The Physiological Age of Asexual Plants——Thinking Arise from Telomere Length

研究发现同一植株不同器官的端粒长度有所不同^{[3, 9, 17]}，那么对于叶片细胞中端粒较短的植株。如果选用叶片作为外植体，叶片再分化产生的愈伤组织再分化产生植株的端粒长度与同等大小的实生苗相比会不会有所变化？愈伤组织可能的高端粒酶活性能在一定程度上使端粒的长度有所恢复甚至变得更长^[17-19]，那么以叶片为外植体的不经过愈伤的直接器官或直接体细胞胚胎发生植株的端粒长度又会如何呢？如果叶片产生植株端粒长度比相应的实生苗短，是否证明叶片无性植株的生理年龄老于实生苗？本课题组先前的研究发现以大花君子兰叶片作为外植体，通过直接器官发生路径产生的植株存在生长异常缓慢的现象。这很可能是因为叶片直接发生植株的端粒长度较短、实际生理年龄较老。如果用于无性繁殖的外植体或插条取自百年老树，“小老头”无性系，即表现为“三岁之躯，百岁之身”的无性系，是否真的存在？如果存在，那么这种无性繁殖植株会成为典型“小老头树”且寿命会短于实生苗。

研究发现从生理年龄较老的器官或组织取外植体进行无性繁殖，其后代往往存在早衰或优势衰退甚至丧失等现象，但是从接近根际部位或生理年龄较小的器官或组织取外植体获得无性系较容易保持母株优良性状，无性系苗木生长健壮、生机盎然^[31]。由于一般树木接近根际部位的茎干形成层的端粒长度较长^{[3, 13]}。所以推测较长的端粒赋予植物更佳的无性繁殖表现。这也证明由端粒长度预测细胞增殖能力和无性繁殖表现的可行性。然而，经过愈伤阶段的间接器官/体细胞胚胎发生可能会是特例。因为已有研究证明合适的离体培养条件会使愈伤细胞的端粒长度延长至大于外植体细胞端粒的长度^[17-19]。愈伤组织特有的端粒延长机制，恰恰解释了为什么植物的分化外植体能够返老还童式地再生出大量看似幼嫩的植株。

豆科固氮速生丰产树种马占相思(Acacia mangium Willd.)的叶子具备二型性^[32]。幼龄植株首先产生小叶数不同的复叶，然后产生中间过渡类型的叶状柄，之后产生的为完全叶状柄。完全叶状柄被认为是马占相思植株成熟的标志，而复叶被认为是马占相思幼龄的标志^[32-33]。研究发现取自幼龄马占相思植株的茎外植体产生的幼龄形态的试管苗比例明显高于成龄植株外植体产生的试管苗；成龄茎外植体也可产生幼龄形态试管苗，但其产生试管苗多数具备成龄形态的叶状柄^[32]。可能因为具备成龄特征试管苗的生理年龄大于具备幼龄特征的试管苗和实生苗的生理年龄。推测成龄茎外植体的叶腋分生组织端粒长度可能短于幼龄外植体，从而致使老龄外植体产生的试管苗多数具备成龄树的特征——叶状柄。因此，可以认为具备成龄形态叶状柄的马占相思试管苗生理年龄较老，为“三岁之躯，百岁之身”的典范。比较研究马占相思幼龄特征试管苗和成龄特征试管苗的寿命、端粒长度以及两种叶子和外植体的端粒长度是很有必要的。

老树树干形成层端粒越往上越短^{[3, 13]}，越接近树干基部的枝条扦插通常越容易生根^[34]。那么是否可以认为树干较上位置的侧枝扦插得到的植株的生理年龄较老？推测这类扦插繁殖植株的生理年龄大于同等大小的实生苗。以上证据仍然支持“三岁之躯，百岁之身”。

总之，生理年龄较老的植物材料作为无性繁殖的供体，不经过愈伤组织阶段产生的无性系的生理年龄可能远远大于同等大小的实生苗。尽管这类无性繁殖植株在初期看上去也是“娇小”如童，但是从生理上来讲它们可能已算“百岁老人”！

Liang等人建立了人参年龄和端粒长度相关的数学模型。根据此模型，可由人参主根上部的端粒长度预测人参年龄^[9]。那么是否可以由端粒长度预测植物材料的无性繁殖能力呢？报道显示欧洲赤松和白桦树干下端形成层端粒长度长^{[3, 13]}；树干下端枝用做插穗生根率相对较高^[34]；越老的组织用于做外植体，离体再生能力越弱^[28]；很多植物的端粒长度随年龄和发育的进行而变化^{[4, 9]}。以上发现证明端粒长度可以反映植物/细胞的生理年龄，而植物材料/细胞的生理年龄又可以决定其无性繁殖能力。所以推测植物材料/细胞的端粒长度很可能成为预测其无性繁殖能力的有效新指标。

研究发现大麦的端粒随着分化而逐渐缩短，但是在大麦愈伤组织培养初期端粒缩短，之后又逐渐延长^[18]。此外，几乎所有植物的愈伤组织都要在培养一段时间之后才能分化^{[26, 29]}。这证明愈伤组织端粒长度很可能是愈伤再分化的限制因子之一。合适的愈伤培养时间使细胞有足够的机会延长端粒、降低生理年龄，进而为再分化做好准备。因此在具体实验过程中，应该选用端粒较长的愈伤组织用于诱导出芽。如果以上推论成立，愈伤端粒长度也将成为评判愈伤再分化能力的有效新指标。

研究发现可可再生植株叶片的甲基化状态处于外植体供体植株叶片和雄蕊(外植体)之间。随着愈伤组织培养时间的延长，愈伤再生植株叶片的甲基化状态和SSR标记逐渐接近供体植株叶片^[35]。即短期培养愈伤给出的无性植株的体细胞无性系变异频率高，长期培养愈伤给出的植株的体细胞无性系变异频率反而低。有报道显示在端粒长度与生理年龄负相关的大麦愈伤组织培养初期端粒长度变短，而后随着培养时间的延长端粒又逐渐变长^[18]。如果以上关于端粒长度和体细胞无性系变异的两项研究发现在植物界较具普遍性，则证明较长端粒对应较低的体细胞无性系变异频率、较短端粒对应较高的体细胞无性系变异频率。因为一般的DNA修复系统对端粒序列是无效的，所以端粒缩短也是总体DNA损伤积累的感受器^[36]。故推测愈伤组织培养初期的端粒缩短恰恰是DNA损伤和体细胞无性系变异积累的体现，而愈伤组织培养后期则相反。从这个角度来讲，愈伤端粒长度的动态变化和愈伤产生植株的体细胞无性系变异情况是相吻合的。虽然前人和课题组前期研究证明植株再生不需要完全精准地模仿植物发育过程^[29]，但是以上研究发现证明已经分化的外植体细胞需要足够的时间和细胞分裂次数来尽可能清除以前细胞状态下的“痕迹”(包括端粒长度和甲基化状态)。一定的愈伤培养周期提供了逐步抹除“痕迹”的机会。所以随着愈伤培养时间的延长，痕迹清除越来越彻底，产生的植株也就可能越“保真”了。综上所述，在进行组织培养实验时，应该选择脱分化彻底的、外植体“痕迹”尽可能少的愈伤组织来诱导芽丛或体细胞胚。

植物和动物一样，也会成熟和衰老^[36]。但是植物和动物又不同——衰老植物会返老还童，比如老树会通过嫁接复幼^[37]。复幼的老树不仅能恢复幼年期的生长势、外表形态、生理生化状态和细胞调控机制等，而且扦插生根能力也能完全恢复^[38]。可见复幼老树的生理年龄大大降低，那么复幼老树的端粒长度是否也恢复到幼龄时的状态呢？复幼老树的生理年龄具体又该如何计算呢？如果科学研究确实能够证明复幼老树端粒也恢复到幼龄状态，那么进一步研究比较老树接穗与幼树砧木的端粒长度以及复幼老树的端粒恢复机制，将是很有意思的研究课题。

目前关于植物端粒长度和年龄相关的研究报道仍然很有限^{[9, 36]}。很多植物物种，尤其是多年生林木的无性繁殖植株的端粒长度及寿命有待研究。外植体的端粒长度是否可以用于预测再生能力，愈伤组织的端粒长度是否可以预测再分化能力，何时诱导愈伤组织再分化更合适？什么样的愈伤细胞才能成为再分化的感受态细胞？嫁接诱导老树复幼是否与端粒长度的变化有关？组培再生植株的幼龄化表型是否与端粒的长度有关？这些都是亟需研究和解决的科学问题。例如，仅仅对于用叶片作为外植体的离体快速繁殖，就有很多内容是值得研究的(表 3)。尤其对于叶片端粒长度与植株其它部位存在明显差异的物种。我们坚信随着高通量测序等实验技术手段的不断进步，这些问题在不久的将来都将被揭晓。