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白蜡虫(Ericerus pela Chavannes)是我国传统的资源昆虫,其2龄雄幼虫分泌的白蜡具有重要的经济价值,被广泛应用于医药、食品、航天等领域[1-2]。白蜡虫分布广泛,在我国其自然种群主要分布在18°N到42°N地区[3]。李健等在最冷月日均最低气温-18.0℃的吉林省四平市发现白蜡虫依然能够生长发育繁衍后代[4],说明白蜡虫对极端低温环境具有很强的适应能力。白蜡虫以雌成虫虫态越冬,对白蜡虫越冬过程中生理状态等方面的研究将有助于了解其低温适应机制,并对扩大白蜡产区具有参考意义。
共生微生物在昆虫生长发育、繁衍进化以及环境适应等方面具有重要作用。例如,在对美洲大蠊(Periplaneta Americana L.)内共生菌的研究中发现其共生菌中含有可抑制病原细菌生长的共生菌,并且存在着能够降解多糖的真菌[5]。研究发现豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum Harris)的共生菌布赫纳氏菌属(Buchnera)能够帮助其抵御极端温度[6]。研究表明共生真菌也具有抵御极端温度侵害的作用,如在对德州切叶蚁(Atta texana Buckley)进行研究时发现,其所携带的Attamyces共生菌株能够帮助切叶蚁抵御低温侵害提高适应性[7]。在对白蜡虫低温适应机制的研究中,发现长春和昆明越冬虫在代谢等方面存在很多差异[8-9],我们推测白蜡虫内共生微生物也可能在越冬以及抵御极端低温过程中具有重要作用。
本研究将对白蜡虫越冬虫态体内共生微生物进行16s rRNA和ITS基因高通量测序,研究白蜡虫越冬过程体内微生物多样性,并将昆明与长春越冬雌成虫体内微生物进行比较分析,以了解在极端低温条件下越冬雌成虫体内微生物种类及数量的变化,分析微生物和白蜡虫越冬及抗冻可能的相关性。
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细菌16S rRNA:KM内共检测到12 538条reads,CC内共检测到27 575条reads;真菌ITS:KM内共检测到14 483条reads,CC内共检测到21 650条reads。KM和CC两个样品细菌一共检测到344个OTU:包含KM 177个和CC 167个;真菌共有230个OTU:包含KM 168个和CC 62个。
KM和CC的细菌、真菌稀释曲线均趋于平坦(图 1:A,B),继续增加测序量将不会产生更多的OTU,说明数据量合理可以用于其他分析。同时,Shannon-Wiener曲线也均趋于平坦(图 1:C,D),进一步说明数据量足够大,可以反映样本中绝大部分微生物信息。
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基于Miseq测序结果,在细菌中共鉴定到15门28纲54目84科137属。
鉴定到的门水平中主要有:变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门,这4个门的总和在KM和CC中分别占98.29%和98.86%,是越冬雌成虫内细菌的主要成分,其中变形菌门在越冬雌成虫内细菌中占主要比例。将KM和CC中这4个门所占比例进行对比后发现,除了变形菌门从41.57%(KM)升高至72.25%(CC),其它3个门在CC中所占比例均下降(图 2: A)。
在KM中共鉴定到115个属细菌,其中乳球菌属(Lactococcus)占主要比例(29.78%),其次为假单胞菌属(Pseudomonas)占15.05%、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)占5.38%、薄层菌属(Hymenobacter)占5.31%。而在CC中共鉴定到125个属细菌,其中立克次氏体(Rickettsia)占主要比例(55.77%),其次为乳球菌属(Lactococcus)占17.96%、假单胞菌属(Pseudomonas)占8.09%。对比KM与CC发现,占主要比例的菌属发生了改变,KM中的大多数较高丰度的菌属在CC中所占比例较低(图 2: B),立克次氏体在KM中仅占0.03%。
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基于Miseq测序结果,在真菌中共鉴定到6门20纲35目46科83属。
鉴定到的门水平中主要有:子囊菌门、担子菌门,这2个门的总和在KM和CC中分别占90.42%和99.37%,其中子囊菌门在越冬雌成虫内真菌中占比最高,为78.45% (图 2: C)。
在KM中仅鉴定到41个属真菌,其中线虫草科无法归类的属(unclassified Ophiocordycipitaceae)占主要比例(31.06%),其次为微座孢属(Microstroma)占13.96%、红酵母属(Rhodotorula)占13.14%、茎点霉属(Phoma)占10.38%、横断孢属(Strelitziana)占8.45%、枝孢霉属(Cladosporium)占5.26%。而在CC中共鉴定到75个属真菌,其中线虫草科无法归类的属(unclassified Ophiocordycipitaceae)占主要比例(14.75%),其次为枝氯霉属(Ramichloridium)占15.76%、枝孢霉属(Cladosporium)占9.11%、茎点霉属(Phoma)占9.03%。对比KM与CC发现,线虫草科无法归类的属、微座孢属、红酵母属等菌属在CC所占比例低于KM,但CC中枝孢霉属所占比例高于KM,而且新鉴定到了诸如枝氯霉属等34个菌属(图 2:D)。
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在两细菌样本中,CC的Ace指数和Chao指数均稍高于KM,表明在CC细菌群落中其群落丰富度相对高于KM;CC的香农指数低于KM,而辛普森指数高于KM,表明其群落多样性相对低于KM,辛普森指数高于KM同时也反映了CC优势种的集中程度要高于KM(表 1)。
微生物
Microorganisms样本
SamplesAce指数
Ace indexChao指数
Chao index香农指数
Shannon index辛普森指数
Simpson index细菌
BacteriaKM 168 168 3.58 0.088 9 CC 178 178 2.05 0.341 2 真菌
FungiKM 69 74 2.39 0.152 8 CC 169 168 3.14 0.075 7 Table 1. Diversity of fungi and bacteria in KM and CC
在两真菌样品中,CC的Ace指数、Chao指数和香农指数均高于KM,表明在CC真菌群落中其群落丰富度以及多样性相对高于KM,而辛普森指数低于KM,说明CC优势种的集中程度要低于KM(表 1)。