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生物蜡酯普遍存在于自然界生物中，蜡酯对生物生命活动具有储能、保护等诸多功能，在生物生命活动中扮演的角色极为重要[1-3]。昆虫和植物体表的蜡酯层能对抗有害细菌及真菌入侵，同时还能减少体表水分蒸发、疏水御潮、防止紫外辐射、反射阳光辐射、躲避天敌袭击[4-7]。有些昆虫则特化了泌蜡的性状，比如介壳虫，这一类昆虫体表覆盖大量蜡泌物形成的介壳[8]，由于蜡酯的保护，常规方法很难达到防治效果，喷洒、涂抹等机械方法和化学治理方法也较为困难不容易操作，且污染环境、耗资大、大量杀伤天敌，介壳虫已成为农林果树危害严重的害虫。如果对蜡酯进行破坏，则易达到介壳虫防治的效果。
不同物种的蜡酯合酶(wax synthase, WS)研究显示，在生物蜡酯合成过程中WS具有关键作用[9-12]。笔者以我国历史悠久的特产资源昆虫—白蜡虫(一种介壳虫)为研究对象，鉴定出白蜡虫WS，实验表明WS在白蜡虫泌蜡中发挥极其重要的作用[13]。近年来，昆虫中对未知基因功能及作用机理研究主要是利用dsRNA诱导的RNAi实现[14]，由此本研究欲探索较低成本获取dsRNA，以期建立一种通过原核菌体表达获取大量白蜡虫ws基因dsRNA的方法，从而为介壳虫防治提供一定参考。
用于昆虫实验研究的dsRNA合成方法，主要是试剂盒体外转录以及原核菌体表达获得，其中，dsRNA合成试剂盒价格较高，合成dsRNA的量较少。因此，本研究将选取前期筛选的白蜡虫ws基因片段，采用原核菌体表达合成dsRNA的方法，利用原核表达系统制备dsRNA，以期较低成本获取大量dsRNA。
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本实验所用白蜡虫雄虫采自中国林业科学研究院资源昆虫研究所，载体L4440及菌株HT115均为新疆大学马纪教授赠送，Escherichia coli JM109感受态细胞、Competent Cell Preparation Kit、琼脂糖凝胶电泳Marker及Loading Buffer购自大连宝生物工程有限公司；Q5® High-Fidelity DNA Polymerase、XbaⅠ及Hind Ⅲ限制性核酸内切酶购自美国NEB；M-MLV cDNA合成试剂盒、RNaseOUTTM核酸酶抑制剂、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、RNase A、DNase I、Trizol均购自Thermo Fisher Scientific，InvitrogenTM(美国)；焦碳酸二乙酯(Diethy pyrocarbonate, DEPC)、Luria-Bertani(LB)固体和液体培养基、氨苄青霉素(Ampicillin, AMP)、四环素(Tetracyclines, TET)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-α-D-galactopyranoside, X-gal)、溶菌酶、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside, IPTG)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；琼脂糖粉购自法国Biowest；pGEM®T-Easy Vector System、T4 DNA连接酶购自美国Promega；无水乙醇、氯仿、异丙醇、甘油购自北京国药集团化学试剂有限公司。
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取适量白蜡虫雄虫于已灭菌离心管中，加入Trizol匀浆，提取白蜡虫雄虫总RNA。用M-MLV cDNA合成试剂盒反转录得到单链cDNA。利用软件Primer 5.0设计引物，在上游引物的5’端和下游引物3’端分别加上Hind Ⅲ、XbaⅠ酶切位点。
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以反转录获得的cDNA为模板，通过PCR扩增白蜡虫ws基因片段，利用未加酶切位点的引物组合进行扩增，反应体系分别为10 μL: 5×Q5 Reaction Buffer 2 μL、10 mmol·L-1 dNTPs 0.2 μL、Q5超保真DNA聚合酶0.1 μL、模板0.2 μL、上下游引物各0.5 μL、ddH2O补足至10 μL。扩增程序：98℃预变性30 s；98℃变性8 s，58℃退火20 s，72℃延伸15 s，30个循环；72℃延伸2 min。
获得的PCR产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测鉴定，同时利用超微量分光光度计(Thermo, 美国)初步测定其浓度。检测正确的PCR产物经稀释作为模版，用带酶切位点的引物进行PCR扩增，并对目的片段进行胶回收及纯化，与质粒pGEM®T-Easy Vector连接，重组质粒命名为pGEM/EpelWS。重组质粒转化JM109感受态细胞，涂布于LB筛选平板(含有100 μg·mL-1氨苄青霉素、20 mg·mL-1 X-gal及24 mg·mL-1 IPTG)。
37℃恒温培养12 h，挑取白色单菌落，培养后进行菌液PCR检测，同时提取重组质粒，将鉴定的阳性单克隆菌液送至昆明硕擎生物科技有限公司测序。
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测序正确的pGEM/EpelWS重组质粒和L4440载体分别提取质粒，同时利用XbaⅠ和Hind Ⅲ 37℃过夜双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测并回收目的片段和L4440载体，二者经T4连接酶(Promega, 美国)4℃过夜连接，重组质粒转入JM109感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素及四环素的LB固体培养基。37℃过夜培养，挑取白色单菌落，进行菌液PCR检测，将阳性重组质粒测序验证，重组质粒命名为L4440/EpelWS。
利用Competent Cell Preparation Kit制备试剂盒，按照说明书操作制备HT115感受态细胞。将L4440/EpelWS重组质粒转入HT115感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素和四环素抗性的LB固体培养基。37℃过夜培养并挑取阳性单克隆，进行菌液PCR检测和双酶切检测。
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将上述含有L4440/EpelWS的HT115菌液于37℃条件下100 mL培养基中扩大培养OD600=0.4左右，加入IPTG使其终浓度为0.7 mmol·L-1，继续培养过夜诱导表达dsRNA。将菌液离心收集菌体，用浓度为500 mg·mL-1的溶菌酶常温裂解菌体5 min，Trizol法提取dsRNA，用灭菌的DEPC处理水溶解dsRNA，并从溶解液中取出少量，利用超微量分光光度计测定其浓度，同时进行电泳检测。将获得的dsRNA进行DNase I和RNase A消化处理，除去其中的DNA和单链RNA，以获得较纯的dsRNA。
2.1. 白蜡虫总RNA提取和引物设计
2.2. 白蜡虫ws基因片段的克隆
2.3. 白蜡虫WS RNA干扰载体的构建
2.4. dsRNA的表达及纯化
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以反转录获得的cDNA为模板，通过PCR扩增白蜡虫ws基因片段约500 bp，扩增的目的片段与预期片段基本相符(图 1 A)。以此PCR扩增产物为模版，采用带XbaⅠ和Hind Ⅲ酶切位点的引物进行扩增，对所挑取的阳性重组单克隆pGEM/EpelWS菌液检测的结果也与预期片段基本相符(图 1 B)，其测序结果正确。
Figure 1. The cloning results of target fragment
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利用酶XbaⅠ和Hind Ⅲ同时对L4440质粒和pGEM/EpelWS重组质粒进行双酶切，L4440质粒双酶切的结果如图 2 A：第1个泳道是XbaⅠ和Hind Ⅲ双酶切之后的电泳结果，第2个泳道是L4440质粒电泳检测结果。pGEM/EpelWS重组质粒双酶切的结果如图 2 B，即pGEM/EpelWS重组质粒经Xba Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切之后的电泳结果。二者经T4连接酶连接、转化，以白色单克隆的菌液为模版，特异性引物PCR扩增验证结果如图 2 C，检测结果与预期片段大小基本相符，菌液测序结果也正确。
Figure 2. The construction of the interference vector
上述测序正确的L4440/EpelWS菌液，对其提取质粒并转入HT115感受态细胞，挑取单克隆摇菌，菌液利用特异性引物检测，结果见图 2 D，也与预期片段基本相符。
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经IPTG诱导后表达的dsRNA电泳图(图 3)表明：转化HT115感受态细胞并经IPTG诱导后的L4440/EpelWS菌液成功表达了相应的dsRNA，提取dsRNA的平均浓度为1 705 ng·mL-1，而未经IPTG诱导的L4440/EpelWS菌液未表达出相应dsRNA；没有转化HT115感受态细胞的L4440/EpelWS菌液，在IPTG诱导诱导前后均未表达出dsRNA。对已经诱导表达的dsRNA进行DNase I和RNase A消化处理的电泳结果如图 3 B所示。
Figure 3. Identification of dsRNA of ws gene produced in bacteria
3.1. 目的片段扩增及阳性单克隆筛选
3.2. 重组载体的构建
3.3. 原核诱导表达白蜡虫ws基因的dsRNA
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目前，昆虫RNAi普遍利用注射法和饲喂法[15]，在昆虫中利用RNAi沉默特定基因的方法已经成熟，如通过显微注射胚胎和注射若虫或成虫血腔导致基因沉默[16-18]，但是注射法对昆虫有一定损伤甚至致死现象，如对黄粉虫(Tenebrio molitor)和Dendroides canadensis注射dsRNA后，注射dsRNA引起的昆虫死亡率在一定时间内呈上升趋势，同时抗冻蛋白(Antifreeze protein, AFP)基因afp表达量也有明显增加[19-20]；饲喂法最先是对Rhodnius prolixus和Epiphyas postvittana进行，其结果发现RNAi效果明显可有效降低目的基因转录[21]，Bilgi等[22]对蚜虫探索有效的饲喂dsRNA也明显达到蚜虫RNAi效果；此外，针对不同形态类型昆虫体表涂抹dsRNA也不失为较好的昆虫RNAi方法[23]，但是这种方法需要较多的dsRNA。由于饲喂法的RNAi效果实现需用大量的dsRNA，因此，如何获取大量dsRNA是降低成本广泛应用该方法的必要条件。
由于原核菌体表达获得dsRNA成本低、获取量较高等优点，现已用于鞘翅目、直翅目等昆虫及多种生物的基因功能研究[24]。本研究采用原核菌体表达获得白蜡虫WS对应dsRNA，与试剂盒合成dsRNA相比，其优点在于仅需少量菌液，即可在短时间内诱导获取大量目的基因的dsRNA，同时其成本也大大降低。因L4440载体含有双向T7启动子和lac乳糖操纵子，大肠杆菌HT115为RNase Ⅲ缺陷型菌株，所以菌液诱导表达目的基因dsRNA不会被RNase Ⅲ酶切降解[25]，故L4440用于多种生物体外目的基因载体构建获取dsRNA，如黄粉虫抗冻蛋白基因afp原核表达dsRNA重组载体构建，获得黄粉幼虫抗冻蛋白基因的dsRNA，纯化后成功对黄粉幼虫进行RNAi[20]；甘蔗二点螟(Chilo infuscatellus Snellen)蜕皮调节转录因子CiHR3的RNAi载体构建，利用获得的dsRNA饲喂甘蔗二点螟幼虫，可有效抑制CiHR3的正常表达[26]；中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)EsSox21b-like基因利用原核表达制备dsRNA[27]。
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本研究利用原核表达系统通过细菌大量制备白蜡虫ws基因的dsRNA，dsRNA的平均获得量1 705 ng·mL-1，电泳检测显示拖尾现象不明显，dsRNA的质量较好，仅需50 mL的菌液就可获得85.25 μg·次-1，与试剂盒MEGAscriptTM RNAi Kit with Manual的50~100 μg·次-1获取量相当，可节省大量资金。后续将对研究对象白蜡虫进行RNAi操作，对白蜡虫WS功能展开深入研究，也为其他昆虫dsRNA合成提供参考和理论依据。
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