Phosphate-solubilizing Characteristics and Growth-promoting Effect of Sinorhizobium meliloti CHW10B on Taxus chinensis var. mairei

高效溶磷草木樨中华根瘤菌CHW10B，由本课题组前期从南方红豆杉根际分离筛选得到。

南方红豆杉1年生盆栽实生苗，栽培于长治市林业局苗圃。

溶磷能力测定培养基(NBRIP)：葡萄糖10 g，Ca₃(PO₄)₂ 5 g，KCl 0.2 g，MgCl₂ 5 g，MgSO₄·7H₂O 0.25 g，(NH₄)₂SO₄ 0.1 g，H₂O 1 000 mL，pH值7.0；溶磷细菌活化和保藏培养基(LB)：Tryptone 10 g，Yeast Extract 5 g，NaCl 10 g，H₂O 1 000 mL，pH值7.0~7.4，溶磷细菌保藏培养基另加15~20 g Agar作为凝固剂；IAA定量测定培养基(KB)：Peptone 20 g，MgSO₄·7H₂O 1.5 g，K₂HPO₄ 1.5 g，甘油10 mL，H₂O 1 000 mL，pH值7.2；ACC脱氨酶菌株生长培养基(ADF)见参考文献[11]。

将CHW10B菌株于LB液体培养基中活化2～3次，制备种子液(1×10⁸ cfu·mL^-1)。向灭菌的NBRIP培养基中加入已灭菌磷酸钙，按1%接种量接入CHW10B种子液。以接入等量的LB培养基为空白对照。30℃、180 r·min^-1摇培1周。每天取发酵液离心10 min(4℃, 10 000 r·min^-1)，取上清液，用钼锑抗比色法对可溶性磷含量进行测定^[12]，并选择最适天数开展本研究中的后续实验。

向灭菌的NBRIP培养基中分别加入终浓度为0.63、1.25、2.50、5.00、10.00 g·L^-1的磷酸钙，按1%接种量接入CHW10B种子液。各处理均设3个重复和1个空白对照，在30℃、180 r·min^-1培养最适天数(4 d)后，取适量发酵液测定可溶性磷含量，方法同2.1。

将葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖和可溶性淀粉分别按1%比例加入到NBRIP液体培养基中作为唯一碳源；将(NH₄)₂SO₄、NH₄NO₃、KNO₃、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨分别按0.1‰的比例加入NBRIP液体培养基中作为唯一氮源；以最适的碳源和氮源，将NBRIP培养基的C/N调到150/1、125/1、100/1、75/1、50/1和25/1。每处理设3个重复和1个空白对照，按1%接种量进行接种，在30℃、180 r·min^-1培养最适天数(4 d)后，测定可溶性磷含量，方法同2.1。

按1%的接种量将CHW10B种子液接入到NBRIP液体培养基中，设置培养温度分别为20、25、30、35、40℃；将NBRIP液体培养基pH值分别调至4、5、6、7、8、9、10；分别将20、40、50、60、80 mL NBRIP培养基加入到100 mL三角瓶中，使其体积比分别为1/5、2/5、1/2、3/5、4/5；调节NBRIP培养基的NaCl浓度为0.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 g·L^-1。各处理设3个重复和1个空白对照，30℃、180 r·min^-1培养最适天数(4 d)后，测定可溶性磷含量，方法同2.1。

用高效液相色谱(HPLC)法测定有机酸。取培养72 h的CHW10B发酵液(NBRIP液体培养基)并进行离心(4℃, 10 000 r·min^-1 离心2次, 每次20 min)，取上清液5 mL过0.22 μm微孔滤膜，用高效液相色谱仪(Agilent 1100 series, 美国产)测定有机酸的种类和含量。色谱条件为：色谱柱为菲罗门C18柱，缓冲液为0.05 mol·L^-1磷酸二氢钾(pH值2～3)，柱温30℃，流速1.0 mL·min^-1，检测波长214 nm。同时，设置未接种空白对照，测定方法同CHW10B发酵液。

参考Saleh等^{[11, 13]}的研究方法进行CHW10B菌株ACC脱氨酶活性测定，IAA含量测定采用Salkowski比色法^[14]，产精氨酸脱羧酶(ADC)能力测定参照Sun等^[15]的方法，产嗜铁素参照Yu等^[16]的方法采用CAS平板进行定性检测。

活化CHW10B菌株，30℃、180 r·min^-1 培养2 d，取培养液离心5~6 min(4℃, 5 000 r·min^-1)，无菌生理盐水润洗菌体3次后，用无菌生理盐水制成8×10⁸ cfu·mL^-1接种剂。灌根接种于南方红豆杉实生苗(苗龄1 a)，每株25 mL，对照为等量的无菌生理盐水。每处理设15个重复，置于温室中培养，360 d后测定南方红豆杉的生物量、地径和苗高。

从图 1可看出：前4 d CHW10B菌株培养液的可溶磷含量逐渐增加，到第4天时达到峰值(757.752 mg·L^-1)，此时溶磷能力最强；4 d后该菌的溶磷能力明显降低，但到第7天却有所回升，回升原因可能是培养后期营养耗尽，菌体细胞大量死亡裂解导致可溶性磷释放。以上结果说明，该菌株溶磷的最佳培养时间为4 d。

Figure 1.  Changes of soluble phosphate content in culture liquid of strain CHW10B cultivated 7 days under 30℃

图 2表明：随着磷酸钙浓度的增加，CHW10B菌株的溶磷量呈先上升后下降的趋势；在磷酸钙浓度为2.50～10.00 g·L^-1时，该菌株皆表现出较强的溶磷活性；磷酸钙为5.00 g·L^-1时，该菌株的溶磷量最高(740.310 mg·L^-1)，溶磷能力最强。

Figure 2.  Changes of soluble phosphate content in culture liquid of strain CHW10B cultivated under different calcium phosphate contents

图 3表明：不同碳源明显影响CHW10B菌株溶解磷酸钙的能力；以葡萄糖为唯一碳源时，该菌株溶磷能力最强，溶磷量达740.310 mg·L^-1；其次为果糖(79.457 mg·L^-1)；以麦芽糖、甘露醇、蔗糖和可溶性淀粉为碳源时，溶磷量大幅降低，尤其以可溶性淀粉为碳源时，溶磷量最小(2.907 mg·L^-1)。由此可知，葡萄糖为CHW10B菌株充分发挥其溶磷功能的最适碳源。因此，在CHW10B菌株的实践应用中，应考虑与可以降解土壤中多糖的菌株结合使用。

Figure 3.  Changes of soluble phosphate content in culture liquid of strain CHW10B cultivated under different carbon sources

图 4表明：不同氮源条件下，CHW10B菌株溶磷能力差异显著；以(NH₄)₂SO₄为氮源时，CHW10B菌株的溶磷能力最强，溶磷量为738.372 mg·L^-1；以NH₄NO₃为氮源时，该菌株的溶磷能力比以(NH₄)₂SO₄为氮源时略低(溶磷量为720.504 mg·L^-1)，但二者差异不显著。以牛肉膏、酵母膏和蛋白胨为氮源时，该菌株的溶磷能力明显下降，而以KNO₃为氮源时，该菌株的溶磷能力最弱(溶磷量为179.201 mg·L^-1)。说明该菌株以NH₄⁺为氮源时的溶磷能力明显比以NO₃^-为氮源时的强，NH₄⁺适合该菌株溶磷能力的充分发挥。因此，CHW10B菌株溶磷作用最适氮源为(NH₄)₂SO₄，在实践应用中与(NH₄)₂SO₄没有显著差异的NH₄NO₃也可以考虑。

Figure 4.  Changes of soluble phosphate content in culture liquid of strain CHW10B cultivated under different nitrogen sources

以最适碳源(葡萄糖)和最适氮源(硫酸铵)分别作为碳源和氮源，比较不同C/N对CHW10B菌株溶磷能力的影响。图 5表明：不同C/N对CHW10B菌株的溶磷能力影响显著；C/N≤100/1时，C/N越大，CHW10B菌株的溶磷能力越强；C/N＞100/1，随着C/N升高，该菌株的溶磷能力反而减弱。C/N为25/1时，该菌株的溶磷量最低(318.542 mg·L^-1)，C/N为100/1时，该菌株的溶磷量最高(684.108 mg·L^-1)，此时溶磷能力最强。

Figure 5.  Changes of soluble phosphate content in culture liquid of strain CHW10B cultivated under different C/N

图 6表明：随着pH值的升高，CHW10B菌株的溶磷能力表现为先增长后降低；当初始pH值为10时，该菌株的溶磷能力最差，但可溶性磷含量仍达521.318 mg·L^-1；初始pH值为7时，该菌株的溶磷能力最强(727.713 mg·L^-1)。以上结果表明，CHW10B菌株对不同的pH值具有较强的适应能力，但中性条件最利于其溶磷功能的发挥，这也暗示了该菌株可以应用于多种不同酸碱性土壤中。

Figure 6.  Changes of soluble phosphate content in culture liquid of strain CHW10B cultivated under different initial pH

溶氧量对微生物的生长有重要作用，不同微生物对溶解氧需求也不同。装液量是影响溶氧量的一个重要因素，装液量越少，溶氧系数越大，溶氧量越多。图 7表明：CHW10B菌株在不同装液量下均有一定的溶磷能力，但溶磷能力的强弱不同：装液量400 mL· L^-1(2/5)和800 mL·L^-1(4/5)时，CHW10B菌株的溶磷能力差异不显著；装液量600 mL·L^-1(3/5)时，CHW10B菌株的溶磷能力最差；装液量500 mL·L^-1(1/2)时，CHW10B菌株的溶磷能力最强，溶磷量高达750.001 mg·L^-1。由此可知，装液量500 mL·L^-1(1/2)为本研究条件下CHW10B菌株溶磷的最适装液量。

Figure 7.  Changes of soluble phosphate content in culture liquid of strain CHW10B cultivated under different liquid volume in flask

图 8表明：CHW10B菌株在NaCl浓度为0.0~20.0 g·L^-1内均能生长，但溶磷能力不同，且差异显著(P＜0.05)，NaCl浓度越高，其溶磷量反而越低。当NaCl浓度为0.0 g·L^-1时，CHW10B菌株的溶磷能力最强，发酵液中可溶性磷含量为736.434 mg·L^-1；NaCl为20.0 g·L^-1时，该菌株几乎不表现溶磷功能。可能由于高浓度Na⁺造成的高渗溶液中微生物体细胞活动受抑制甚至死亡，进而影响到该菌株的溶磷能力。

Figure 8.  Changes of soluble phosphate content in culture liquid of strain CHW10B cultivated under different concentration of Nacl

图 9表明：CHW10B菌株培养液在20~40℃下均有一定的溶磷能力，但差异显著(P＜0.05)。该菌株培养液的溶磷能力由大至小的温度为：30、35、25、40、20℃，其最高溶磷量为749.576 mg·L^-1，最低溶磷量为287.462 mg·L^-1。温度低于30℃时，随着温度的升高，CHW10B菌株的溶磷量增加；当温度超过30℃后，其溶磷量随着温度的增加反而降低。可能是因为30℃时CHW10B菌株的生长发育和新陈代谢皆处于较好状态，相关的酶活性较强，而温度的升高或降低，都会影响到该菌株的生长繁殖和新陈代谢，使其溶磷能力降低。因此，该菌株溶磷最适温度为30℃。

Figure 9.  Changes of soluble phosphate content in culture liquid of strain CHW10B cultivated under different temperature

表 1表明：CHW10B菌株发酵液产生有机酸，且有机酸总量为5 710.82 μg·L^-1，比对照组的665.05 μg·L^-1 高758.70%。CHW10B菌株分泌的有机酸为草酸和葡萄糖酸，与对照相比，虽然少了甲酸和柠檬酸，但其葡萄糖酸的产生量远大于对照，分泌草酸的量与CK的相差不大。葡萄糖酸一方面能降低pH值从而溶解难溶性磷，另一方面还能与Al³⁺等螯合释放磷酸根^[17]。由此可见，CHW10B菌株发酵液良好的分泌葡萄糖酸的能力促进了其高效溶磷作用。

经测定，CHW10B菌株可以产生吲哚乙酸(IAA)和ACC脱氨酶，产IAA量为8.908 mg·mL^-1，其ACC脱氨酶比活力为0.922 U·mg^-1。采用CAS平板对CHW10B菌株进行产铁载体定性测定，结果表明：CHW10B菌株能产生铁载体(图 10)。图 11表明：该菌株还具有产精氨酸脱羧酶的能力。以上结果说明，CHW10B菌株具有多种植物促生特性。

Figure 10.  Siderophore production of strain CHW10B on CAS agar plates

Figure 11.  Qualitative determination results of strain CHW10B on producing Arginine decarboxylase

南方红豆杉1年生实生苗接种CHW10B菌株后360 d的生长情况(表 2)表明：接种CHW10B菌剂对南方红豆杉生长具促进作用，与对照相比，南方红豆杉实生苗地径、苗高和生物量的增长率分别为19.53%、20.14%和25.39%。CHW10B菌株对南方红豆杉实生苗生物量和苗高的促生作用达极显著(P＜0.01)，而对地径的促生作用达显著(P＜0.05)。

不同溶磷微生物的溶磷能力有差异，如王舒等^{[3, 7]}从油茶根际分离到的耳假单胞菌WB38等5株溶磷细菌发酵液中有效磷含量为401.56~475.01 mg·L^-1，而阿氏芽孢杆菌NC285则高达794.78 mg·L^-1；王俊娟等^[18]从油松根际分离到的泛菌属溶磷菌D2发酵液有效磷含量最高为392.13 mg·L^-1；张希涛等^[1]从厚荚相思树根际分离的相思根瘤菌G7-3无机磷发酵液有效磷含量为4.142 mg·L^-1。本研究中，从南方红豆杉根际分离得到的草木樨中华根瘤菌CHW10B，其基本培养基发酵液中可溶磷量最高可达757.752 mg·L^-1。以上菌株皆为溶无机磷细菌，草木樨中华根瘤菌CHW10B溶磷能力虽比阿氏芽孢杆菌NC285稍弱，但比其他菌株强很多，为高效溶磷菌。

溶磷微生物的溶磷作用并非一成不变，随着外界环境或营养物质的变化，其溶磷效果也发生改变^[19]。许多研究表明，碳是影响溶磷菌生长繁殖和生理生化代谢包括溶磷作用等的最主要因素，不同溶磷菌株的最佳碳源及利用碳源的广泛性存在明显区别，如节杆菌1TCRi7只有以葡萄糖为碳源时才具有溶磷能力^[20]；而洋葱伯克霍尔德氏菌C5-A^[17]、耳假单胞菌WB38^[7]、泛菌属溶磷菌D2^[18]、荧光假单胞菌JW-JS1^[21]和本研究中的草木樨中华根瘤菌CHW10B溶磷碳源较广，以葡萄糖、麦芽糖、蔗糖等分别作为碳源时皆具有溶磷能力；在后4株菌中，除洋葱伯克霍尔德氏菌C5-A以麦芽糖为碳源时溶磷作用最强外，其余均以葡萄糖为碳源时溶磷能力最强。草木樨中华根瘤菌CHW10B溶磷最佳碳源为葡萄糖也可能与其溶磷过程中产生大量的葡萄糖酸有关^{[19, 22]}。

不同溶磷微生物对不同氮源利用效率也不尽相同。本研究中，草木樨中华根瘤菌CHW10B以NH₄⁺ 为氮源时的溶磷能力明显比以NO₃^- 为氮源时的强，以硫酸铵为氮源时溶磷能力最强，以硝酸铵为氮源时溶磷能力次之，而以硝酸钾为氮源时的溶磷能力明显降低，这与耳假单胞菌WB38^[7]溶磷氮源情况相似，不同的是后者以硝酸铵为氮源时溶磷能力最强，硫酸铵次之。本研究结果与赵小蓉等^[20]和范丙全等^[23]发现的溶磷菌通常以NO₃^- 为氮源时的溶磷量高于以NH₄⁺ 为氮源时的溶磷量相反。另外，范丙全等^[23]认为，使用铵态氮时主要分泌苹果酸、柠檬酸、乙酸、琥珀酸、丙酸，而硝态氮条件下几乎不产生这些有机酸。本研究中，CHW10B菌株以(NH₄)₂SO₄为氮源时产生大量的葡萄糖酸，并没有产生其他有机酸，其具体原因有待进一步研究。

有研究表明，适当调整C/N值，溶磷微生物可能会释放更多磷^[21]，不同菌株对培养基中C/N值反应差异显著。本研究发现，当C/N＜100/1时，随培养基的C/N值升高，草木樨中华根瘤菌CHW10B的溶磷能力逐渐增强；当C/N=100/1时，草木樨中华根瘤菌CHW10B菌株溶磷能力最强，这与刘辉等^[21]关于荧光假单胞菌JW-JS1菌株和赵小蓉等^[20]关于欧文氏杆菌的研究结果相同；当C/N＞100/1时，CHW10B菌株的溶磷能力逐渐减弱，与青霉和肠杆菌的结果^[20]不一致，可能是因为不同菌株自身所适宜的C/N有所不同。

本研究中的草木樨中华根瘤菌CHW10B是分离自南方红豆杉根际的高效溶磷菌株，具有在南方红豆杉根际发展成优势种群的前提，该菌株除产生葡萄糖酸具有较强溶磷能力外，还可产ACC脱氨酶、IAA、铁载体和精氨酸脱羧酶，具有多种植物促生特性。将该菌株制成菌剂作用于1年生南方红豆杉实生苗后，具有良好的促生效应。在本课题组的前期研究中，CHW10B对60 d南方红豆杉幼苗生长也表现出明显的促生作用。可以看出，该菌株有望被制成生物肥料，应用于南方红豆杉等的人工栽培，具有较高的应用潜力。若将该菌株更好应用于农林业生产中，还需进一步结合实践中土壤和周围环境的实际情况，进行深入验证。

碳源、氮源、碳氮比和温度等环境条件均对CHW10B菌株的溶磷能力有一定的影响，以葡萄糖为碳源，硫酸铵为氮源，且碳氮比为100/1时，该菌株的溶磷能力最强。该菌株溶磷能力最强的其他环境条件分别为培养时间4 d、磷酸钙5.00 g·L^-1、初始pH值7.0、装液量1/2、NaCl为0.0 g·L^-1、温度30℃。将该菌株接种于1年生南方红豆杉根部360 d后，发现其对南方红豆杉有明显的促生作用。经检测，该菌株除产生大量葡萄糖酸外，还产生可促进植物生长的IAA、ACC脱氨酶、嗜铁素和精氨酸脱羧酶。鉴于该菌株对南方红豆杉良好的促生作用，结合其溶磷特性，可将该菌株应用于南方红豆杉的种植。