-
TALE(Three Amino Acid Loop Extension)蛋白因其在第一和第二螺旋结构中含有3个额外的氨基酸而得命,存在于所有的真核生物中,植物中TALE家族包含2个亚家族:KNOX(KNOTTED-like homeobox)和BELL(BELL-like homeobox)[1]。植物KNOX家族中首次被克隆得到的成员是玉米(Zea mays L.)中的Knotted1(KN1)基因,因其突变体叶片上产生结状物凸起而得名[2]。随着拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)、烟草(Nicotiana tabacum L.)、水稻(Oryza sativa L.)等植物中KN1同源基因被克隆,这类基因被归为KNOX家族。根据基因结构与表达模式方面的差异,KNOX基因家族被分为2个亚类:Ⅰ类KNOX和Ⅱ类KNOX[1]。
拟南芥中Ⅰ类KNOX包含4个成员,分别是:SHOOTMERISTEMLESS(STM)、BREVIPEDICELLUS(BP)、KNOTTED-like from Arabidopsis thaliana 2(KNAT2)以及KNAT6[3]。Ⅰ类KNOX主要参与顶端分生组织(SAM)建成与功能维持过程,同时也参与调控侧生器官的形态发生[4]。STM主要在SAM中表达,其主要通过调控赤霉素与细胞分裂素的合成和降解途径,维持SAM中高细胞分裂素浓度和较低赤霉素含量,从而维持SAM中持续分裂分化的能力,stm突变体表现为SAM缺失[5]。KNAT2主要参与心皮的形成,而与KNAT2结构极为相似的KNAT6则参与调控侧根的形态建成过程。另外,KNAT2与STM在胚胎分生组织功能维持及边界建立中存在功能上的冗余[6]。BP与STM共同参与SAM建成过程的调控,但BP除了影响SAM建成外还调控花序轴的形态建成,bp突变体中花梗与花序轴之间的夹角显著大于野生型,而knat2knat6双突变能够使bp突变体花梗形态向野生型恢复,因此,在花序生长过程中,BP通过抑制KNAT2和KNAT6表达,从而保证花序轴上花梗正常的形态发生[7]。
拟南芥中Ⅱ类KNOX基因包括4个成员,分别是:KNOTTED-like from Arabidopsis thaliana 3(KNAT3)、KNAT4、KNAT5以及KNAT7,Ⅱ类KNOX基因表达模式相对广泛,且功能多样[8]。KNAT3和KNAT4负调控侧根形成,KNAT7则与BELL家族的BLH6形成二聚体进而调控次生细胞壁形成[9]。拟南芥中已证明在过表达Ⅱ类KNOX基因后,Ⅱ类KNOX与BELL家族成员选择性结合形成二聚体,抑制SAM活性,同时影响叶片形态建成[10]。
综上所述,Ⅰ类KNOX在植物分生组织建成及功能维持中起关键作用,是植物分生组织启动和器官发生的重要调控因子。但目前杨树中仅完成了对拟南芥STM、BP同源基因ARBORKNOX1(ARK1)、ARBORKNOX2(ARK2)功能的初步研究,认为它们参与调控木本植物形成层的分化,而杨树中Ⅰ类KNOX其他成员的功能尚不清楚[11-12]。本文对拟南芥与杨树中Ⅰ类KNOX成员的蛋白结构、进化关系等进行比较分析,同时利用RT-PCR方法分析杨树Ⅰ类KNOX基因在不定芽、不定根形成过程中的表达,探讨杨树Ⅰ类KNOX在分生组织建成及器官分化过程中的作用,为杨树Ⅰ类KNOX基因的功能解析提供参考。
HTML
-
本实验所用实验材料均取自84K。
-
选取处于相同生长状态的84K组培苗的第3片展开叶,将叶片主叶脉切断,置于分化培养基,诱导不定芽的发生。分别在0、2、4、6、8、10、14、16、18、20 d截取叶片伤口部位及后期诱导产生的不定芽。取材时间固定在11:00 am,所取材料均置于液氮中保存。
-
转接相同生长状态的84K组培苗于生根培养基中,分别在0、2、3、4、5、6、7、8、15、17 d截取茎段伤口部位及后期诱导产生的不定根。取材时间固定在11:00 am,取材后将样品置于液氮中保存。
-
将3年生84K剥皮,剥皮后在树皮上轻轻划取薄薄的一层松软组织,主要包含了形成层组织及未成熟木质部,并迅速将其置于液氮中保存。
-
以拟南芥Ⅰ类KNOX基因STM的蛋白序列在毛果杨基因组(POPGENIE, http://popgenie.org)中进行BLAST分析,获取杨树Ⅰ类KNOX基因的核酸及氨基酸序列;通过Clustalw2.0软件对拟南芥和杨树的Ⅰ类KNOX基因的氨基酸序列进行比对分析。利用Mega6.0软件采用基于遗传距离的邻近法构建拟南芥和杨树的Ⅰ类KNOX基因的系统进化树。根据拟南芥和杨树的Ⅰ类KNOX基因序列信息,通过GSDS2.0(http://gsds1.cbi.pku.edu.cn/)在线分析杨树Ⅰ类KNOX基因的内含子与外显子结构,并绘制基因结构图。
-
不定芽与不定根形成过程中不同时期的RNA提取与第一链cDNA合成分别采用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)与PrimeScriptTM RT Reagent Kit(TaKaRa)完成,具体方法参见试剂盒使用说明。qRT-PCR采用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ Kit(TaKaRa)在Roche LightCycle 480 Ⅱ仪器上完成。杨树Ⅰ类KNOX基因定量引物(表 1)使用在线引物设计软件Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm)设计得到。
引物名称
Primer Name引物序列
Primer SequenceARK1-rtF ATTGGTGGAGCAGGCATTAC ARK1-rtR CATCCATCACCACAAACTGC ARK2-rtF TGGACTGCCAAAAGGTAGGA ARK2-rtR GTCTTGTAAGCTCCTCACGGTA PtSTMb-rtF TTCTGCTCATCAGCATCACC PtSTMb-rtR CCAGTCGCAGTGACAGTGTT PtKNAT2/6a-rtF CGCAGATTGCACGTTTCTTA PtKNAT2/6a-rtR AGGCCTTTCAAGATCGGATT PtKNAT2/6b-rtF CCTACTTGGATGGTGGGATG PtKNAT2/6b-rtR CAGCAAATTGCAGGTTCTCA PtKNAT2/6c-rtF AACGAGGATCGAGAGCTGAA PtKNAT2/6c-rtR ATCAGCTTCCGTTGGGTATG PtKNAT2/6d-rtF GCTTCAATGGTGGTGGAGTT PtKNAT2/6d-rtR ATCGTTCTCTTCCCGGATTT PtKNLPa-rtF GTGCACCTCCAGAAATGGTT PtKNLPa-rtR CGTCAAACGGCTTGGATAAT PtKNLPb-rtF CTTGAAGCCATAGGCAGAGG PtKNLPb-rtR TCAAGAACGTAGCAGCCTCA PtKNLPc-rtF GGGAGGTTGAAGCATCTGAA PtKNLPc-rtR TCGCTTTCTCCTCTTCCGTA PtACTIN-rtF AAACTGTAATGGTCCTCCCTCCG PtACTIN-rtR GCATCATCACAATCACTCTCCGA Table 1. Primers used for qRT-PCR analysis.
1.1. 材料
1.1.1. 不定芽取材
1.1.2. 不定根取材
1.1.3. 形成层取材
1.2. 方法
1.2.1. 杨树中Ⅰ类KNOX基因获取及结构分析
1.2.2. 杨树中Ⅰ类KNOX基因表达分析
-
以拟南芥STM蛋白序列在毛果杨基因组中进行同源序列比对,得到杨树10个Ⅰ类KNOX基因。利用Mega6.0软件构建了杨树和拟南芥Ⅰ类KNOX基因的系统进化树(图 1A),并根据系统进化树中两物种间相对应的基因关系,对杨树中Ⅰ类KNOX成员进行命名,其中,2个与AtSTM同源的基因,分别命名为PtSTMa与PtSTMb,PtSTMa即为之前报道的杨树ARK1基因[11];与AtBP同源的基因仅1个,命名为PtBP,PtBP与之前报道的杨树ARK2基因为同一基因[12];与AtKNAT2和AtKNAT6同源的基因有4个,分别命名为PtKNAT2/6a、PtKNAT2/6b、PtKNAT2/6c和PtKNAT2/6d;另外,还有3个基因没有与拟南芥相对应的同源基因,将其顺次命名为KNOTTED-like from Populus a(PtKNLPa)、PtKNLPb与PtKNLPc。同时参考基因结构图(图 1B),将杨树中Ⅰ类KNOX分为3组:组1、组2、组3。组1为KNAT2和KNAT6类基因,组2为STM和BP类基因,组3为杨树所特有的Ⅰ类KNOX基因。
杨树中多数Ⅰ类KNOX基因长度在3 kb以上,均长于拟南芥中Ⅰ类KNOX基因。组1成员中,PtKNAT2/6a包含6个外显子,比同组中的其它基因多1个外显子。组2基因中,ARK1和PtSTMb含3个内含子,而同组中的其他基因均含有4个内含子(图 1B,表 2)。这些基因内含子、外显子结构的变化表明了在杨树Ⅰ类KNOX进化过程中发生了外显子获得与内含子丢失事件。
基因名称
Gene name基因号
Locus染色体上位置
Genomic position亚细胞定位预测
POSRT prediction氨基酸数
Protein length内含子数
intronsARK1 Potri.011G011100.1 Chr11:844486-848858- N: 14 373 3 ARK2 Potri.002G113300.1 Chr02:8461980-8468320 + N: 14 368 4 PtSTMb Potri.004G004700.1 Chr04:304576-308944 + N: 14 369 3 PtKNAT2/6a Potri.008G188700.1 Chr08:13039428-13047773 - N: 12, C: 1 341 5 PtKNAT2/6b Potri.010G043500.1 Chr10:7430322-7440628 + N: 10, C: 2 309 4 PtKNAT2/6c Potri.012G087100.1 Chr12:11401140-11409183 - N: 14 340 4 PtKNAT2/6d Potri.015G079100.1 Chr15:10400171-10408171 + N: 14 347 4 PtKNLPa Potri.013G008600.1 Chr13:557144-561807 + N: 12, M: 1 320 4 PtKNLPb Potri.005G014200.1 Chr05:1100485-1105673 + N: 14 317 4 PtKNLPc Potri.005G017200.1 Chr05:1390283-1394969 + N: 13 316 4 注:N:细胞核;C:细胞质;Ch:叶绿体;M:线粒体。
N: nucleus: C: cytoplasm; Ch: chloroplast; M: mitochondria.Table 2. Detailed information about Class Ⅰ KNOX genes from Populus
KNOX家族成员由MEINOX、ELK与homebox KN保守结构域组成,MEINOX结构域位于KNOX蛋白N端,由KNOX1和KNOX2两个亚结构域组成。通过多重序列比对及Ⅰ类KNOX蛋白质结构域分析(图 1B)发现,杨树与拟南芥中Ⅰ类KNOX蛋白结构相似,均含有以上4个结构域:KNOX1、KNOX2、ELK和homebox KN结构域,说明Ⅰ类KNOX进化历程中蛋白质结构相对保守。
-
不定芽与不定根的再生过程能够模拟SAM与RAM的发育过程,根据杨树不定芽与不定根再生过程中形态学观察(图 2),将此过程分三个阶段:分生组织形成阶段、芽(根)原基形成阶段、不定芽(根)形成阶段,其中,不定芽再生过程中06 d为分生组织形成阶段(图 2A),7~11 d为芽原基形成阶段(图 2B),12~20 d为不定芽形成阶段(图 2C);在不定根再生过程中04 d为分生组织形成阶段(图 2D),5~6 d为根原基形成阶段(图 2E),7~17 d为不定根形成阶段(图 2F)。
不定芽发生过程中,杨树Ⅰ类KNOX成员的表达量在不定芽形成的3个阶段中均表现出短暂的上调趋势,但上调时间与上调幅度存在差异,因此,将总的变化趋势分为以下3种(图 3):(1)芽原基形成时期表达量出现上调趋势,此类基因包括组1的PtKNAT2/6d、组2的ARK1和PtSTMb及组3的PtKNLPa和PtKNLPb(图 3A);(2)组1的PtKNAT2/6a表达量在芽原基分化产生不定芽的关键时期特异上调,而在不定芽发生过程的其他阶段表达量较低且无显著变化(图 3B);(3)不定芽发育前期表达量较低且变化不大,而在不定芽形成后表达量多次呈现上调的变化趋势,此类基因主要有组1的PtKNAT2/6b和PtKNAT2/6c、组2的ARK2与组3的PtKNLPc(图 3C)。
Figure 3. Expression alteration of Class Ⅰ KNOX members during the regeneration of adventitious shoot
在不定根的形成过程中,根据Ⅰ类KNOX基因表达分析,可总结为2种变化趋势(图 4):(1)表达量在根原基分化产生不定根的关键期出现短暂的上调,包括组1的PtKNAT2/6a、PtKNAT2/6b、PtKNAT2/6d和组3的PtKNLPb(图 4A);(2)表达量在分生组织与根原基形成阶段不断下调,而在不定根形成后期呈现上调的趋势,包括组1的PtKNAT2/6c、组2的ARK1、ARK2、PtSTMb和组3的PtKNLPa、PtKNLPc(图 4B)。
Figure 4. Expression alteration of Class Ⅰ KNOX members during the regeneration of adventitious root
为考察杨树Ⅰ类KNOX基因与形成层这一木本植物特有的分生组织之间的关系,对杨树Ⅰ类KNOX基因在形成层区域(形成层+未成熟木质部)中的表达量进行了检测,结果(图 5)显示:Ⅰ类KNOX的成员在形成层区域中均有一定的表达,其中,PtKNAT2/6b、ARK2及ARK1表达量明显高于其他成员,表明PtKNAT2/6b、ARK2及ARK1可能参与调控形成层活动或木质部分化过程。上述结果与ARK1、ARK2调控形成层细胞分化活性的结论相一致[11-12]。