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花榈木(Ormosia henryi Prain)是蝶形花科红豆树属,国家二级保护植物[1],是制作高档家具的珍贵用材树种,其树形优美,近年来被用作优良的园林绿化树种,发展潜力巨大[2],孟宪帅等研究认为,花榈木幼苗生长对水分需求高,耐旱性较差[3]。随着气候变化,湿润地区也经常呈现季节性干旱,需要选择抗旱苗木造林,因此,培育抗旱性较强的花榈木苗木十分必要。有研究表明,豆科树种与根瘤菌共生固氮除了能够提高植物的固氮量外,也能提高植物的抗逆性[4-9]。因此,人工接种优良根瘤菌,是提高苗木抗旱性的重要途径之一。本研究拟通过对花榈木幼苗接种不同根瘤菌株,采用盆栽法人工模拟自然持续干旱,以探讨花榈木幼苗接种不同根瘤菌株后对中度干旱胁迫的生理生态响应,以期筛选出促进花榈木幼苗抗旱的优良菌株,为发掘优良的根瘤菌种质资源,提高花榈木苗木抗旱性提供理论依据和技术指导。
HTML
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花榈木种子采自贵州省石阡县同一株母树,千粒质量为(390.6±0.4) g,净度为94.6%。供试菌株是从贵州、浙江、安徽、福建、江西等省采集的花榈木根瘤中分离,经加有刚果红的YMA平板划线,28℃恒温培养,并通过16S rDNA序列分析及回接验证的23株纯化菌株(见表 1)。
编号
Number采集地
Collecting location近源菌
Closely related相似性
Similarity/%登录号
Accession number1 贵州关岭 Rhizobium rosettiformans W3 93 KR921482.1 2 贵州荔波 Rhizobium sp. SCAUS07 99 KF836032.1 3 贵州荔波 Rhizobium sp. S41 100 CP016433.1 4 贵州平塘 Rhizobium sp. YE2-4 98 KT992333.1 5 贵州罗甸 R. nepotum MLS-6-6 99 KT997460.1 6 贵州凯里 R. tropici CAF336 95 EU399925.1 7 贵州石阡 Rhizobium sp. L120T 99 KM894194.1 8 贵州石阡 R. pusense BJ 99 KF297587.1 9 贵州石阡 Rhizobium sp. JCM 28644 99 LC133675.1 10 贵州麻江 R. nepotum Rrad-006 99 KX260959.1 11 贵州麻江 R. lusitanum P3-13 99 HQ830495.1 12 贵州孟关 R. tropici SY61 99 KP687381.1 13 贵州黎平 Rhizobium sp. RITF 1462 98 JQ697681.1 14 贵州黎平 Rhizobium sp. CCBAU 83718 99 EU145992.1 15 贵州天柱 R. lusitanum, R-51027 99 LN995682.1 16 浙江临安 R. lusitanum P3-13 98 HQ830495.1 17 浙江临安 Rhizobium sp. JCM 28634 99 LC133665.1 18 浙江永康 Rhizobium sp. L120T 99 KM894194.1 19 浙江永康 Rhizobium sp. LMB-1 99 KM891589.1 20 福建建瓯 R.multihospitium CCBAU 83375 99 EF035065.2 21 福建南平 R. lusitanum ITM L4111 99 KC568140.1 22 江西庐山 R. tropici B28 99 JX010975.1 23 江西庐山 R.pusense ZJY-286 79 KP282790.1 Table 1. Strains of verified by 16S rDNA sequence analysis
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选取饱满的花榈木种子,先用0.1%升汞溶液浸泡10 min进行表面消毒,然后浸泡于80℃的热水中,并让其自然冷却。种子吸胀后,置于无菌发芽盒中,在25℃培养箱内催芽。待芽苗长到1 cm,移植到60 cm×30 cm的塑料大盆中,每个大盆移植10株芽苗,共移植芽苗720株,置于塑料大棚中培养。大盆使用前用0.5%高锰酸钾溶液进行消毒。移植基质为经过120℃高温高压灭菌锅灭菌0.5 h的蛭石。
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将供试菌株在YMA斜面上活化后,接入YMA液体培养基中,28℃下摇床培养3 d至对数期,分光光度计检测菌液OD600值大于0.5时用于接种。待花榈木芽苗长出真叶后接种,接种菌株23个,采用根部浇灌方式接种,每种菌株接种3个重复,每重复接种10株花榈木幼苗。每株幼苗接种10 mL菌液。以不接种根瘤菌的处理作为对照(CK),对照苗浇灌等量的YMA液体培养基。接种后每隔15 d浇1次无氮营养液,不施加其他肥料,隔30 d追接1次根瘤菌菌液,直到苗木根部长出根瘤。
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花榈木接种苗培养3个月后(2016年7月1日)开始进行干旱胁迫试验。胁迫前用清水浇苗木至基质水分饱和,之后任其自然干旱,23 d后,待对照苗叶片出现萎蔫时停止胁迫,此时测得基质相对湿度为40.2%,根据GB/T20481-2006干旱等级划分为中度干旱等级。分别测定接种苗及对照苗的生理生化指标,每个处理重复取样3次。
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以相对电导率表示质膜相对透性,参照郝建军等[10]方法,丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定,可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定,脯氨酸含量采用茚三酮法测定,超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT法测定。
于晴天上午9:00—11:00,对每个处理分别选取3片功能叶片,用LI-6400便携式光合仪测定光合速率、蒸腾速率等指标。
叶片经充分暗适应后,使用Junior-PAM叶绿素荧光仪测定叶绿素荧光参数,主要包括最大光化学量子产量(Fv/Fm)、PSⅡ潜在活性(Fv/F0)、实际光合量子产量[Y(Ⅱ)]、光化学淬灭(QP)和非光化学淬灭(NPQ)。
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试验数据使用Microsoft Excel 2010和SPSS 22.0统计分析软件进行分析处理。采用Duncan法进行多重比较。利用隶属函数法对各参试菌株处理苗木进行综合评价[11],筛选抗旱的菌株。
水分利用效率=净光合速率/蒸腾速率
1.1. 试验材料
1.2. 研究方法
1.2.1. 无菌苗培育
1.2.2. 花榈木接种根瘤菌
1.2.3. 干旱胁迫处理
1.3. 生理生化指标的测定
1.4. 数据统计与分析
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在中度干旱胁迫下,接种不同根瘤菌菌株的花榈木幼苗质膜相对透性差异显著(P<0.05)(图 1),均显著低于CK,其中,接种10号菌株的花榈木质膜相对透性最低,比CK低73.9%,其次为9号菌株,比CK低70.3%,多重比较显示2个处理间差异不显著(P>0.05)。除CK外,接种22号菌株花榈木质膜相对透性最高,且与其他处理差异显著(P<0.05),仅比CK低29.4%。说明接种根瘤菌能够显著降低干旱胁迫对花榈木幼苗叶片质膜相对透性的影响,但接种不同菌株的幼苗的抗胁迫伤害能力不同,接种10号、9号菌株更有利于保护叶片质膜相对透性,提高花榈木幼苗的抗旱能力。
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由图 2、3可以看出:接种根瘤菌的花榈木幼苗在受到中度干旱胁迫时,叶片内可溶性糖含量和脯氨酸含量均高于CK,接菌处理平均可溶性糖含量比CK高135.3%,平均脯氨酸含量比CK高199.8%,方差分析表明,各处理间的可溶性糖和脯氨酸含量均差异显著(P<0.05)。接种9号菌株的花榈木可溶性糖含量最高,接种11号菌株花榈木次之,多重比较显示2个处理间差异不显著(P>0.05),都在0.8%以上,分别是对照的4.0、3.9倍。接种22号菌株的可溶性糖含量最低,仅为CK的1.3倍。接种9号菌株的花榈木脯氨酸含量最高,接种10号菌株次之,分别是CK的5.9、5.2倍。接种9号、11号菌株对幼苗可溶性糖的积累效果较好,接种9号、10号菌株有利于幼苗脯氨酸的积累。
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中度干旱胁迫下不同接种处理花榈木幼苗丙二醛(MDA)含量差异显著(P<0.05)(图 4),且显著低于CK。CK的MDA含量比所有接种处理的平均值高127.1%。MDA含量较低的前3个菌株号为5号、3号、9号,分别比CK降低78.0%、75.8%、74.3%。表明5号、3号、9号菌株能更有效抑制幼苗的膜脂过氧化,降低其产物对幼苗的毒害。
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所有处理中SOD活性CK最低(图 5),与其他接种处理差异显著(P<0.05)。接种不菌株的幼苗,在受到中度干旱胁迫时,SOD活性不同,接种5号菌株的花榈木SOD活性最高,比CK提高340.6%,接种16号菌株次之,与5号菌株差异不显著(P>0.05),比CK提高337.1%,说明接种根瘤菌的幼苗清除体内超氧离子基团以及自由基的能力提高,从而使植株耐受干旱的能力增强,接种5号、16号菌株最有利于抵御干旱对幼苗的伤害。
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在中度干旱胁迫下,CK净光合速率最低(表 2),而接种根瘤菌的花榈木净光合速率、蒸腾速率、水分利用效率均显著高于CK,接种不同的根瘤菌株间差异显著(P<0.05)。接种9号菌株幼苗的净光合速率最高,是CK的11.6倍,10号菌株次之,是CK的9.8倍,表明9号、10号菌株更有利于花榈木保持较高抗旱能力。
处理
Treatment净光合速率
Photosynthetic rate
/(μmol·m-2·s-1)蒸腾速率
Transpiration rate
/(mmol·m-2·s-1)水分利用效率
Water use efficiency
/(μmol·mmol-1)1 1.58±0.13gh 0.42±0.01h 3.76±0.21ghi 2 1.87±0.12ef 0.46±0.01g 4.06±0.21fgh 3 1.42±0.19hi 0.21±0.00n 6.66±0.30b 4 1.07±0.24j 0.17±0.01p 6.29±0.68a 5 2.13±0.06d 0.40±0.00i 5.32±0.16c 6 2.33±0.22c 0.60±0.02b 3.88±0.45hij 7 1.43±0.11hi 0.47±0.00g 3.04±0.26jk 8 1.62±0.06g 0.41±0.00i 3.95±0.14gh 9 3.14±0.31a 0.51±0.01e 6.16±0.10b 10 2.65±0.24b 0.63±0.01a 4.21±0.35efg 11 2.42±0.10c 0.53±0.00d 4.57±0.17def 12 2.14±0.05d 0.42±0.00h 5.10±0.08cd 13 2.35±0.15c 0.37±0.01j 6.35±0.28b 14 1.43±0.21hi 0.20±0.01o 7.15±0.15a 15 1.72±0.10fg 0.36±0.01k 4.78±0.19cde 16 2.39±0.12c 0.56±0.01c 4.28±0.15efg 17 1.29±0.05i 0.25±0.01m 5.16±0.30c 18 1.94±0.14e 0.49±0.01f 3.96±0.35gh 19 0.62±0.08lm 0.19±0.01o 3.26±0.36ij 20 0.83±0.06k 0.16±0.01p 5.19±0.13c 21 0.50±0.07m 0.17±0.01p 2.94±0.14jk 22 0.56±0.10m 0.24±0.01m 2.33±0.22lm 23 0.75±0.07kl 0.29±0.00l 2.59±0.23kl CK 0.27±0.12n 0.14±0.01q 1.92±0.56m 注:表中数据为“均值±标准差”,同列数据后标不同字母表示差异达显著水平(P < 0.05)。下表同。
Nate:Data in the table represent average value± standard error.Different letters indicate significant difference(P < 0.05).The same below.Table 2. The photosynthetic rate, transpiration rate and water use efficiency of Ormosia henryi seedlings inoculated with different rhizobium strains under moderate drought stress
表 2显示:接种处理的花榈木幼苗蒸腾速率均高于CK,说明接种处理后,花榈木的蒸腾作用对干旱胁迫的敏感性降低。接种14号菌株的花榈木幼苗水分利用效率最高,为CK的4.2倍,4号和3号菌株次之,分别为CK的4.0倍和3.5倍,22号菌株最低,为CK的1.2倍。14号、4号、3号、13号和9号菌株有利于花榈木幼苗水分利用效率的提高。
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由表 3可知:受到中度干旱胁迫时,CK的Fv/Fm、Fv/F0、Y(Ⅱ)、QP值显著(P<0.05)低于其他接种幼苗,接种4号菌株幼苗的Fv/Fm、Fv/F0、Y(Ⅱ)值最大,分别是对照的1.8、3.0、1.6倍。接种10号菌株幼苗的QP值最大,接种11号菌株幼苗的次之,二者间差异不显著(P>0.05),但与其它处理差异显著(P<0.05)。NPQ则表现为CK的最大,接种7号菌株幼苗的最小,仅为CK的5.81%。说明接种根瘤菌能促进花榈木在受到中度干旱胁迫时,提高实际原初光能捕获效率,并使PSⅡ反应中心保持相对较高的开放程度,从而提高光合能力。
处理
Treatment最大光化学量子产量
Fv/FmPSⅡ潜在活性
Fv/F0实际光合量子产量
Y (Ⅱ)光化学淬灭
QP非光化学淬灭
NPQ1 0.427±0.017d 0.745±0.028g 0.333±0.000d 0.724±0.031h 0.078±0.002n 2 0.450±0.018d 0.818±0.015e 0.297±0.000g 0.846±0.034de 0.103±0.004j 3 0.466±0.031c 0.872±0.015d 0.327±0.005de 0.720±0.027h 0.103±0.002j 4 0.569±0.005a 1.321±0.050a 0.368±0.003a 0.955±0.015b 0.113±0.000g 5 0.434±0.005d 0.767±0.023f 0.355±0.008b 0.714±0.010h 0.060±0.000o 6 0.435±0.020d 0.770±0.061f 0.300±0.002g 0.652±0.022i 0.107±0.002i 7 0.449±0.028d 0.815±0.031e 0.316±0.006f 0.818±0.030ef 0.016±0.000s 8 0.435±0.025d 0.771±0.033f 0.321±0.007e 0.917±0.037c 0.038±0.000q 9 0.435±0.011d 0.771±0.014f 0.345±0.005c 0.909±0.058c 0.055±0.000q 10 0.500±0.016b 1.000±0.100b 0.355±0.005b 1.063±0.150a 0.057±0.000p 11 0.493±0.030b 0.972±0.066c 0.344±0.006c 1.000±0.086a 0.098±0.000k 12 0.421±0.020e 0.727±0.022h 0.302±0.008g 0.762±0.029g 0.075±0.001n 13 0.450±0.024d 0.818±0.030e 0.309±0.004f 0.810±0.028f 0.036±0.000r 14 0.403±0.018gh 0.675±0.015l 0.321±0.004ef 0.789±0.042fg 0.088±0.001m 15 0.417±0.016ef 0.715±0.022i 0.321±0.004e 0.810±0.052f 0.091±0.000l 16 0.419±0.022e 0.722±0.025h 0.339±0.009c 0.864±0.066d 0.056±0.000p 17 0.415±0.011efg 0.710±0.020i 0.309±0.006f 0.708±0.016h 0.132±0.000g 18 0.406±0.016fgh 0.684±0.018k 0.275±0.002h 0.704±0.025h 0.107±0.002i 19 0.386±0.009i 0.629±0.012o 0.260±0.001j 0.667±0.015i 0.140±0.000f 20 0.391±0.010i 0.642±0.041n 0.259±0.000j 0.619±0.032j 0.176±0.003e 21 0.409±0.018efgh 0.692±0.031j 0.236±0.003k 0.650±0.028ij 0.200±0.004d 22 0.397±0.021hi 0.541±0.020p 0.268±0.002i 0.654±0.058i 0.240±0.005b 23 0.351±0.017j 0.658±0.054m 0.258±0.002j 0.571±0.040k 0.210±0.005c CK 0.309±0.006k 0.447±0.015q 0.235±0.000k 0.538±0.032l 0.275±0.000a Table 3. The chlorophyll fluorescence parameters of Ormosia henryi seedlings inoculated with different rhizobium strains under moderate drought stress
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对不同菌株幼苗的抗旱性综合评价结果(表 4)显示:接种10号、11号、9号、16号、7号、13号菌株花榈木抗旱隶属平均值为0.620.81,幼苗抗旱能力强,表明这些根瘤菌菌株有利于提高花榈木幼苗抗旱性。抗旱性差的为接种1723号菌株处理。
处理
Treatment相对电导率
Relative
conductivity可溶性糖含量
Soluble sugar
contentSOD
总活性
SOD
activity脯氨酸
含量
Proline
content净光合速率
Photosy-
nthetic
rate水分利用
效率
Water use
efficiency最大光化
学量子
产量
Fv/ FmPSⅡ潜
在活性
FV/F0实际光合Ⅱ量子产量ⅡY(Ⅱ) 光化学Ⅱ淬灭ⅡQP 非光化Ⅱ学淬灭ⅡNPQ 平均值Ⅱaverage 排序ⅡOrder 10 1.00 0.84 0.92 0.87 0.83 0.30 0.74 0.63 0.90 1.00 0.84 0.81 1 11 0.86 0.96 0.87 0.72 0.75 0.78 0.71 0.60 0.82 0.88 0.68 0.79 2 9 0.95 1.00 0.97 1.00 1.00 0.35 0.49 0.37 0.83 0.71 0.85 0.77 3 16 0.69 0.75 0.99 0.73 0.74 0.95 0.42 0.31 0.78 0.62 0.85 0.71 4 7 0.86 0.86 0.56 0.45 0.40 0.73 0.54 0.42 0.61 0.53 1.00 0.63 5 13 0.85 0.75 0.47 0.55 0.73 0.55 0.54 0.43 0.56 0.52 0.92 0.62 6 4 0.81 0.24 0.36 0.15 0.28 0.28 1.00 1.00 1.00 0.79 0.63 0.59 7 5 0.79 0.34 1.00 0.62 0.65 0.20 0.48 0.37 0.90 0.34 0.83 0.59 8 1 0.73 0.26 0.63 0.61 0.46 1.00 0.45 0.34 0.74 0.35 0.76 0.58 9 8 0.74 0.24 0.74 0.39 0.47 0.44 0.49 0.37 0.65 0.72 0.92 0.56 10 12 0.84 0.66 0.85 0.38 0.65 0.32 0.43 0.32 0.50 0.43 0.77 0.56 11 15 0.73 0.53 0.60 0.27 0.51 0.75 0.42 0.31 0.65 0.52 0.71 0.54 12 3 0.75 0.33 0.54 0.31 0.40 0.53 0.60 0.49 0.69 0.35 0.66 0.51 13 14 0.85 0.52 0.64 0.27 0.40 0.38 0.36 0.26 0.65 0.48 0.72 0.50 14 2 0.80 0.12 0.20 0.52 0.56 0.47 0.54 0.43 0.47 0.59 0.66 0.49 15 6 0.82 0.22 0.67 0.19 0.72 0.39 0.49 0.37 0.49 0.22 0.65 0.47 16 17 0.45 0.27 0.86 0.26 0.36 0.56 0.41 0.30 0.56 0.32 0.55 0.45 17 18 0.52 0.36 0.52 0.04 0.58 0.33 0.37 0.27 0.30 0.32 0.65 0.39 18 19 0.52 0.25 0.48 0.28 0.12 0.22 0.30 0.21 0.19 0.25 0.52 0.30 19 20 0.56 0.12 0.19 0.24 0.20 0.55 0.32 0.22 0.18 0.15 0.38 0.28 20 23 0.62 0.26 0.35 0.24 0.17 0.20 0.16 0.24 0.17 0.06 0.25 0.25 21 21 0.57 0.35 0.07 0.11 0.08 0.07 0.39 0.28 0.01 0.21 0.29 0.22 22 22 0.40 0.10 0.05 0.28 0.10 0.11 0.34 0.11 0.25 0.22 0.14 0.19 23 CK 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 24 Table 4. Comprehensive drought resistance screening of 23 test strains