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国际农业生物技术服务组织(ISAAA)发布的最新统计数据，截止到2014年转基因植物商业化种植已经进行了19年(1996年—2014年)，转基因植物的推广面积持续增加[1]。在林木方面，通过转基因手段已获得了耐盐[2]、抗虫[3-4]、抗除草剂[5]、降低木质素含量[6]、增加生长量[7]等转基因树木。伴随着转基因植物的快速发展，关于转基因植物安全性方面的争论一直存在。因此，转基因植物在实际推广之前需要进行安全性评估。目前，转基因植物生态安全性评估[8]主要集中在转基因植物外源基因逃逸[9-10]以及对生态系统的影响方面。土壤微生物是土壤生态系统的一个重要组成部分，参与土壤生态系统中物质循环和能量流动，对土壤中C、N、P和S等养分元素的循环和有机质的分解起重要作用[11]。转基因植物的外源基因通过水平转移，将遗传物质传递给非子代的其他细胞的方式整合到土壤微生物的基因组中，从而可能使土壤微生物的遗传特性与功能发生一定变化。外源基因的表达所引起的植物生理代谢的改变，以及外源基因表达的产物进入土壤生态系统后可能会对根际微生物群落产生潜在影响[12]。因此，在研究中经常通过测定土壤微生物种类和数量作为转基因植物安全性监控的指标。
国内外关于转基因植物安全性的研究多集中在大豆、玉米、棉花等1年生农作物上[1]，关于转基因林木对土壤微生物多样性的研究报道多以苗期或幼树为主[1, 13-15]，对成龄期树木的研究很少[16]。林木多是在成龄期取材利用，所以，对转基因林木的安全性监测需要长期进行。在苗期调查时未发现转多基因库安托杨对土壤微生物的数量造成影响[17]。本研究以8年生转多基因的库安托杨为研究对象，研究了外源基因是否发生转移及对土壤微生物数量的影响，为转基因杨树安全性评估提供参考。
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试验林位于北京市房山区韩村河东营苗圃，2006年春季造林，每个转基因株系按正方形种植，行10株、列10株(密度2 m×2 m)，造林总面积为0.66 hm2。试验地的地势、地貌、气温、降雨、植被、栽培管理等自然条件和人为管理均一致，整个试验阶段林地不进行任何肥水及喷施农药管理。实验材料为转5个基因的库安托杨(P.×euramericana‘Guariento’) 5个株系，5个外源基因包括：枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因(SacB)、透明颤菌血红蛋白基因(Vgb)、双价抗蛀干害虫基因(BtCry3A+OC-Ⅰ)及调节基因(JERF36)，5个株系编号为D5-9、D5-19、D5-20、D5-21和D5-24，非转基因无性系编号为(D5-0)。各株系经PCR、Southern杂交和BtCryA ELISA等分子检测，同时含有上述5个基因[18]。
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分别于2013年4、5、6、7、8、9、10月，在林地内每个株系随机选择3株，以植株为中心，选取与主干半径50 cm距离的等边三角形的3个顶点，去掉腐殖质层，使用土钻钻取非根际土壤，留取10~20 cm土柱，将土样中的石块和植物残体等杂物去掉，装入无菌的封口袋中混合均匀，每个系号3次重复。放在冰盒内带回实验室，在4 ℃冰箱内保存备用。同年5月分别采集D5-0、D5-9、D5-19、D5-20、D5-21、D5-24等6个无性系林地杂草混合样品，用冰盒带回实验室，置于-80 ℃低温冰箱内保存备用。
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将同一无性系林地下方的植物样品混合研磨，提取多种植物DNA的混合样品。植物样品DNA的提取采用DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germany)法。参照UltraClean® DNA Isolation kit(土壤微生物DNA提取试剂盒)使用说明书，使用试剂盒提取7月份的非根际土壤中微生物的总DNA。
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使用外源基因的特异引物对土壤微生物DNA和植物DNA进行PCR扩增。PCR反应体系如下：10×Taq buffer 5 μL，dNTP Mixture (2.5 mol·L-1) 1 μL；Primer F (10 μmol·L-1) 1 μL，Primer R (10 μmol·L-1) 1 μL，rTaq (2.5 U·μL -1) 0.5 μL，模板DNA 2 μL，加ddH2O补足至50 μL。PCR所用引物序列与反应条件见表 1、2。
目的基因
Gene引物
Primer序列
Primer sequence产物大小
Size/bpVgb 左向Left CCGGGATCCGGATGTTAGACCAGCAAACCA 440 右向Right GCCGTCGACCCTTTATTCAACCGCTTGAG SacB 左向Left GTCGCAAACTATCACGGCTACCAC 743 右向Right GCGCGTTCAATTTCATCTGTTACT BtCry3A+OC-I 左向Left GAGCTGCAAGGCCTTCAAACAAT 440 右向Right TCTAGCACGGTAAGGGTCATCTCT JERF36 左向Left TTGCGATCTGAAGTTGTTGACGAC 320 左向Left CGCCAGCTGAAGGGACGAA Table 1. Foreign genes primers and products size
反应过程
Reaction processVgb基因
Vgb geneSacB基因
SacB geneBtCry3A+OC-I基因
BtCry3A+OC-I geneJERF36基因
JERF36 gene预变性Pre degeneration 95 ℃, 5 min 95 ℃, 5 min 95 ℃, 5 min 95 ℃, 5 min 变性Transgender 95 ℃, 30 s 95 ℃, 30 s 95 ℃, 30 s 95 ℃, 30 s 复性Renaturation 55 ℃, 40 s 55 ℃, 40 s 55 ℃, 40 s 52 ℃, 40 s 扩增Amplification 72 ℃, 40 s 72 ℃, 50 s 72 ℃, 40 s 72 ℃, 40 s 延伸Extension 72 ℃, 10 min 72 ℃, 10 min 72 ℃, 10 min 72 ℃, 10 min 保存Save 4 ℃ 4 ℃ 4 ℃ 4 ℃ Table 2. The processes of PCR
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细菌培养使用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌培养使用马丁(Martin)孟加拉红-链霉素培养基，放线菌培养使用改良淀粉铵盐培养基。首先用灭菌的250 mL三角瓶称取10 g土壤样品，加入90 mL无菌水，再加入少量灭菌的小玻璃珠以方便将土壤摇开，室温下在摇床上(平动用150 r·min-1，晃动用200 r·min-1)振荡30 min，然后使用无菌水对菌液进行浓度稀释，每个处理选择2种浓度的菌液进行培养。细菌选取10-3、10-4浓度的土壤悬浊液，放线菌选取10-2、10-3浓度的土壤悬浊液，真菌选取10-1、10-2浓度的土壤悬浊液，吸取50 μL菌液，均匀的涂在选择性培养基上，每个浓度涂抹5个培养皿，放线菌培养基置于28 ℃的培养箱内培养，细菌和真菌培养基置于35 ℃的培养箱内培养。同时称取一定量的待测土样，用牛皮纸袋装好，放于烘箱中，105 ℃烘烤，恒质量后称量其质量，计算土壤含水量，从而计算出每克干土中土壤微生物的数量。
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采用Excel和SPSS软件对试验数据进行方差分析和多重比较
2.1. 取样方法
2.2. DNA的提取
2.3. PCR反应条件及程序
2.4. 土壤微生物数量测试方法
2.5. 数据统计分析
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利用外源基因Vgb、SacB、BtCry3A+OC-I和JERF36的特异性引物分别对试验林内的根际土壤微生物总DNA和林下杂草混合样品总DNA进行PCR检测。CK-为无底物模板DNA只有水的对照，CK+为对应基因的质粒阳性对照，M为DNA Marker(200、400、700、1 000、1 500、2 000 bp)。由图 1、2可知，未见目的片段。
Figure 1. PCR amplification in genomic DNA of soil microbial
Figure 2. PCR amplification in genomic DNA of plant
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对8年生转基因杨树(D5-9，D5-19，D5-20，D5-21和D5-24)及非转基因杨树(D5-0)的非根际土中细菌、真菌和放线菌的数量进行统计分析。表 3表明：在7月份(杨树生长旺盛阶段)细菌数量急剧增加，显著高于春季开始生长阶段和秋季停止生长阶段，转基因杨树与非转基因杨树土壤中细菌的数量差异不显著。比较同一无性系的转基因杨树在不同月份土壤中细菌的数量发现：除4月份差异显著外，其它月份的差异不显著。真菌数量的变化趋势也是先增加后下降，D5-0、D5-21和D5-24非根际土壤中真菌数量的最大值出现在8月份，D5-9 D5-19 D5-20非根际土壤中真菌数量的最大值出现在9月份，随后明显下降。转基因无性系与非转基因无性系的差异不显著。放线菌数量也有同样的变化趋势，在杨树生长最快的7月份，除D5-24外，其余都达到最大值。
时间Time 细菌数量Quantity of Bacteria/ (×104·CFU·g-1) D5-0 D5-9 D5-19 D5-20 D5-21 D5-24 4月April 5.5±1.5 ab 5.5±0.9 ab 5.3±0.7 ab 6.7±2.0 a 5.2±0.8 b 5.4±1.2 ab 5月May 34.7±13.6 a 31.4±2.7 a 25.5±5.2 a 35.7±7.7 a 31.5±12.6 a 26.1±1.5 a 6月June 45.7±37.9 a 31.4±18.3 a 28.4±7.8 a 38.7±24.5 a 42.6±23.2 a 33.3±11.3 a 7月July 224.0±33.0 a 225.0±40.0 a 199.0±24.0 a 212.0±78.0 a 199.0±41.0 a 213.0±31.0 a 8月August 148.0±45.0 a 148.0±36.0 a 138.0±26.0 a 137.0±20.0 a 166.0±41.0 a 148.0±29.0 a 9月September 26.7±7.7 a 28.6±9.0a 31.5±7.6 a 23.2±5.9a 25.8±4.4 a 24.9±5.6 a 10月October 26.9±2.4 a 23.7±4.8 a 24.6±2.4 a 23.5±4.1a 23.2±5.6 a 21.6±6.0 a 时间Time 真菌数量Quantity of Fungi/ (×102·CFU·g-1) D5-0 D5-9 D5-19 D5-20 D5-21 D5-24 4月April 18.2±11.4 a 15.4±6.1 a 17.9±6.6 a 16.8±4.5 a 18.4±5.6 a 20.5±10.5 a 5月May 27.7±4.8 a 26.4±6.4 a 27.7±8.8 a 28.8±8.7 a 34.5±8.5 a 21.6±2.5 a 6月June 49.7±1.5 ab 41.9±6.1 bc 40.1±9.2 c 56.0±7.7 a 43.9±6.6 bc 49.1±3.1 abc 7月July 42.2±6.9 a 42.3±12.1 a 54.4±12.4 a 48.8±5.9 a 47.8±10.3 a 41.5±6.4 a 8月August 60.8±6.2 a 64.9±11.7 a 64.0±10.3 a 67.5±11.5 a 56.9±7.6 a 62.3±7.5 a 9月September 58.5±11.0 bc 72.6±12.3 a 65.4±4.9 abc 70.6±12.0 ab 56.7±5.0 c 60.6±4.8 abc 10月October 24.2±7.6 a 28.7±5.7 a 26.7±3.6 a 25.9±3.2 a 27.0±6.1 a 29.1±7.6 a 时间Time 放线菌数量Quantity of Actinomycetes/ (×104·CFU·g-1) D5-0 D5-9 D5-19 D5--20 D5-21 D5-24 4月April 4.4±0.8 a 4.6±1.0 a 4.4±0.9 a 4.5±1.0 a 4.1±0.9 a 4.3±0.4 a 5月May 28.8±10.5 a 37.0±9.3 a 31.7±5.9 a 33.2±9.5 a 29.8±8.1 a 29.5±4.7 a 6月June 36.4±5.1 a 45.6±2.7 a 35.6±9.6 a 40.8±10.4 a 43.7±10.0 a 43.0±9.4 a 7月July 53.0±6.1 a 58.0±9.8 a 58.5±11.3 a 63.1±3.5 a 62.4±7.6 a 42.7±6.6 b 8月August 50.9±9.1 a 54.0±8.2 a 50.0±9.8 a 57.5±10.7 a 53.0±9.5 a 53.9±12.3 a 9月September 28.1±13.6 a 34.7±14.6 a 44.7±4.5 a 40.7±4.1 a 43.5±3.8 a 41.7±4.4 a 10月October 22.5±2.0a 22.0±4.8 a 25.8±6.4 a 24.7±8.0 a 24.5±6.7 a 22.1±7.5 a 注：数据是平均值±标准差(n=3)；同一行不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。
Note: Values are means ± standard deviation (n=3). The values followed by diferent lowereases mean significant diference (P＜0.05) between treatments.Table 3. The quantity of microorganisms of different lines measured in 8-Year-Old trees
3.1. 外源基因水平转移的情况分析
3.2. 不同株系中土壤微生物的数量变化
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转基因植物在大面积种植以后，其对环境的影响一直备受关注。转基因林木产生大量的根茬和残枝落叶，外源基因片段会随之进入土壤生态系统，这时目的基因片段有可能会发生基因的水平转移，进入土壤微生物体内并整合到其基因组上，进而改变土壤微生物群落结构及其多样性，而且植物残体和根际分泌物与土壤中的微生物相互作用，也有可能影响微生物的种类、数量以及生命活动。利用外源基因引物分别对试验林内植物总DNA和根际土壤微生物总DNA进行PCR检测，未见目的片段。稀释平板培养法的结果显示：转基因杨树与非转基因杨树的非根际土壤中可培养的细菌、真菌和放线菌数量在不同生长期会出现一定的变化，但是这种变化没有达到显著水平而且变化规律也不明显。微生物的数量都是在杨树生长最旺盛的(7月和8月)达到最大值。
李霞等[15]研究1年生转Bt基因欧洲黑杨发现，转基因和对照林地间及根际土壤中微生物数量在不同月份的差异不显著。胡建军等[16]研究7年生转Bt基因的欧洲黑杨，转基因欧洲黑杨与非转基因欧洲黑杨间根系土壤中细菌、放线菌和霉菌数量的差异不显著，转基因欧洲黑杨与邻近杨树林地的土壤细菌、放线菌和霉菌数量的差异也不显著。张雁等[19]研究转Bt基因南林895杨发现，转Bt基因杨树根际三大类土壤微生物的数量与对照的差异不显著。另一些研究表明，转基因植物对土壤微生物多样性组成的影响显著。王洪兴等[20]在研究转Bt基因的水稻发现，转基因水稻根际细菌数量显著低于非转基因水稻，转基因水稻根际真菌数量却显著高于非转基因水稻，根际放线菌数量没有明显变化规律。王倩倩等[21]研究转CpTI基因苹果发现，种植30 d时，转基因根际土壤中细菌和真菌数量高于非转基因对照；60 d时，根际土壤中真菌数量显著高于对照，而细菌数量显著低于对照。
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通过对8年生转多基因库安托杨5个株系和非转基因株系进行研究，未发现外源基因转移，转基因杨树的土壤微生物数量主要受季节变化影响。森林中土壤微生物的组成和结构复杂，关于林木转基因安全需要进行系统、全面和长期的研究。
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