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我国北方高寒沙区是土地沙漠化最严重的区域之一，该地区海拔高、气温低、气候干燥、降水量少、植被覆盖度低且类型单一，主要通过人工固沙、植树造林、涵养水源等措施来实现退化土地的植被恢复与重建[1-4]。作为高寒沙区重要的造林树种，国内研究主要集中于樟子松(Pinus sylvestris var. mongolica Litv.)、青海云杉(Picea crassifolia Kom.)等松科固沙植物的生物量、碳储量、碳稳定同位素组成、生理性状对干旱盐碱胁迫的响应、树木年轮气候学、种子幼苗生理特性等[5-10]。辽宁省固沙造林研究所于2014年筛选审定的新品种沙地赤松(Pinus densiflora Sieb. et Zucc.)辽宁省生长状况良好，然而该植物种子在其他地区的萌发期适应性研究未见报道。本研究拟选用不同浓度的PEG-6000溶液模拟干旱胁迫环境，对3种松科造林树种沙地赤松、樟子松和青海云杉的种子萌发特性和对干旱胁迫的响应进行对比研究，以期为沙地赤松在青海的引种试种提供理论参考。
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沙地赤松种子来自辽宁省固沙造林研究所，樟子松和青海云杉种子采自青海省治沙试验林场(99°45′~100°30′E，36°03′~36°40′N，海拔2 871 m)。PEG-6000由国药集团化学试剂有限公司生产，分析纯。
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2016年12月18日在中国林业科学研究院荒漠化所实验室开始实验。在清水中剔除空粒、烂粒、虫蚀粒和杂质，用0.5%的高锰酸钾溶液浸泡种子0.5 h后，用蒸馏水漂洗，在通风处自然阴干至安全含水量后备用。试验前用TTC法[11]测得供试种子生活力均在90%以上。
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采用不同浓度的PEG-6000溶液模拟干旱胁迫条件。PEG溶液设置5%、10%、15%、20%、25%、30%等6个浓度梯度，以蒸馏水(CK)处理为对照。
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用直径11 cm培养皿垫双层湿润滤纸作为发芽床萌发的方法进行萌发试验，将消毒过的植物种子分别放入7组含有等量试剂(15 mL)发芽床中，每组重复操作3次，每个重复组需测试50粒种子。萌发试验在MGC-250光照培养箱内进行，置于(25±0.5)℃恒温光照培养，光照周期12 h/12 h(光照/黑暗)，相对湿度为60%。试验过程中，采用质量平衡法每天向培养皿中补充蒸发失去的水分，为了减少发芽床水势变动，每2 d更换1次滤纸，并及时清理发霉腐烂的种子，以防感染其他种子。从种子放入发芽床之日起观察，以胚根突破种皮作为萌发标准，以3个重复组中出现1粒以上萌发种子的时间节点作为相应处理条件下的种子发芽始期，每天定时观察记录发芽种子数量，以连续4 d不再有种子萌发为发芽结束期。统计种子萌发率，并从每个培养皿中测定所有幼苗初生根长度以及全部幼苗鲜质量。
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式中：Gt为时间t日的萌发数，Dt为相应的萌发天数。
式中：GI为萌发指数，S为幼苗鲜质量。
式中：干旱胁迫下种子萌发指数=(1.00)Rd2+(0.75)Rd4+(0.5)Rd6+(0.25)Rd8，Rd2、Rd4、Rd6、Rd8分别为第2、4、6、8天的种子萌发率，1.00、0.75、0.50、0.25分别为相应萌发天数所赋予的抗旱系数。
各相对指标均为干旱胁迫处理与对照组所得参数的比值。
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用模糊数学隶属法对种子萌发期的耐水分胁迫能力进行综合评价[16]。利用下列公式进行标准化处理：
式中，Xj表示第j个指标值，Xmin表示第j个指标的最小值，Xmax表示第j个指标的最大值；如某一个指标与抗性为负相关，则用公式：
按公式(8)计算标准差系数Vj，按照公式(9)计算权重系数Wj；按公式(10-12)计算隶属函数值(D)。D值越大，表示抗旱性越强。
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本研究应用Excel、Origin 8.5和SPSS 19.0软件进行数据统计分析。
1.1. 种子来源
1.2. 试验方法
1.2.1. 种子处理
1.2.2. 模拟干旱胁迫条件
1.2.3. 萌发试验
1.3. 计算方法
1.4. 抗旱性综合评价方法
1.5. 统计分析
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图 1所示：沙地赤松初始萌发天数最长(15 d)，青海云杉最短(12 d)。不同的PEG胁迫条件下，种子的逐日萌发率变化规律不一致。图 2中，沙地赤松种子的总萌发率最高(83.33%)，青海云杉次之(70.67%)，樟子松最低(55.33%)。随PEG干旱胁迫的加剧，沙地赤松总萌发率在5%和10%PEG胁迫下与对照组的差异不显著(P>0.05)，樟子松种子总萌发率先上升后下降，而青海云杉呈持续下降趋势。当PEG胁迫浓度为25%和30%时，3种植物种子均不萌发，由此表明PEG25%是萌发极限阀值浓度；20%PEG浓度处理下，青海云杉、沙地赤松和樟子松种子萌发率分别比对照组下降了92%、69%和67%，后二者差异不显著(P>0.05)；5%与10%PEG浓度处理时，沙地赤松和樟子松种子的萌发率均高于对照组，青海云杉略低于对照组。整体上看，随干旱胁迫的加剧，3种植物种子的萌发率逐渐降低。种子的萌发率受其自身特性的影响较大，种子的相对萌发率越大，植物抗旱性越强[17]。从图 2可知：樟子松种子的相对萌发率最高，沙地赤松次之，青海云杉最低。
Figure 1. Effect of PEG stress on seed daily germination rates(DGR) of three Pinaceae plants
Figure 2. Effect of PEG stress on the total seed germination rates and relative germination rates of three Pinaceae plants
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植物根系越发达，其抗旱能力越强。由图 3可知：随PEG干旱胁迫浓度的增加，种子胚根长度均呈先上升后下降的趋势。樟子松、青海云杉和沙地赤松的PEG临界浓度(胚根生长至最大值)为5%、5%和10%。PEG浓度为25%时，3种松科植物胚根长度均下降至零，即达到或超过该PEG浓度，植物将无法正常萌发。
Figure 3. Effect of PEG stress on seed radicle length of three Pinaceae plants
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由图 4可知：随PEG浓度的增加，沙地赤松和樟子松幼苗鲜质量呈先上升后下降的趋势，在干旱胁迫条件下，沙地赤松在PEG浓度为10%时，鲜质量最大为0.032 g，樟子松在PEG浓度为5%时，鲜质量最大为0.023 g，而青海云杉幼苗鲜质量缓慢下降，在空白对照时幼苗鲜质量最大为0.019 g。此外，PEG干旱胁迫对樟子松相对幼苗鲜质量的影响最大。
Figure 4. Effect of PEG stress on seeding fresh weights of three Pinaceae plants
萌发活力指数用以表征不同植物种子间抗旱性的强弱。方差分析结果表明：不同松科植物种子间的萌发活力指数差异显著(P < 0.05)。图 5所示：3种松科植物在25%、30%PEG浓度下活力指数均为零；沙地赤松在15%和20%PEG处理下，活力指数分别比对照下降了46%和86%；樟子松在5%PEG处理下，活力指数比对照升高了60%，在20%PEG处理下，活力指数为对照组的10%；青海云杉活力指数在5%、10%、15%、20%分别比对照下降了18%、45%、73%、95%。在20% PEG胁迫下，沙地赤松的活力指数较其他2种植物的高。
Figure 5. Effect of PEG stress on vigor indexes(VI) of three Pinaceae plants
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通过方差分析，不同松科植物种子间的萌发胁迫指数和萌发抗旱指数差异显著(P < 0.05)。由图 6可知：沙地赤松和樟子松萌发胁迫指数均呈先上升后下降的趋势。在5%和10%浓度PEG溶液处理下，樟子松种子萌发胁迫指数有明显上升趋势；在5%PEG溶液处理下，沙地赤松种子萌发胁迫指数虽有上升趋势，但与对照组差异不显著(P>0.05)；随PEG胁迫的加剧，青海云杉种子萌发胁迫指数平缓下降。沙地赤松、樟子松和青海云杉萌发胁迫指数最大值分别出现在10%、5%、0%(CK)PEG溶液处理条件下。在20%PEG溶液处理下，沙地赤松、樟子松和青海云杉种子萌发胁迫指数分别比对照组下降了75%、69%、94%。
Figure 6. Effect of PEG stress on germination stress index(GSI) of three Pinaceae plants
由图 7可知：沙地赤松和樟子松种子萌发抗旱指数均先上升后下降，而青海云杉呈平缓下降趋势。沙地赤松、樟子松和青海云杉种子萌发抗旱指数最大值为1.83，1.67和1.00，且分别分别出现在5%、5%、0%(CK)PEG溶液处理条件下。在20%PEG浓度处理下，沙地赤松和樟子松种子萌发抗旱指数较对照组分别下降了82%和83%。
Figure 7. Effect of PEG stress on germination drought tolerance index(GDRI) of three Pinaceae plants
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表 1所示：沙地赤松、樟子松和青海云杉的耐水分胁迫能力综合评价值分别为2.95、2.74和1.71。
植物
Plants相对发芽率
RGR相对胚根长
RERL萌发胁迫指数
GSI萌发抗旱指数
GDRI萌发活力指数
VI综合评价值
CEV排序
Scequencing沙地赤松Pinus densiflora 0.57 0.10 0.60 0.91 0.77 2.95 1 樟子松Pinus sylvestris var. mongolica 0.57 0.07 0.51 0.72 0.88 2.74 2 青海云杉Picea crassifolia. 0.40 0.10 0.31 0.25 0.66 1.71 3 Table 1. Subordinate function and comprehensive evaluation value of three Pinus plants under PEG stress
2.1. PEG-6000干旱胁迫对3种松科植物种子萌发率的影响
2.2. PEG-6000干旱胁迫对3种松科植物种子胚根的影响
2.3. PEG-6000干旱胁迫对3种松科植物幼苗鲜质量和活力指数的影响
2.4. PEG-6000干旱胁迫对3种松科植物萌发胁迫指数和萌发抗旱指数的影响
2.5. PEG-6000干旱胁迫对3种松科植物种子萌发期耐水分胁迫能力综合评价
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研究结果表明，随PEG胁迫程度的加剧，沙地赤松和樟子松种子的总萌发率、相对萌发率、幼苗鲜重、胚根长、胁迫指数和抗旱指数呈先上升后下降的趋势，青海云杉的相应指标平缓下降。植物的抗旱性是由遗传因子和环境共同控制的，单纯用1个抗旱指标无法准确定义植物的抗旱性问题，因此需进行多指标综合评价。采用隶属函数值平均法，既消除了个别指标带来的片面性，又由于平均值是[0, 1]上的纯数，使各植物种子的抗旱性差异具有可比性、可行性和可靠性[18]。综合来看，沙地赤松和樟子松对外界干旱胁迫的适应能力较青海云杉更强。在5%和10%低浓度PEG处理下，沙地赤松和樟子松逐日萌发率和胚根长度均比对照有所升高，而青海云杉的种子萌发率有轻微的下降，这表明低浓度PEG溶液(5%、10%)有助于3种松科植物种子的萌发，提高种子相对萌发率和胚根长度，这与其他学者的相关研究结果一致[19-22]。在轻度干旱胁迫下，植物根系对土壤水分的减少最敏感，产生干旱胁迫信号向上传导至叶片使得其调节气孔开度以减少水分散失从而增强对环境的适应性，同时胚根的伸长有利于从不同的土层深度获得更多水分，这是植物适应缺水环境的一种生态适应表现。这种轻微的逆境胁迫能够激发植物种子自身保护机制，减少种子萌发过程中膜系统的损伤，进而提高其体内抗氧化物酶活性和可溶性蛋白含量，增强植物抗旱性，提高植物种子的发芽率[23]。
本研究采用模糊隶属函数法对3种松科种子进行6项萌发指标的评价分析。结果表明，随PEG浓度的增加，种子萌发受到不同程度的抑制，且3种松科植物对PEG胁迫的敏感浓度不同。这与于军等[24]对矮沙冬青(Ammopiptanthus nanus (M.Pop.) Cheng f.)种子及李志萍[25]对栓皮栎(Quercus variabilis Bl.)种子的研究规律一致。当胁迫超过一定程度后，胚根生长受到抑制，可能是由于植物萌发率低且萌发慢的行为能保护植物幼苗在干旱缺水的环境中生存，这对于其物种的生存具有重要意义[26]。综合评价结果表明，这3种松科植物耐水分胁迫的能力为沙地赤松>樟子松>青海云杉。
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低浓度PEG溶液(5%10%)有助于提高3种松科植物种子萌发率和胚根长度；随PEG浓度增加(15%、20%、25%、30%)，种子萌发受到不同程度的抑制；
耐水分胁迫的综合能力为沙地赤松>樟子松>青海云杉。沙地赤松有较强的抗旱耐旱能力，适用于干旱半干旱地区的植被恢复与重建。
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