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自生固氮功能细菌是指在常温常压环境中可以将空气中的氮气转化为植物可以吸收的铵态氮的一类细菌，由其所执行的生物固氮过程是土壤中重要的生态过程，也是生态系统最初的氮素来源[1]。功能性细菌具有较高的研究价值，首先，固氮功能细菌分布广泛，从温带生态系统到热带雨林均有分布[2-3]；其次，自生固氮功能细菌不需要特定的寄主，在微生物肥料的研究中被大量应用[4-5]。在生产实践中，保障功能菌株发挥作用的重要前提是菌株的良好生长，且符合适地适菌原则，所以，研究功能菌株的生长特性具有重要意义。
本研究中，通过限氮培养基大量收集土壤中的自生固氮功能细菌，根据菌落形态特征进行基础筛选，并验证了菌种的nifH基因，共得到固氮功能细菌103株。本研究以103株菌株为研究对象，以培养基的pH值及培养温度为考量指标，研究自生固氮功能细菌的生长特性，并对各菌株进行16S rDNA测序，初步进行菌种鉴定。本研究的目的为：探讨应用各固氮功能菌株的适宜地域及季节，为固氮微肥的使用提供指导；根据功能细菌生长指标的跨度分析，筛选极端环境菌株；根据生长特性差异将自生固氮菌株进行分类，并研究生长特性与菌株系统发生位置的关系。
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采样地位于江西省大岗山东北侧的山下林场(27°30′~27°45′N，114°30′~114°45′E)，该地区属低山丘陵地貌，母岩以千枚岩为主，土壤为黄、红壤，地带性植被为常绿阔叶林。日最高气温39.9℃，最低气温-8.3℃，年均气温17.9℃；年降水量1 593.7 mm，集中在4—7月；无霜期268 d[6]。采样地土壤本底情况为，有机质含量25.36 g·kg-1，全氮含量1.27 g·kg-1，速效磷含量4.63 mg·kg-1，速效钾含量78.12 mg·kg-1。试验区林木为4年生杉木(Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook.)幼龄林，其平均树高4.35 m，胸径5.37 cm，冠幅2.6 m，郁闭度为0.3。
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采集试验区杉木林地中的土壤，通过限氮培养基筛选出固氮功能细菌。为了验证各细菌的固氮功能，所有培养过程均采用无氮培养基[7]。在菌株最适pH值研究中，每菌株生长的pH值梯度为：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，每处理3个重复，使用NaOH和HCl调节pH值，培养温度为28℃；在菌株最适温度的研究中，每菌株生长温度的梯度为：4、10、20、28、37、45、50、60℃、每处理3个重复，培养基的pH值为7。菌株nifH基因检测中使用的正向引物为nifH-1：5’AAGTGCGTGGAGTCCGGTGG 3’；反向引物为nifH-2：5’GTTCGGCAAGCATCTGCTCG 3’。PCR体系为：93℃ 3 min；93℃ 45 s，62℃ 32 s，72℃ 2 min，33循环；72℃ 7 min；4℃ ∞。使用CTAB法提取固氮功能细菌的DNA，通过细菌通用引物(27F和1492R)进行PCR扩增，扩增产物由华大基因使用Sanger测序法测序[8]。结果序列拼接后在NCBI序列库中比对，将功能菌株进行基础的鉴定与分类。
使用R语言(版本3.0.0)进行热图制作及聚类分析，使用spss进行标准差计算。
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采集试验区杉木林地中的土壤，通过限氮培养基筛选出具有固氮功能的细菌菌株220株。对筛选出的菌株进行初步的分离纯化，提取纯化菌株的DNA。对纯化菌株的DNA进行基因水平的检测-nifH基因检测，根据电泳条带共得到固氮功能菌株103株，其菌株编号分别为：1001、1002、1003、1004、1005、1006、1008、1009、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020、1021、2001、2002、2004、2006、2007、2010、2011、2012、2013、2014、2015、2016、2018、2019、2020、2021、2022、2023、2024、2025、2026、2027、2028、2029、2030、2031、2032、2033、2107、3-a、3-b、3-c、3-d、3-e、3-f、3-i、3-j、3-k、3-l、3-m、3-n、3-o、3-p、3-q、3-r、3-s、4001、4002、4003、4005、4006、4007、4008、4010、6001、6002、6003、6004、6005、6006、6007、6008、6009、6010、7001、7002、7004、7006、7008、7009、7010、7012、7014、7015、zk3-1、09ul27、09ul8、lk3-3fh2、lk3-1fh1、lk2-1c(2)、lk1-2a(1)、lk1-2f、lkhfh(图 1)。
Figure 1. nifH gene bands of Functional strains
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各菌株的生长特性(图 2)表明：28℃、pH=7为大部分菌株的最适生长条件；各菌株适宜的生长区温度为20、28、37℃；大量菌株生长的适宜pH值为5~7。研究还发现：部分菌株可以在高温(45、50℃)或低温(10℃)条件下生长良好，也有部分菌株可以在极碱性环境(pH=11和12)或酸性环境(pH=3)下生长。
Figure 2. The heatmap of each bacterial growth in pH=7 different temperatures and T=28℃ different pH values
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由图 2可知：在4℃培养时，菌株生长均极其缓慢，培养后OD600值均小于0.05；10℃培养后，OD600值大于0.1的菌株有20株，而生长良好、OD600＞0.2的菌株有7株(表 1)。在60℃培养后，能生长的菌株有11株，OD600＞0.1的有7株(表 1)。在pH=3的极酸性培养基中，OD600＞0.1的菌株有26株，而生长良好、OD600＞0.2的菌株有11株；在pH=12的极碱性培养基中，OD600＞0.2的菌株有26株(表 2)。由表 1、2可知：在低温、碱性土中适用的菌株为6003，在高温、碱性土中适用的菌株有09ul27、1010、2024、2029、7002、lk2-1c(2)和zk3-1，在酸性及碱性土中均适宜生长的菌株为1012和2025。
菌株编号Number 10℃ 1008 0.335±0.060 3-n 0.621±0.056 3-s 0.439±0.011 4007 0.518±0.058 6003 0.523±0.095 7015 0.262±0.021 lk1-2f 0.480±0.047 09ul27 0.188±0.013 1010 0.173±0.021 2024 0.105±0.014 2029 0.157±0.002 7002 0.113±0.011 lk2-1c(2) 0.101±0.016 zk3-1 0.106±0.005 Table 1. The growth of special bacteria in pH=7 and extreme culture temperature(OD600值)
菌株编号
NumberpH=3 pH=12 菌株编号
NumberpH=12 1002 0.208±0.025 - 6003 0.414±0.012 1012 0.361±0.012 0.219±0.009 09ul8 0.587±0.020 2004 0.299±0.001 - 1014 0.385±0.005 2010 0.442±0.017 - 1017 0.567±0.081 2025 0.247±0.015 0.275±0.090 1021 0.201±0.028 2026 0.267±0.015 - 2002 0.320±0.019 4003 0.307±0.024 - 2030 0.443±0.005 4008 0.274±0.009 - 2107 0.380±0.020 6004 0.256±0.050 - 3-m 0.246±0.014 6005 0.204±0.006 - 3-p 0.385±0.017 7004 0.236±0.033 - 6001 0.288±0.009 09ul27 - 0.268±0.015 6006 0.502±0.010 1010 - 0.379±0.003 6007 0.233±0.003 2024 - 0.384±0.014 6010 0.307±0.051 2029 - 0.214±0.012 7001 0.208±0.007 7002 - 0.209±0.008 7009 0.499±0.011 lk2-1c(2) - 0.297±0.011 lk3-3fh2 0.281±0.010 zk3-1 - 0.327±0.010 Table 2. The growth of special bacteria in T=28℃ and extreme culture pH values(OD600值)
提取上述菌株的DNA，扩增后进行测序分析。通过与NCBI数据库中序列的blast比对，得出09ul27、1010、2024、7002四株菌株的序列相似性大于99%，极可能为Bacillus subtilis Cohn 1872的不同菌株。与6003、2029、lk2-1c(2)、zk3-1、1012、2025相似性最高的菌株分别为：Burkholderia xenovorans Goris et al. 2004、Chitinophaga pinensis V. Sangkhobol & V. Skerman 1981、Bacillus cereus Frankland & Frankland 1887、Bacillus megaterium Dde Bary 1884、Burkholderia phymatum Vandamme et al. 2003、Burkholderia bannensis Aizawa et al. 2011。
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根据菌群不同生长特性, 对所有菌株进行非层次聚类, 使用SSI算法得出最优分类为9类(图 3)。通过K-means及K中心点算法(PAM)2种算法的轮廓宽度检验、验证最优K值(图 4), 其中, K-means的平均轮廓宽度为0.15，而PAM算法的平均宽度值为0.1，所以，最终确定最优分类方法为K-means算法，最佳聚类数量为9类。第一类为：09ul8、1016、2028、2029、3-f、4010、6006、7008；第二类为：09ul27、1001、1011、2024、6001、7010、7012、7015、lk1-2a(1)、lk1-2f、lk2-1c(2)、lk3-3fh2、lkhfh、zk3-1、lk3-1fh1；第三类为：1009、1013、1019、1020、2004、2013、2014、2016、2023、3-q、4002、4008、6005、6008；第四类为：1012、1014、1017、1018、2010、2018、2019、2030、2032、2033、3-r、4006、6002；第五类为：1004、2006、2007、2015、2022、2027、3-a、3-b、3-e、3-i、3-j、3-m、3-s、6010；第六类：1003、1008、1015、2012、2021、3-c、3-d、3-k、3-o、4001、4003、6004、7014；第七类：2025、7009；第八类：1002、1005、1006、1010、1021、2001、2002、2026、2031、2107、3-l、3-n、4005、6007、6009、7001、7002、7004、7006；第九类：2011、2020、3-p、4007、6003。
Figure 3. Group number of K-means non hierarchical clustering
Figure 4. The better K value test
将各菌株进行16S rDNA测序，检测结果表明：与检测菌株相似性高于97%的菌种有27种, 分别属于Burkholderia Yabuuchi et al. 1992、Bacillus Cohn 1872、Paenibacillus Ash et al. 1994、Escherichia Castellani & Chalmers 1919、Agroboeterium Conn 1942、Pantoea Gavini et al. 1989、Arthrobacter Conn & Dimmick 1947、Chitinophaga V. Sangkhobol & V. Skerman 1981、Rhizobium Frank 1889、Novosphingobium Balkwill et al. 1997、Sphingomonas Yabuuchi 1990、Pseudomonas Migula 1894属，其中，根据生长条件分类的菌株中，第五类和第七类全部属于Burkholderia属，第二类基本为Bacillus属，其它类别中各菌属没有出现明显的聚类现象，且生长条件分类与菌种的初步鉴定分类没有明显的相关性(表 3)。
生长条件分类
Classification of growth conditions该组别初鉴定菌株的属名
The name of preliminary identification strains in genus level1 Burkholderia、Bacillus、Paenibacillus、Chitinophaga 2 Bacillus、Paenibacillus 3 Burkholderia、Bacillus、Arthrobacter、Pseudomonas 4 Burkholderia、Bacillus、Arthrobacter、Chitinophaga 5 Burkholderia 6 Burkholderia、Bacillus、Paenibacillus、Pantoea、Arthrobacter 7 Burkholderia 8 Burkholderia、Bacillus、Escherichia、Agroboeterium、Rhizobium 9 Burkholderia、Bacillus、Sphingomonas Table 3. Preliminary identification of different strains in genus level
3.1. 固氮功能菌株的分离与nifH基因检测
3.2. 固氮功能菌株的最适生长条件
3.3. 特殊环境下生长良好的固氮功能细菌
3.4. 菌群的生长特性分类
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本研究中，试验区杉木林地的固氮功能菌株最适宜的生长条件为：温度28℃、pH=7。较为适宜生长区的温度为20、28、37℃，pH值为5~7。与前人研究相比，菌株适宜生长的温度区域基本一致，但本研究中大量菌株在pH值为4、5时仍生长良好。刘晓璐等[9]研究得出，烟草根际的固氮功能菌最适生长条件为30℃、pH=7.5；郑红丽等[10]认为，羊草根际的固氮细菌适宜生长的温度为25~35℃、pH值为78；杨艳红等[11]认为，多功能芽孢杆菌的最适温度为37℃，初始pH值为7.0。菌株酸性环境生长良好的原因可能为菌株是从江西省红壤区分离纯化，其土壤为酸性土，本底土壤的pH值为3.97~4.89。长期的酸性环境使当地筛选的菌株在酸性条件中生长良好。
筛选出适合在特殊环境生长的固氮功能细菌10株，且适用于高温、碱性土的菌株均属于芽孢杆菌属。这与前人的研究结果一致，李峰等[12]从盐碱地中分离出的芽孢杆菌耐碱性为pH=11；闫国宏等[13]分离的食品中枯草芽孢杆菌可以耐100℃左右的高温。其原因可能为芽孢杆菌属菌株在不良环境下可产生芽孢，而芽孢具有高含量的吡啶二羧酸，且含有厚且含水量低的多层结构，所以，其对热、化学剂和其他理化因素有较强的抵抗力[13-15]。土壤pH值是林木生长的重要指标，目前，很多极酸、极碱性土均只能种植一些特定植被，且改良的花费大，效果不理想，而该立地条件下较环保的微生物肥料也因菌种生长条件的限制使用较少[16-17]。本研究还筛选出了2株在pH值为3~12时均生长良好的菌株，pH值跨度广解决了微生物的生长限制，使其在各种本底土壤中发挥功能，并且由于其受pH值变化的影响不大，所以，在立地改良中仍可施用。
通过聚类分析得出，菌株的生长特性与其生物学特征不完全相关。分类的第二组及第五组表明，生长特性相似的菌株均为同一属，但其它类别中菌属类别与生长条件不存在相关性，即菌株的生长特性除与系统发生位置有关外，主要还是受其它因素的影响。其原因可能为同一菌株在不同环境胁迫下，基因调控及蛋白质的合成均会发生变化，从而导致菌株脂类的组成、菌株对营养物质的吸收、菌株胞外酶活性及代谢产物均表现出差异[18-19]。
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(1) 试验区杉木林地中固氮功能菌株最适宜的生长条件为，温度28℃、pH=7。
(2) 筛选出适合在特殊环境(低温碱性、高温碱性、pH大跨度)生长的固氮功能细菌10株，各菌株初步鉴定为Burkholderia xenovorans、Bacillus subtilis subsp.、Chitinophaga pinensis、Bacillus cereus、Bacillus megaterium、Burkholderia phymatum、Burkholderia bannensis。
(3) 通过生长条件聚类分析及所有菌株的16S rDNA鉴定比对得出，菌株的生长特性与系统发生位置有一定关联，但主要还是受其它因素的影响。
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