丙烯材质的灯芯瓶能较好的保持内部物质比，(+)-α-蒎烯是引诱松墨天牛的主要信息化合物，(+)-α-蒎烯的相对含量要保持在一定的浓度内才能发挥引诱作用[23]。内部α-蒎烯在观察期内相对含量下降率仅为0.02%，而在聚乙烯缓释瓶A、聚乙烯管、APF-Ⅰ引诱剂中，它的相对含量下降率分别为97.39%，54.43%，61.24%，α-蒎烯的相对变化量较大。尽管灯芯瓶作为缓释材料能较好保持内部组分的挥发比, 但由于其日均释放量较低，故室外实际引诱效果不佳，而α-蒎烯在聚乙烯缓释瓶A、PE管中前期缓释量较大，3种信息化合物的比例较为协调，因此可作短期的缓释材料考虑。
作为对照的APF-Ⅰ引诱材料，(+)-α-蒎烯的相对含量在40天时，有高达91.96 %的相对含量，在50天时，其比例仍有76.17%。说明该引诱剂的持效期长，可达到少更换诱芯，减少人工成本的目的。APF-Ⅰ引诱材料在实际使用时能保持长期的使用效果，但也有一定的局限性，表现在初始时有较高释放量，同时释放期间有一定波动会影响松墨天牛接收化学信号的强弱，导致监测松墨天牛种群动态时不准确。室外的缓释试验常会受到外界条件环境的影响，Teale等研究发现，聚乙烯类昆虫信息素的缓释载体中(+ / -)-α-蒎烯的释放速率为2 g·d-1，显著大于试验中聚乙烯缓释瓶A中30.93 mg·d-1和聚乙烯缓释瓶B中31.01 mg·d-1的日均释放速率[24]。这可能与试验中缓释材料的壁厚以及外界风速、温度等环境因子有关。
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本研究中4种不同的缓释载体在70天左右仍能释放，说明这4种材料理论上都能在野外达到较长期的引诱效果，但从物质缓释的协调性来看，3种松墨天牛信息化合物在聚乙烯缓释瓶A(LDPE)、聚乙烯缓释瓶B(HDPE)和聚乙烯管(PE)中组分的挥发比例不协调，即不能较好保持3种信息化合物的初始比例；从4种缓释材料内部信息化合物的日均释放速率来看，聚乙烯缓释瓶A、聚乙烯管及灯芯瓶材料试验初期信息化合物释放量大，随试验时间延长，释放量减小(灯芯瓶试验后期70 d的释放量极小)，这不利于保持引诱剂长期引诱效果，聚乙烯缓释瓶B的挥发量波动较为稳定。相比较APF-Ⅰ型引诱剂的释放动态，聚乙烯管缓释曲线最接近，但聚乙烯管的转载量较小是阻碍其应用的问题。
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